CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing di Saccharomyces cerevisiae e la creazione di Yeast Pixel Art

Summary

Il sistema CRISPR/Cas12a in combinazione con un singolo array di crRNA consente un efficiente editing multiplex del genoma di S. cerevisiae a più loci contemporaneamente. Ciò è dimostrato dalla costruzione di ceppi di carotenoidi che producono ceppi di lievito che vengono successivamente utilizzati per creare arte pixel lievito.

Abstract

Alta efficienza, facilità d'uso e versatilità del sistema a ggecarle breve paleindromica a grappolo regolarmente interspaziato/proteina associata a CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ha facilitato la modificazione genetica avanzata di Saccharomyces cerevisiae,un modello nell'organismo e cavallo di battaglia nella biotecnologia industriale. In questo lavoro viene applicata una endonuclea (Cas12a), una endonucleano guidata dall'RNA con caratteristiche distinguibili da Cas9, che estende ulteriormente la cassetta degli attrezzi molecolare per scopi di modifica del genoma. Un vantaggio del sistema CRISPR/Cas12a è che può essere utilizzato nell'editing del genoma multiplex con RNA a guida multipla espressi da una singola unità trascrizionale (singola unità di RNA CRISPR (crRNA). Presentiamo un protocollo per l'integrazione multiplex di più geni eterologhi in loci indipendenti del genoma di S. cerevisiae utilizzando il sistema CRISPR/Cas12a con più crRNA espressi da un singolo costrutto di array crRNA. Il metodo proposto sfrutta la capacità di S. cerevisiae di eseguire la ricombinazione in vivo di frammenti di DNA per assemblare il singolo array di crRNA in un plasmide che può essere utilizzato per la selezione trasformativa, così come l'assemblaggio del DNA del donatore sequenze che si integrano nel genoma nelle posizioni previste. Cas12a è pre-espresso in modo stitutivo, facilitando la scissione del genoma di S. cerevisiae nelle posizioni previste dopo l'espressione del singolo array di crRNA. Il protocollo prevede la progettazione e la costruzione di un singolo array di crRNA e di cassette di espressione del DNA del donatore, e sfrutta un approccio di integrazione che utilizza sequenze uniche di connettori DNA di 50 bp e sequenze di DNA di fianco separate di integrazione, che semplificano progettazione sperimentale attraverso la standardizzazione e la modularizzazione ed estende la gamma di applicazioni. Infine, dimostriamo una tecnica semplice per la creazione di arte pixel lievito con un gestore di liquidi acustici utilizzando carotenoidi di colore diverso che producono ceppi di lievito che sono stati costruiti.

Introduction

Gli enzimi CRISPR/Cas hanno indubbiamente rivoluzionato la biologia molecolare e sono stati ampiamente adottati come strumenti per ingegnerizzare i genomi ad una velocità che prima era irrealizzabile¹. La prima modifica di un genoma di Saccharomyces cerevisiae dal sistema di editing del genoma CRISPR/Cas9 è stata riportata da DiCarlo et al. ², dimostrando il successo del gene knock-out e facendo mutazioni puntuali utilizzando oligonucleotidi introdotti esternamente. Ulteriori sviluppi della casella torcroma CRISPR includevano: regolazione trascrizionale mediante fusione di Cas9 (dCas9) morte catalitica con domini di effetti trascrizionali per consentire l'attivazione e il silenziamento della trascrizione³, applicazione per entrambi l'editing del genoma e le funzioni regolatorie per l'ingegneria del percorso metabolico mediante attivazione simultanea, repressione ed eliminazione^4,cancellazione di grandi frammenti dal genoma del S. cerevisiae ⁵e fusioni multicromosomiche⁶ .

I sistemi di editing del genoma CRISPR/Cas trovano la loro origine nei sistemi immunitari adattivi di batteri e archei e questi sistemi sono stati adattati dai biologi molecolari per l'editing del genoma. La loro funzionalità si basa sulle regioni del DNA CRISPRmic Pofomic Repeats (CRISPR) regolarmente interspaziate del Clustered Regularly Interspaced Short Repeats (CRISPR) che codificano l'RNA responsabile del riconoscimento del DNA o dell'RNA estraneo e dei geni associati CRISPR (Cas) che codificano l'RNA guidato endonucleasi^1,7,8,9. Sulla base della recente analisi genomica dei sistemi CRISPR/Cas è stato proposto di dividere i sistemi CRISPR/Cas in due classi, cinque tipi e 16 sottotipi^10. Le due classi si distinguono in base all'organizzazione di complessi efentità coinvolti nella scissione di destinazione. In genere, i sistemi CRISPR/Cas con un'organizzazione di più sottounità sono classificati come classe 1, mentre i complessi degli effetti delle singole sottounità appartengono alla classe 2^10,11. In questo articolo viene esplorato il tipo di classe 2 V Cas12a, precedentemente denominato Cpf1^10,12, che è un'alternativa alla classe 2 di tipo II Cas9. Anche se Cas9 è ben caratterizzato e ampiamente utilizzato nella ricerca, Cas12a offre funzionalità aggiuntive¹². In primo luogo, Cas12a forma un complesso con RNA CRISPR (crRNA) di 42-44 nucleotidi senza richiedere un RNA CRISPR (tracrRNA) ad attivare ulteriori. Pertanto, una guida più breve RNA può essere utilizzata nell'editing del genoma con sistemi CRISPR/Cas12a rispetto a CRISPR/Cas9. In secondo luogo, l'esclusiva attività endonucleanoed endoribonucleatolato di Cas12a consente la maturazione del suo pre-crRNA¹³. Questa attività di RNase consente la codifica di più crRNA su un singolo array di crRNA CRISPR, mentre Cas9 richiede l'espressione separata di ogni cosiddetto RNA a guida singola (sgRNA) o, in alternativa, ad esempio l'espressione di un'endonuclealeato ( ad esempio, Csy4) in combinazione con motivi di riconoscimento per Csy4 che circonda ogni sgRNA^14,15. In terzo luogo, il riconoscimento del sito di destinazione Cas12a richiede un motivo adiacente a protostrari (PAM) all'estremità 5' dal bersaglio e fessure dopo la posizione di 18 /23 dollari dal PAM con conseguente DNA fessurato con estremità appiccicose, mentre Cas9 richiede un PAM situato all'estremità del 3' bersaglio e fessure dopo la posizione -3 creando tagli di estremità smussati nel DNA¹². In quarto luogo, la sequenza nucleotide di consenso del PAM differisce tra Cas12a ((T)TTV) e Cas9 (NGG), il che rende Cas12a un promettente candidato per il targeting delle sequenze¹⁶. Infine, un recente studio ha riportato una maggiore specificità target per Cas12a che per il Cas9¹⁷nativo.

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo simultaneo del sistema CRISPR/Cas12a per l'editing genomico di S. cerevisiae con particolare attenzione all'introduzione di più cassette di espressione del DNA nei loci genomici indipendenti (editing del genoma multiplex) utilizzando un singolo array di crRNA. I passaggi chiave del protocollo sono illustrati nella Figura 1. Come prova di concetto, il sistema CRISPR/Cas12a è stato applicato per l'introduzione di tre cassette di espressione nel genoma di S. cerevisiae che consentono la produzione di carotene¹⁸ come schematicamente mostrato Figura 2. La produzione di carotene z colpisce il fenotipo di S. cerevisiae: cioè, dopo l'introduzione di successo di tutti e tre i geni eterologi necessari per la biosintesi carotenoidi, le cellule bianche S. cerevisiae diventano gialle o arancioni, a seconda della forza espressiva del promotore di ogni gene. Grazie alla semplice lettura visiva di questo percorso, è stato introdotto per sviluppare avanzati sistemi e metodi basati su CRISPR per l'editing del genoma^19,20. In questo lavoro, le cassette di espressione che codificano i geni carotenoidi crtE, crtYB e crtI sono state costruite utilizzando un approccio 21 golden Gate cloning (GGC) con promotori eterologi e terminatori omologhi utilizzato per guidare l'espressione dei geni. Le cassette di espressione sono circondate da sequenze univoche di 50 coppie di basi (bp), chiamate connettori, che consentono l'assemblaggio in vivo con sequenze di DNA di fianco di integrazione (regioni di fianco) con le stesse sequenze di 50 bp e la successiva integrazione nel DNA genomico del lievito nella posizione determinata dalle regioni di fianco. Utilizzando diversi punti di forza del promotore, sono stati ottenuti ceppi con diversi livelli di produzione di carotenoidi, con conseguente variazione di colore delle cellule. Questi ceppi - ispirati al "Yeast Art Project"²² - sono stati utilizzati in un setup di avvistamento con un gestore liquido acustico per creare una "fotografia di lievito" ad alta risoluzione a 4 colori di Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) è stata una chimica e cristallografa inglese nota per il suo contributo alla scoperta della struttura del DNA da parte della Foto 51^23,24,25.

Protocol

1. Preparazione dei plasmidi Cas12a

NOTA: Il plasmide contenente il batterio Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) codon ottimizzato per l'espressione in S. cerevisiae,è stato precedentemente costruito¹⁹, depositato in un repository plasmide (vedi la Tabella di Materiali). Si tratta di un plasmide della navetta S. cerevisiae /E. coli contenente un gene marcatore di resistenza KanMX per consentire la selezione dei trasformazionanti S. cerevisiae sulla genetica (G418).

1. Ottenere il plasmide pCSN067 (vedere la Tabella dei materiali).
2. Amplificailpil pCSN067 plasmide per ottenere una quantità elevata.
   1. Trasformare 25 -L di cellule E. coli chimicamente competenti acquistate con il pCSN067 pCSN067 secondo il protocollo del produttore. Diluire il mix di trasformazione 10 e 50 volte in 2x peptone-lievito (PY). Piastra fuori 10x e 50x diluizioni su piastre di agar 2x PY contenenti anmellina (0,1 g/L) e incubare peruna pernottamento a 37 .
   2. Scegli da 2 a 3 colonie e inoculare ogni colonia in 3 mL di 2x PY e crescere durante la notte a 37 gradi centigradi in un incubatore tremante a 180 giri.
   3. Purificare il plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore.

2. Preparazione della singola cassetta di espressione della matrice crRNA

1. Preparare il singolo array crRNA.
   NOTA: Il singolo array di crRNA comprende un promotore SNR52 RNA polymerase III di S. cerevisiae e², una ripetizione diretta specifica per LbCas12a e un distanziale (sequenza di bersaglio genomica), insieme ripetuta per ogni bersaglio¹⁹ e termina con un terminatore SUP4 di S. cerevisiae². Il singolo array di crRNA è assemblato da ricombinazione in vivo nel pRN1120 pRN1120 linearizzato per generare un plasmide circolare, quindi le regioni omologhe al pRN1120 pLAsmid devono essere presenti all'inizio e alla fine del singolo array crRNA (vedi Figura 2A ). Si raccomanda di valutare in anticipo la funzionalità di un certo numero di crRNA progettati separatamente¹⁹. Queste informazioni vengono successivamente utilizzate per selezionare i crRNA più funzionali per combinarli nelle sequenze di ripetizione diretta e distanziatore per creare un singolo array di crRNA per lo scopo multiplexing.
   1. Ordinare il singolo array di crRNA per gli esperimenti di editing del genoma multiplex come DNA sintetico (vedere la sequenza di DNA del singolo array di crRNA nella tabella supplementare 1).
   2. Amplificare la matrice crRNA singola ordinata (adesempio, utilizzando i numeri di base KC-101 e KC-102 ( Tabella supplementare2)). Preparare il mix di amplificazione PCR contenente: 0,5 litri di polorasi di DNA, 10 l una di 5 volte di buffer necessari per la polimerasi del DNA, 1 luna di 10 mM dNTP, 2,5 l di 10M di primer di avanzamento, 2,5 di 10 M inverso, 2 -L di modello di DNA ad una concentrazione di 5 ng/L e ultrahpure Hpure Hpure _{2 Il} nome del sistema O fino a un volume totale di 50 .L.
      1. Eseguire la reazione in un termociclore utilizzando il seguente programma: (i) 98 S per 3 min, (ii) 98 C per 10 s, () 60 gradi centigradi per 20 s, (iv) 72 S per 15 s – ripetere i passaggi (ii) a (iv) 30 volte, (v) 72 Gradi C per 5 min (vi) tenere a 12 gradi fino a un'ulteriore analisi.
   3. Analizzare i prodotti PCR per elettroforesi eseguendo i campioni su un gel di agarose 0,8% a 5 V/cm per 40 min utilizzando un colorante di carico del DNA e una scala di DNA con frammenti di DNA in un intervallo da 100 a 10.000 bp.
   4. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
2. Preparare il plasmide del destinatario dell'array crRNA singolo.
   NOTA: La singola matrice di crRNA è espressa dalla S. cerevisiae/E. coli shuttle plasmid pRN1120¹⁹ (vedi tabella dei materiali). Questo plasmide multi-copia contiene un gene del marcatore di resistenza NatMX per consentire la selezione dei trasformazionanti S. cerevisiae su nourseothricin (NTC).
   1. Ottenere il pLAsmide pRN1120.
   2. Amplificailpil pRN1120 plasmide per ottenere una quantità elevata.
      1. Trasformare 25 -L di cellule E. coli chimicamente competenti acquistate con pRN1120 pRN1120 secondo il protocollo del produttore. Diluire il mix di trasformazione 10 e 50 volte in 2volte PY. Piastra fuori 10x e 50x diluizioni su piastre di agar 2x PY contenenti anmellina (0,1 g/L) e incubare peruna pernottamento a 37 .
      2. Scegli da 2 a 3 colonie e inoculare ogni colonia in 3 mL di 2x PY e crescere durante la notte a 37 gradi centigradi in un incubatore tremante a 180 giri.
      3. Purificare il plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore.
   3. Linearizzare pRN1120 pRN1120 con EcoRI-HF e XhoI. Per questo, preparare una miscela di digestione composta da 1 g di pRN1120, 5 L di 10x buffer (1t buffer contiene 50 m di acetato di potassio, 20 mM di acetato di Tris-acetato, 10 mM di acetato di magnesio, 10 g/mL albumina del siero bovino [BSA]; pH 7,9), 1 - L di U-HF (20) , 1 ll di XhoI (20 U) e ultrapure H₂O fino a un volume totale di 50 .L. Incubare il mix di digestione a 37 gradi centigradi per 2 h e inattivare a 65 gradi centigradi per 20 min.
   4. Analizzare il plasmide linearizzato mediante elettroforesi su un gel di agarose (0,8%, 40 min, 5 V/cm) utilizzando un colorante di carico del DNA e una scala di DNA con frammenti di DNA in un intervallo compreso tra 100 e 10.000 bp. Come controllo includono un plasmide circolare nell'analisi.
   5. Purificare il plasmide linearizzato utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.

3. Preparazione dei costrutti di DNA del donatore Promoter-ORF-Terminator (POT)

1. Ordinare un insieme di promotori (P) di diversa forza, frame di lettura aperto (O) e sequenze di terminazione (T) come DNA sintetico in modo che ogni elemento contenga sequenze di riconoscimento standardizzate a 4 bp affiancate dai siti BsaI per abilitare la clonazione Golden Gate ( GGC) assemblaggio²⁶ (vedere i disegni dettagliati nella tabella supplementari 3 e le sequenze nella tabella supplementare 4).
2. Assemblare le cassette di espressione POT composte da un promotore, un telaio di lettura aperto, sequenze di terminatore e connettori tramite un assieme in 4 parti utilizzando una reazione GGC²¹, in un vettore di destinazione che contiene già sequenze di connettori da 50 bp pre-specificate ( vedere la tabella supplementare 4 e i riferimenti^26,27).
   1. Misurare la concentrazione di parti del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Diluire ogni parte di DNA in ultrapure H₂O ad una concentrazione finale di 15 fmol/L.
   2. Preparare un mix di reazione composto da frammenti di DNA: 2 luna di promotore, 2 - L di frame di lettura aperto, 2 -L di terminatore e 2 -L backbone (livello 1 vettori di destinazione come descritto in ²⁶), 4 L di 5x T4 DNA ligase buffer, 2,5 l di 1 U/L T4 DNA Ligase , 1,5 l di 20 U/L BsaI-HF e ultrapure H₂O fino a un volume totale di 20 .
   3. Eseguire la reazione GGC in un termociclore utilizzando il seguente programma: (i) 37 Gradi centigradi per 2 min, (ii) 16 Gradi centigradi per 5 min – ripetere i passi (ii) e (ii) 50 volte, (iii) 50 gradi centigradi per 60 min, (iv) 80 Gradi centigradi per 45 min, (v) tenere a 12 gradi centigradi fino a un'ulteriore analisi.
3. Trasformare 25 -L di cellule E. coli chimichmente competenti acquistate con 3 -L del mix di reazione GGC secondo il protocollo del produttore. Diluire il mix di trasformazione 10 e 50 volte in 2volte PY. Piastra fuori 10x e 50x diluizioni su piastre di agar 2x PY contenenti anmellina (0,1 g/L) e incubare peruna pernottamento a 37 .
4. Scegli da 2 a 3 colonie e inoculare ogni colonia in 3 mL di 2x PY e crescere durante la notte a 37 gradi centigradi in un incubatore tremante a 180 giri.
5. Purificare i plasmidi utilizzando un kit di purificazione plasmida secondo le istruzioni del produttore.
6. Controllare se le cassette di espressione POT sono state assemblate correttamente nella reazione GGC da PCR.
   1. Progettare i numeri di rete complementari alla sequenza di connettori presente all'inizio e alla fine di ogni cassetta di espressioni (vedere la Figura 2B). Per i connettori scelti in questo protocollo, utilizzare i numeri primik da KC-103 a KC-108 (vedere la tabella supplementare 2).
   2. Preparare le miscele di amplificazione PCR per ogni plasmide contenente: 0,5 litri di ricostruzione della polimerasi del DNA, 10 l of 5 volte buffer necessari per la polimerasi del DNA, 1 l di 10 m dNTP, 2,5 l di 10 gradi di primer in avanti di 10 M, 2,5 di 10 M inverti primer, 2 l di modello di DNA con un modello di DNA concentrato con un modello di DNA concentrato ione di 5 ng/L, e ultrapure H₂O fino a un volume totale di 50.
   3. Eseguire la reazione PCR in un termociclore utilizzando il seguente programma: (i) 98 C 3 min, (ii) 98 C per 10 s, (iii) 60 C per 20 s, (iv) 72 S per 2 min 30 s – ripetere i passaggi (ii) a (iv) 30 volte, (v) 72 , (vi) tenere a 12 gradi centigradi fino a quando non sono ulteriori analisi.
      NOTA: i prodotti PCR risultanti sono costituiti da 50 bp del connettore 5', promotore, telaio di lettura aperto, terminatore e 50-bp del connettore 3'.
7. Analizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi eseguendo campioni su un gel di agarose a 5 V/cm per 40 min utilizzando un colorante di carico del DNA e una scala di DNA con frammenti di DNA in un intervallo da 100 a 10.000 bp.

4. Preparazione delle sequenze di DNA del fianco di integrazione contenenti sequenze di connettori

1. Purificare il DNA genomico dal tipo selvaggio S. cerevisiae CEN.PK113-7D²⁹.
   1. Far crescere il ceppo in un pallone da 500 mL riempito con 100 mL di peptone dextrose (YEPD, 2% di glucosio) medio a 30 gradi centigradi e agitando a 250 rpm per 48 ore.
   2. Raccogliere le cellule per centrifugazione di 2 mL di brodo a 16.000 x g per 1 min e scartare il supernatante.
   3. Risospendere le cellule in sale fisiologico (soluzione di 0,85% NaCl) con RNase (10 , 10 mg/mL) e l'enzima littico di lievito (4 l). Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi centigradi per 15 min.
   4. Aggiungete 300 l di lysi cellulare (vedi Tabella deimateriali) e il vortice a breve.
   5. Aggiungere 168 - L di soluzione di precipitazione proteica (vedi Tabella deimateriali) e vortice vigorosamente per 20 s.
   6. Separare la frazione proteica con la centrifugazione a 16.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min.
   7. Recuperare il DNA filando a 16.000 x g a temperatura ambiente per 10 min. Scartare il supernatante e mantenere il pellet.
   8. Lavare il pellet con 200 oltral (70%). Centrifuga a 16.000 x g a temperatura ambiente per 10 min e rimuovere il supernatante. Evaporare l'etanolo incubando il tubo a temperatura ambiente per 10 min con il coperchio aperto.
      NOTA: Se il liquido nel tubo è ancora visibile, ripetere il passaggio 4.1.8. Non asciugare il pellet per più di 10 min per evitare una diminuzione della solubilità del DNA.
   9. Sciogliere il DNA in 50 litri di tampone di TE. Conservare il DNA purificato a 4 gradi centigradi.
2. Per ogni sito di integrazione, l'integrazione del progetto fiancheggia le sequenze di DNA (circa 500 bp) in modo che circa 1000 bp di DNA genomico vengano rimossi dopo l'introduzione del DNA dei donatori (vedere la progettazione schematica nella Figura 2B e le sequenze in Supplementary Tabella 4).
3. Progettare i primer per generare le regioni di fianco da PCR.
   1. Per la regione di fianco asinistra, progettare i primer in avanti e inretro per amplificare circa 500 bp della regione genomica del DNA posizionata a 5" (a sinistra) del sito di integrazione di interesse.
      NOTA: il primer in avanti include 20 bp di omologia con la regione di fianco prevista. L'introduzione inversa include 20 bp con homologia con la regione di fianco prevista e contiene la sequenza di connettori da 50 bp desiderata per consentire l'assemblaggio in vivo nell'editing Cas12a sul genoma in un secondo momento.
   2. Per la regione di fiancodestra, progettare i primer in avanti e inretro per amplificare circa 500 bp della regione genomica del DNA posizionati a 3' (a destra) del sito di integrazione di interesse.
      NOTA: il primer in avanti include 20 bp con omologia con la regione di fianco prevista e contiene la sequenza di connettori di 50 bp desiderata per consentire l'assemblaggio in vivo nell'editing Cas12a sul genoma in un secondo momento. Il primer inverso include 20 bp di omologia con la regione di fianco prevista.
4. Amplificare le regioni di fianco con i primer progettati (adesempio, primer da KC-109 a KC-120 racchiusi nella tabella supplementari 2).
   1. Misurare la concentrazione di DNA genomico purificato che servirà da modello nella PCR. Regolare la concentrazione del DNA a 50 ng/L.
   2. Preparare le miscele di amplificazione PCR composte da DNA genomico (1 a 4 litri di diluizione del DNA genomico da 50 ng/L) purificato al passo 4.1, primer in avanti e indietro (10 M ciascuna), 1 L di 10 mM dNTP, 10 buffer di 5x necessari per la polimerasi del DNA, 0,5 l di polimerasi di DNA (1.0U) , e ultrapure H₂O fino al volume totale di 50.L.
   3. Eseguire i PCR in un termociclore utilizzando il seguente programma: (i) 98 C per 3 min, (ii) 98 C per 20 s, () 60 C per 20 s, (iv) 72 C per 15 s, ripetere i passaggi (ii) a (iv) 30 volte, (v) 72 , (vi) tenere a 12 gradi centigradi fino a quando non sono ulteriori analisi.
5. Analizzare i prodotti PCR per elettroforesi su un gel di agarose 0.8% a 5 V/cm per 40 min utilizzando un colorante di carico del DNA e una scala del DNA con frammenti di DNA in un intervallo da 100 a 10.000 bp.
6. Purificare i prodotti PCR corretti utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.

5. Trasformazione in S. cerevisiae

NOTA: eseguire la trasformazione utilizzando un protocollo basato sui metodi sviluppati da Gietz et al. (1995) ³⁰ e Hill et al. ³¹ che può essere utilizzato per vari ceppi di S. cerevisiae. Il protocollo descritto di seguito è sufficiente per 1 trasformazione.

1. Preparare le soluzioni necessarie per la trasformazione.
   1. Preparare le seguenti soluzioni stock e sterilizzare il filtro: 10 volte il buffer TE contenente 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, volume totale di 50 mL; 1 M LiAc a pH 7,5, volume totale di 50 mL; 50% PEG 4000, volume totale di 100 mL.
      NOTA: Verificare sempre che il titolo PEG 4000 sia a pH 5. Questo stock non deve essere conservato più di un mese.
   2. Preparare le seguenti soluzioni utilizzando i supporti: Preparare la soluzione LiAc-TE contenente 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, volume totale di 0,5 mL. Preparare la soluzione PEG-LiAc-TE contenente il 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, volume totale di 1 mL.
      NOTA: è fondamentale per una trasformazione di successo che le soluzioni PEG-LiAc-TE e LiAc-TE siano appena preparate.
2. Primo round di trasformazione (preparare il ceppo pre-esprimendo Cas12a).
   NOTA: in tutte le fasi di trasformazione, utilizzare acqua con un pH superiore a 5. Si raccomanda di utilizzare acqua demineralizzata in tutte le fasi della trasformazione.
   1. Preparare una pre-cultura crescendo ceppo CEN. PK113-7D in un pallone da 100 mL contenente mezzo DA 20 mL di YEPD (2% di glucosio) e incubare durante la notte a 30 s con agitazione a 250 giri/m.
   2. Misurare l'OD₆₀₀ della pre-cultura (OD_pc). Calcolare il fattore di diluizione (df) tra il volume di pre-coltura e il volume del nuovo mezzo necessario per la preparazione delle cellule che pre-esprimendo Cas12a da utilizzare nella trasformazione (cultura della trasformazione). Nei calcoli si presuppone che la densità ottica della coltura di trasformazione (OD_tc) sia 1,0 dopo la fase di incubazione descritta nella 5.2.3 (ti).
      
      dove ti e - sono rispettivamente il tempo di incubazione e il tempo di raddoppio.
      1. Calcolare il volume della pre-cultura (V_i) necessaria per l'inoculazione della cultura di trasformazione (V_tc) in base al fattore di diluizione.
         
   3. Preparare la cultura della trasformazione inoculando 20 mL di YEPD (2% di glucosio) (V_tc) con il volume di pre-cultura determinato nel passaggio precedente (V_i). Incubare a 30 gradi centigradi con agitazione a 250 giri/min.
   4. Misurare l'OD₆₀₀ della cultura di trasformazione fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 1.0.
   5. Raccogliere le cellule per centrifugazione del brodo da 20 mL a 2.500 x g per 5 min. Scartare il supernatale e lavare le cellule in 20 mL di acqua demineralizzata a temperatura ambiente. Ripetere la fase di centrifugazione e mantenere il pellet cellulare.
   6. Risospendere le cellule in una soluzione LiAc-TE da 100 e trasferirle in un tubo di microcentrismo.
   7. Aggiungere 5 L di DNA portante a filamento singolo (10 mg/mL di DNA di salmone) e mescolare con la pipettatura.
   8. Pipetta 1 g di pCSN067 al tubo di microcentrifuga.
      NOTA: Il volume totale della miscela di DNA non deve superare 100 -L per evitare una minore efficienza di trasformazione.
   9. Aggiungete 600 gradi di soluzione PEG-LiAc-TE e mescolate con il pipettaggio. Incubare per 30 minuti a 30 gradi centigradi mentre agitaa a 450 giri/m in un blocco di calore superiore al tavolo.
   10. Aggiungere 70 -L di DMSO (100%) alla miscela di trasformazione e miscelare con il pipettaggio. Eseguire l'ammortizzatore di calore incubando la miscela di trasformazione a 42 gradi centigradi per 15 minuti in un bagno d'acqua.
   11. Recuperare le cellule trasferendo la miscela in un tubo rotondo rotondo da 15 mL e aggiungere 10 mL di YEPD (2% di glucosio) al tubo. Incubare pernottamento a 30 gradi centigradi con agitazione a 250 giri/min.
   12. Centrifugare il mix di trasformazione a 2.500 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet cellulare in circa 200 .
   13. Piastra fuori 150 l del mix di trasformazione e una diluizione 20x in YEPD (2% di glucosio) di miscela di trasformazione su YEPD (2% glucosio) piastre di agar integrati con 0.2 g/L G418. Incubare le piastre a 30 gradi centigradi per 48 –72 ore.
   14. Scegli un singolo trasformatire e ri-streak su una piastra di agar YEPD (2% di glucosio) integrato con 0.2 g/L G418 per ottenere singole colonie.
3. Secondo round di trasformazione (eseguire l'editing del genoma multiplex con CRISPR/Cas12a).
   1. Preparare una pre-coltura facendo crescere lo sforzo pre-esprimente Cas12a, creato nel primo round di trasformazione (passaggio 5.2), in un pallone da 100 mL contenente 20 mL di YEPD (2% di glucosio) medio integrato con 0,2 g/L G418. Incubare pernottamento a 30 gradi centigradi con agitazione di 250 giri/min.
      NOTA: per più trasformazioni, adattare il volume della pre-cultura.
   2. Seguire i passaggi da 5.2.2 a 5.2.7 per il primo round di trasformazione.
      NOTA: per trasformazioni multiple, adattare i volumi delle soluzioni richieste e la cultura del ceppo pre-esprimente Cas12a.
   3. Pipette 1 g della singola matrice di crRNA, 1 g di plasmide del recipiente linearizzato per l'array crRNA, 1 g di DNA del donatore e 1 g di ogni regione di fianco (fase 4.3) nel tubo di microcentrifuga.
      NOTA: Il volume totale della miscela di DNA non deve superare 100 -L per evitare una minore efficienza di trasformazione.
   4. Preparare i seguenti controlli per la trasformazione: controllo negativo (ultrapure H₂O); controllo positivo per la determinazione dell'efficienza di trasformazione (1 g di pRN1120 circolare); un controllo che verifica se l'introduzione del DNA del donatore è condotta tramite l'editing CRISPR (1 g di pRN120 circolare, 1 g di tutte le cassette di espressione del DNA del donatore e 1 g di regioni di fianco ma nessun array di crRNA; controllare se il DNA del donatore può essere integrato al di fuori del bersaglio (1 g di pRN1120 linearizzato, 1 g di cassette di espressione del DNA del donatore e 1 g del singolo array di crRNA, ma nessuna regione di fianco); un controllo che verifica la linearizzazione completa di pRN1120 (1 g di pRN1120 linearizzato).
   5. Seguire i passaggi da 5.2.9 a 5.2.12 per il primo round di trasformazione.
   6. Piastra fuori 150 l del mix di trasformazione e 20x diluizione in YEPD (2% di glucosio) di miscela di trasformazione su YEPD (2% glucosio) agar integrato con 0.2 g/L G418 e 0.2 g/L NTC. Controlli di piastre su YEPD (2% glucosio) agar integrato con la selezione appropriata (G418 e/o NTC o nessuna selezione). Incubare le piastre a 30 gradi centigradi per 48 –72 ore.
   7. Scegli un singolo trasformatire colorato e ri-streak su una piastra di agar YEPD (2% di glucosio) per ottenere singole colonie colorate.

6. Valutazione dell'efficienza dell'editing del genoma

1. Contare il numero di colonie colorate e colonie bianche sulle piastre di trasformazione.
2. Calcolare l'efficienza di editing del genoma dividendo il numero di colonie colorate per il numero totale di colonie (sia bianche che colorate), come mostrato nella Tabella 1.

7. Conferma dell'integrazione del DNA del donatore nei loci previsti

1. Ri-streak una singola colonia colorata da una piastra di trasformazione su una piastra di agar YEPD (2% glucosio) senza selezione G418 e NTC e incubare per 48 ore a 30 gradi centigradi.
2. Scegli una singola colonia e inoculare un pallone da 500 ml riempito con 100 mL di YEPD (2% di glucosio) medio. Incubare per 48 ore a 30 gradi centigradi e scuotendo a 250 giri/min.
3. Isolare il DNA genomico come descritto nella Sezione 4.1.
   NOTA: In alternativa, utilizzare un protocollo per la preparazione del lievito per la colonia PCR precedentemente proposto da Looke et al. ^32.In questo caso, la crescita del mezzo liquido (Sezione 7.2) può essere saltata.
4. Verificare la corretta integrazione amplificando due frammenti per cassetta di espressione integrata.
   1. Progettare i primer che anneal al DNA genomico al di fuori delle regioni di fianco trasformate e il gene di interesse (vedere gli esempi nella tabella supplementare 2, da KC-121 a KC-132). Quando si utilizzano i numeri di rete KC-121 a KC-132, impostare la temperatura di annealing nel programma PCR su 62 gradi centigradi.
   2. Amplificare la regione di interesse come descritto nella sezione 4.4.2. Adattare il programma PCR, specificamente regolare il tempo della fase di estensione in PCR in base alla lunghezza del modello e alle raccomandazioni del produttore per la polimerasi del DNA.
5. Controllare le dimensioni dei prodotti PCR mediante elettroforesi su un gel di agarose (0,8%, 40 min, 5 V/cm) utilizzando un colorante di carico del DNA e una scala del DNA con frammenti di DNA in un intervallo compreso tra 100 e 10.000 bp.

8. Creazione di arte pixel lievito utilizzando un gestore liquido acustico

1. Preparare un modello di immagine per la grafica pixel di lievito.
   1. Ridimensionare l'immagine RGB originale (220 x 280 pixel, vedere i risultati rappresentativi), ad esempio utilizzando ImageJ per creare un'immagine in scala di grigi finale di 64 x 96 pixel (larghezza e altezza) visualizzata nei colori desiderati (Risultati rappresentativi).
   2. Convertire l'immagine RGB in scala di grigi utilizzando questa formula:
      
      dove I_gr, I_r, I_g, I_b sono rispettivamente le intensità grigie, rosse, verdi e blu.
   3. Per classificare i pixel, sviluppare un plugin ImageJ applicando le seguenti regole: (a) Se io_gr è 64, utilizzare il lievito arancione scuro (ceppo 1, supplementare tabella 3) per questo pixel. (b) Se 64 < I_gr è 128, utilizzare il lievito arancione (ceppo 2, tabella supplementare 3) per questo pixel. (c) Se 128 < I_gr è 192, utilizzare il lievito giallo (ceppo 3, tabella supplementare 3) per questo pixel. (d) Se i_opprimente > 192, utilizzare il lievito bianco (CEN. PK113-7D) per questo pixel.
2. Individuare le celle di lievito per creare l'arte del pixel di lievito.
   1. Inoculare 500 mL shake flaconi contenenti 100 mL di YEPD (2% di glucosio) medio con tre carotenoidi di colore diverso che producono ceppo S. cerevisiae e tipo selvaggio CEN. PK113-7D. Incubare le colture durante la notte a 30 gradi centigradi con agitazione a 250 giri al rin.
   2. Trasferire 0,5 mL della coltura durante la notte in un tubo riempito con 0,5 mL di mezzo di gradiente di densità non ionica sterile (vedere la Tabella dei Materiali). Mescolare vortice per un breve periodo.
   3. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio qualificato, 2 x 3 bene. Eseguire l'avvistamento utilizzando uno strumento di gestione del liquido acustico da una piastra di origine del serbatoio qualificato a una microplacca (vedere la Tabella dei Materiali) contenente 50 mL di YEPD (2% di glucosio) agar. Per semplificare la placcatura, definire i pozzi sulla piastra, ad esempio. utilizzare una micropiastra come una piastra 6144 bene (64 x 96).
   4. Spot 25 nL di ogni ceppo S. cerevisiae dalla piastra di origine 2x 3 pozzo utilizzando un file .csv con l'impostazione di calibrazione del fluido 6RES_AQ_GPSA2 sulla micropiastra di destinazione. Definire ciascuna di queste goccioline da 25 nL come un pixel nella griglia 64 x 96 che viene tradotta nelle posizioni del pozzo (A01, B01, C01 ecc.).
   5. Incubare la micropiastra a 30 gradi centigradi per 48 ore. Per intensificare i colori delle varietà, conservare la piastra di agar a 4 gradi centigradi per almeno 72 ore.

Representative Results

Il protocollo per l'editing del genoma multiplex utilizzando CRISRP/Cas12a è stato dimostrato costruendo tre carotenoidi che producono ceppi S. cerevisiae che esprimono i geni crtE, crtYB e crtI utilizzando promotori eterologi di resistenza alta, media e bassa: ceppo 1, 2 e 3 rispettivamente (Tabella supplementare 3). La costruzione di questi ceppi ha richiesto la generazione di tre cassette di espressione del DNA del donatore e di sei regioni di accompagnamento per ogni ceppo per indirizzarsi a tre loci diversi nel DNA genomico (mostrato figura 2B). Come descritto nel presente indoccazione, promotore, frame di lettura aperto, terminatore e due sequenze di connettori contigue da 50 bp sono state assemblate in una cassetta di espressioni tramite una reazione di clonazione Golden Gate e l'assieme è stato verificato da PCR (Figura 3A). Il singolo array di crRNA è stato ordinato come un frammento di DNA sintetico ed è stato amplificato dalla PCR (Figura3B). Il plasmide del destinatario per il singolo crRNA array (plasmid pRN1120) è stato linearizzato con EcoRI-HF e XhoI e la linearizzazione è stata confermata dall'elettroforesi (Figura 3C). Le sequenze di progettazione e nucleotide delle cassette di espressione del DNA donatore introdotte e delle regioni di accompagnamento sono riportate nella tabella supplementare 3 enella tabella supplementare 4. La sequenza delle singole cassette di espressione della matrice crRNA è riportata nella Tabella supplementare 1. La funzionalità dei distanziali inclusi nel singolo array di crRNA è stata testata in anticipo dall'editing del genoma a singolo pezzetti con singoli crRNA¹⁹.

L'efficienza dell'editing del genoma mediante Cas12a è stata valutata in primo luogo in base al numero di colonie colorate ottenute dopo la trasformazione (Tabella 1, Figura 4). L'efficienza di editing delle tre varietà costruite variava dal 50% al 94%. In particolare, l'introduzione di cassette di espressione utilizzate per generare la deformazione 1ha mostrato la più bassa efficienza di editing, probabilmente causata dalla natura del DNA del donatore (cioè, queste cassette di espressione codificano crtE, crtYB e crtI da tre promotori ad alta resistenza). In secondo luogo, la PCR ha confermato la corretta integrazione delle tre cassette di espressione del DNA del donatore presso i loci previsti sul DNA genomico (Figura 5). I Primer sono stati progettati in modo tale che i prodotti PCR siano stati ottenuti quando si è verificata una corretta integrazione del DNA del donatore nel locus previsto. Per ogni esperimento di trasformazione, otto colonie sono state prelevate dalla piastra di trasformazione e testate (si noti che solo tre sono presentate nella Figura 5). In generale, su 8 colonie testate per DNA del donatore, è stata confermata la corretta integrazione del DNA del donatore crtE presso il locus INT1, dell'asilo crtYB presso il locus INT2 e della crtI presso il locus INT3. Questi risultati dimostrano il sistema CRISPR/Cas12a in combinazione con un singolo array di crRNA consente un efficiente editing multiplex del genoma di S. cerevisiae a più loci contemporaneamente.

Inoltre, dimostriamo la creazione di "yeast pixel art" utilizzando i tre ceppi che producono carotenoidi che sono stati costruiti insieme a un ceppo di tipo selvatico non colorato. Partendo da un'immagine in bianco e nero di Rosalind Franklin (Figura6A), è stata creata un'immagine a 4 colori (Figura 6B) ed è stata creata una lista di avvistamento che è stata poi utilizzata per individuare i quattro diversi ceppi di lievito su una micropiastra di agar gestore liquido acustico, con conseguente un "pittura di lievito" ad alta risoluzione di Rosalind Franklin (Figura6C,D,E).

Figura 1 : Flusso di lavoro del protocollo per l'editing del genoma multiplex CRISPR/Cas12a in S. cerevisiae . Il flusso di lavoro include passaggi cruciali del metodo presentato. Per informazioni dettagliate, vedere il protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Schema dell'editing del genoma multiplex CRISPR/Cas12a utilizzando un singolo array di crRNA. (A) Il singolo array crRNA è composto da tre unità crRNA nella loro forma matura, una ripetizione diretta di 20 bp specifica per LbCas12a (quadrati grigi) con una sequenza di guida di 23 bp (diamanti colorati). L'espressione dell'array crRNA è abilitata dal promotore SNR52 e dal terminatore SUP4. La trasformazione di S. cerevisiae con un pRN1120 linearizzato e la cassetta dell'espressione a matrice crRNA singola contenente omologia con pRN1120 (strisce diagonali) consente la ricombinazione in vivo in un plasmide circolare nelle cellule pre-esprimi LbCas12a. Il singolo array di crRNA viene successivamente elaborato da Cas12a. (B) Cas12a è diretto ai siti target genomici INT1, INT2 e INT3 previsti e crea doppie rotture bloccate. Nella miscela di trasformazione, è stato incluso il DNA del donatore costituito da regioni di fianco e la cassetta di espressione genica carotenoide. Gli assiemi di DNA del donatore sono stati indirizzati a un tratto di DNA nel DNA genomico intorno all'INT1 (crtE), INT2 (crtYB) e INT3 (crtI) da ricombinatione in vivo a causa della presenza di sequenze di connettori omologhi da 50 bp, indicato come 5, A, B, C, D o E. P1–P3, diversi promotori; T1-T3, terminatori diversi. Questa cifra è stata modificata da Verwaal et al. 2018¹⁹. Costrutti genetici mostrati utilizzando Synthetic Biology Open Language (SBOL) Simboli visivi⁴⁰. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : PCR verifica gli esperimenti di editing del genoma. (A) Verifica delle reazioni di Golden Gate Cloning delle cassette del DNA dei donatori assemblati. I risultati ottenuti sono in accordo con le lunghezze previste. (B) PCR del singolo array crRNA. (C) Linearizzazione del pRN1120 plasmide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Piastre di S. cerevisiae trasformazioni utilizzando l'approccio di editing del genoma multiplex. (A) Strain 1 esprime crtE, crtYB e crtI da tre forti promotori (colonie di arancione scuro). (B) Strain 2 esprime crtE, crtYB e crtI da tre promotori di media forza (colonie arancioni). (C) Ceppo 3 che esprime crtE, crtYB e crtI da tre promotori a bassa resistenza (colonie gialle). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : PCR verifica l'integrazione delle cassette di espressione del DNA del donatore nei loci previsti all'interno del DNA genomico. (A) Verifica di tre colonie del ceppo 1. (B) Verifica di tre colonie del ceppo 2. (C) Verifica di tre colonie del ceppo 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Arte pixel yeast di Rosalind Franklin. (A) Foto RGB in bianco e nero di 220 x 280 pixel di Rosalind Franklin che è stata utilizzata come modello. (B) Conversione al computer della foto in bianco e nero di Rosalind Franklin in una lista a 4 colori di 64 x 96 pixel. (C) Foto di arte pixel lievito con 64 x 96 colonie di lievito con una sezione ingrandita. (D) Foto di un gestore di liquidi acustici con due piastre coltivate complete. (E) Foto di una micropiastra coltivata a pieno con colonie di lievito 64 x 96. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	strappo	Ceppo 2	Ceppo 3
Colonie colorate	16	279 del sistema di	220 (in questo da fwlinkin base)
Colonie bianche	16	18 mi lato	18 mi lato
Colonie totali	32 Milia risse	297 del sistema di	238 (di sistema)
efficienza	50%	94%	92%

Tabella 1: Modifica dell'efficienza dell'approccio di editing del genoma multiplex.

sequenza di matrice crRNAa,b,c,d,e,f

CATGTTTGAGCTTATCATAATCCGGAGCTAGGCGGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCGGGCTGCGCAG TCTTTGAAAA GATAATGTATGATATTATGCTTTCTCTCATCATCATATTTATACAGAAACTTGATGTGTTTTCTTTTMASCHERATATATACAAGG TGATTACATGTGTAGTTTGAAGTACACAACTCTAGATTTGTAGTGCGCCCTAGGTAGGGTAAAGGCGCGCGCA TTTTTCACACCCTACAATGTTCTTGTTCAAAAGATTTGCAAACGCGTAGGaAGTGAAGTGCGC ATGTTTCGGTCGAGAACTTCTCCGCAGTGAAGATAGATAGATCAATTTCTCTAAGTGTAGAT CTGGTGANGAGAGaAGCTGAAATTTCTACTAGTAGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTAGATTGCCTCTCTTATACGATTATATTTTTT TTTTTGTTTTTTGTGTCTGGGGGGCCCGGTACCTTTTGTTCTCTGAGTGAGG GTTAATTCCGAGGTGGCGTAATCATGGTCATAGCTTTCCTGTGTGG

a. Homologia a pRN1120 (grassetto). b. Promotore SNR52 (corsivo). c. Sequenze di destinazione genomica (sottolineate). d. Guida ripetizioni dirette specifiche per LbCas12a (corsivo, grassetto). e. terminatore SUP4 (corsivo). f. Homologia a pRN1120 (grassetto).

Tabella supplementare 1: Matrice di crRNA singola per LbCas12a contenente omologia con plasmide pRN1120.

nome	Sequenzaa	Descrizioneb	Utilizzato in punto
KC-101	CATGTTTGACAGCTCATCCATC	Primer FW per amplificazione di un singolo array di crRNA	2.1.4
KC-102	CACACACAGGAAACAGCTATGAC	RV primer per amplificazione di un singolo array di crRNA	2.1.4
KC-103	AAGCGACTTCCAATCGCTTGC	FW primer per amplificazione del DNA del donatore con connettore 5	3.6.1
KC-104	AAAGCAAAGGAGGABAAAC	Numero di motociclista per amplificazione del DNA del donatore con connettore A	3.6.1
KC-105	CGGATCGATGTACAACCG	Primer FW per amplificazione del DNA del donatore con connettore B	3.6.1
KC-106	CAACAGGAGGGGATGGATATAC	RV primer per amplificazione del DNA del donatore con connettore C	3.6.1
KC-107 (in questo stato del sistema)	AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC	Primer FW per amplificazione del DNA del donatore con connettore D	3.6.1
KC-108	AGGTACACaCAAGCACGG	RV primer per amplificazione del DNA del donatore con connettore E	3.6.1
KC-109	CACTATAGCAATCTGGATGH	FW primer per amplificazione di INT1 5' con connettore 5	4.4 (in questo stato del documento)
KC-110	AAACGCCTGGGGGGGGGGTAC TGGATATGCAAGCGATTGGAA GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC ATTCC	Numero di ingrandimento RV per amplificazione di INT1 5' con connettore 5	4.4 (in questo stato del documento)
KC-111	TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTCTCTCTCTCTTCCTCTT TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC TTTG	FW primer per amplificazione di INT1 3' con connettore A	4.4 (in questo stato del documento)
KC-112	TGTCAACTGGAGAGCTCG	Numero di primer RV per amplificazione di INT1 3' con connettore A	4.4 (in questo stato del documento)
KC-113	AGAAGATTCTCTCTCTCTCTC	Introduzione FW per amplificazione di INT2 5' con connettore B	4.4 (in questo stato del documento)
KC-114	TGCTAAGATGGtTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGtACAT CGATCCGCCCTATCAAGGATACC TGGTTG	Numero di primer RV per amplificazione di INT2 5' con connettore B	4.4 (in questo stato del documento)
KC-115	ACGCTTTTCCGGCTCTCCA GACCACAGTATCCATCCCTCCCTCT CCTGTTGGGCGATTACACAGCGG GTGG (in QUESTO Modo)	FW primer per amplificazione di INT2 3' con connettore C	4.4 (in questo stato del documento)
KC-116	TCTCTCTCTCTCGATGACCGGG	RV primer per amplificazione di INT2 3' con connettore C	4.4 (in questo stato del documento)
KC-117	GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG	FW primer per amplificazione di INT3 5' con connettore D	4.4 (in questo stato del documento)
KC-118	GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAACCTG GACAACGTTTTCCAAGGAGG AAGAACG	Numero di ingrandimento RV per amplificazione di INT3 5' con connettore D	4.4 (in questo stato del documento)
KC-119	AAATAACCACAAACATCT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTGATGGGACGTCAGCACT GTAC (Informazioni in base al	FW primer per amplificazione di INT3 3' con connettore E	4.4 (in questo stato del documento)
KC-120	GAGCTTACTCTATATATCCATTC	RV primer per amplificazione di INT3 3' con connettore E	4.4 (in questo stato del documento)
KC-121	GTTACTAAACTGGAACTCCG	Primer FW per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 5'	7.4.1
KC-122	CACTGCTAACTACGTCTCTCTCTC	Primer FW per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 3'	7.4.1
KC-123	CACTGGAACTTGAGCTTMA	Primer FW per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 5'	7.4.1
KC-124	GTCTCCAGCTGAATTGTCC	Primer FW per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 3'	7.4.1
KC-125	CTCTCATGAAGCAGTCAGTC	Primer FW per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 5'	7.4.1
KC-126	GATCGGTCAATTAGGTGAAG	Primer FW per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 3'	7.4.1
KC-127	CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC	RV primer per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 5'	7.4.1
KC-128	GCTGTCATGATGatGATGATAAC	RV primer per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 3'	7.4.1
KC-129	CTGGCAATGTTACCAATTGC	Primer RV per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 5'	7.4.1
KC-130	CCAACGTGCCTTAAAGTCTG	Primer RV per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 3'	7.4.1
KC-131	CCTTACCTTTGGGGAGCAGCAG	Primer RV per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 5'	7.4.1
KC-132	CTGGTTACTTCCCTAAGACTG	Primer RV per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 3'	7.4.1
	a. Le sequenze in grassetto indicano le sequenze di connettore. b. I primer avanti e indietro sono designati rispettivamente come FW e RV.

Tabella supplementare 2: Sequenze di primer.

Tabella supplementare 3: Progettazione di ceppi costruiti.

Tabella supplementare 4: Sequenze di cassette di espressione del DNA del donatore e regioni di sfaldamento. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Il protocollo fornito descrive l'editing del genoma multiplex di S. cerevisiae utilizzando Cas12a dal batterio Lachnospiraceae ND2006 in combinazione con un singolo array di crRNA e DNA del donatore. La progettazione del singolo array di crRNA e del DNA del donatore è spiegata in dettaglio. A differenza del sistema CRISPR/Cas9 consolidato, il CRISPR/Cas12a ha l'esclusiva capacità aggiuntiva di elaborare più crRNA espressi da un singolo array di crRNA^13,33. Grazie a questa funzione, la modifica simultanea di più obiettivi è più facile da configurare e può essere ottenuta in un'unica trasformazione. Questo approccio a matrice di crRNA singolo è stato dimostrato in precedenza da zetsche et al. ³⁴ che contemporaneamente ha curato fino a quattro geni nelle cellule dei mammiferi utilizzando AsCas12a, e da Swiat et al. ³⁵ che ha introdotto quattro frammenti di DNA in un genoma di lievito usando FnCas12a. A nostra conoscenza, un maggior numero di modifiche genomiche simultanee che utilizzano un sistema Cas12a non è stato segnalato e il limite massimo di bersagli per singolo array per Cas12a deve ancora essere determinato. Ulteriori ricerche che utilizzano singoli array di crRNA in combinazione con Cas12a includono la regolazione trascrizionale multiplex in una vasta gamma di organismi^33,36,37.

Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo presentato. Progettare con attenzione tutte le sequenze di DNA coinvolte nell'esperimento di editing del genoma di Cas12a, specialmente nel caso in cui vengano introdotte nuove sequenze di DNA. Determinare la funzionalità delle nuove sequenze distanziali parte di un crRNA, ad esempio da un esperimento di editing del genoma a singolo plesso come descritto da Verwaal et al. ¹⁹ prima di combinarli in un unico array di crRNA. Seguire le raccomandazioni per la preparazione di soluzioni di buffer di trasformazione utilizzate nell'esperimento di editing Cas12a per ottenere una buona efficienza di trasformazione del lievito.

Ci sono alcune modifiche facoltative della tecnica. Si raccomanda di utilizzare 1 g di ciascun DNA del donatore, pRN1120 linearizzato o cassetta di espressione di matrice crRNA singola nella trasformazione, anche se l'uso di una quantità di DNA inferiore dovrebbe anche provocare un'efficienza di trasformazione soddisfacente. Eseguire una trasformazione di test per determinare se è possibile utilizzare quantità di DNA inferiori. La trasformazione di S. cerevisiae potrebbe essere eseguita utilizzando un metodo diverso da quello descritto in questo protocollo, ad esempio il protocollo descritto da Gietz et al. (2007) (2007) ³⁸. La guida del plasmid eplasmid e del veleno di RNA pRN1120 è adatta per l'espressione di una singola matrice di crRNA e di una singola matrice di crRNA di diverse varianti di Cas12a (adesempio, da Acidaminoaminoccus spp. BV3L6 o Francisella novicida U112) e per l'espressione di sgRNA in combinazione con Cas9¹⁹. Il DNA del donatore non deve essere limitato alle cassette di espressione genica carotenoide e alle regioni di fianco che indirizzano il DNA dei donatori ai siti INT1, INT2 e INT3 descritti nel DNA genomico. Qualsiasi DNA di interesse può essere introdotto, in modo multiplex, nel DNA genomico dell'ospite secondo i principi di progettazione descritti in questo protocollo, o in alternativa il DNA del donatore può essere utilizzato per eliminare il DNA da un genoma ospite. La struttura modulare del singolo array di crRNA facilita la facile regolazione delle sequenze di distanziale e di ripetizione diretta. La modifica delle sequenze distanziali consente un cambiamento del locus di integrazione previsto che può essere progettato da uno degli strumenti per l'identificazione di un sito di destinazione genomica, ad esempio il software GuideScan 1.0³⁹. Invece di utilizzare grandi sequenze di fianco che contengono sequenze di connettori, 50 bp della regione di fianco possono essere inclusi nelle sequenze di DNA del donatore incorporando queste sequenze di regioni di fiancheggiamento di 50 bp nei primer utilizzati nella PCR. In questo caso, in totale sono necessari solo tre frammenti di DNA del donatore per un esperimento di editing del genoma multiplex di successo.

In sintesi, questo protocollo fornisce indicazioni dettagliate per eseguire l'editing del genoma multiplex in S. cerevisiae utilizzando Cas12a in combinazione con un singolo approccio di array crRNA. Il protocollo è stato dimostrato dall'editing del genoma multiplex utilizzando 9 frammenti di DNA del donatore e la codifica di un singolo array di crRNA per tre gRNA. Mostriamo alte frequenze complessive di editing tra il 50% e il 94% per i tre disegni di deformazione riportati qui. Concludendo, la caratteristica unica di Cas12a è la capacità di elaborare un singolo array di crRNA in singoli crRNA in una cella, il che rende Cas12a uno strumento eccellente per consentire l'editing del genoma multiplex e sviluppare moduli di regolazione trascrizionale mirati più cassette di espressione in una sola volta. Alla fine, sono stati ottenuti tre ceppi producendo carotenoidi a un livello diverso e colori nei toni tra giallo e arancione. Con questi ceppi e un ceppo di tipo selvaggio, abbiamo mostrato come un gestore di liquidi acustici possa essere utilizzato in modo semplice per realizzare l'arte dei pixel di lievito - questo in onore di Rosalind Franklin che ha contribuito alla scoperta della struttura del DNA 65 anni fa con la sua famosa foto 51^{23. /c1>.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018	Electrophoresis
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl)	New England BioLabs	R353L	Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer	New England BioLabs	B7204S	Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma Aldrich	D1626	Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs	Invitrogen	10297018	PCRs
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis	Merck	100983	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid	Sigma Aldrich	ED	Transformation of S. cerevisiae
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720	Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz	Sigma Aldrich	D2158	Yeast pixel art
Isopropanol	Merck	100993	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate	Sigma Aldrich	L6883	Transformation of S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain	Sigma Aldrich	1494	Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells	New England BioLabs	C3019H	Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB102	Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Polyethylene glycol 4000	Merck	7490	Transformation of S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye	New England BioLabs	B7024S	Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix	Thermo Fisher Scientific	AM2286	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl)	Invitrogen	1705218	Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500	Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit	Promega	A9282	Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol	New England BioLabs	R0146S	Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL)	Zymo Research	E1006	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer	Zymo Research	E1004-B	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar			Plate growth of E. coli
2*PY medium			Cultivation of E. coli
Demineralized water			Transformation of S. cerevisiae
ELFO buffer			Electrophoresis
MQ			Multiple steps
Physiological salt solution			Transformation of S. cerevisiae
TE buffer			Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium			Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar			Plate growth of S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067	Addgene	ID 101748	https://www.addgene.org/
pRN1120	Addgene	ID 101750	https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D	EUROSCARF collection		http://www.euroscarf.de