Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Геном Редактирование Saccharomyces cerevisiae и создание дрожжевого искусства пикселей

Published: May 28, 2019 doi: 10.3791/59350
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 1
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

Summary

Система CRISPR/Cas12a в сочетании с единым массивом crRNA позволяет эффективно редактировать мультиплекс геномs S. cerevisiae при нескольких локусовах одновременно. Это продемонстрировано путем построения каротиноидов производства штаммов дрожжей, которые впоследствии используются для создания дрожжевого пикселя искусства.

Abstract

Высокая эффективность, простота использования и универсальность кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic повторов / CRISPR-ассоциированных белков 9 (CRISPR/Cas9) система способствовала передовой генетической модификации Saccharomyces cerevisiae, модель организмит и рабочая лошадка в промышленной биотехнологии. CRISPR-связанный белок 12a (Cas12a), рнк-направленный эндонуклиз с функциями, отличающимися от Cas9, применяется в этой работе, что еще больше расширяет молекулярный инструментарий для целей редактирования генома. Преимущество системы CRISPR/Cas12a заключается в том, что она может быть использована в редактировании генома мультиплекса с несколькими направляющими РНК, выраженными из одного транскрипционного блока (одиночного массива КРИСП РНК (CRRNA). Мы представляем протокол для мультиплексной интеграции нескольких гетерологических генов в независимые локусы генома S. cerevisiae с помощью системы CRISPR/Cas12a с несколькими CRRN, выраженными из одной конструкции массива crRNA. Предлагаемый метод использует способность S. cerevisiae выполнять in vivo рекомбинацию фрагментов ДНК для сборки одного массива CRRNA в плазмид, который может быть использован для выбора трансформаторов, а также сборки донорской ДНК последовательности, которые интегрируются в геном в намеченных положениях. Cas12a предварительно выражена составно, облегчая расщепление генома S. cerevisiae в предполагаемых позициях при экспрессии одного массива crRNA. Протокол включает в себя проектирование и строительство единого массива CRRNA и кассеты экспрессии донорской ДНК, а также использует интеграционный подход, использующий уникальные 50-bp ДНК-разъемы последовательностей и отдельные интеграционные фланговые последовательности ДНК, что упрощает экспериментальный дизайн путем стандартизации и модульизации и расширяет спектр применений. Наконец, мы демонстрируем простой метод для создания дрожжевого пикселя искусства с акустической жидкости обработчик с использованием разного цвета каротиноидов производства дрожжевых штаммов, которые были построены.

Introduction

Ферменты CRISPR/Cas, несомненно, произвели революцию в молекулярной биологии и были широко приняты в качестве инструментов для инженерных геномов со скоростью, которая ранее была неосуществимой1. О первой модификации генома Saccharomyces cerevisiae по системе редактирования генома CRISPR/Cas9 сообщили DiCarlo et al. 2, демонстрируя успешное выбивание генов и делая мутации точек используя извне введенные oligonucleotides. Дальнейшие дрожжи CRISPR инструментарий события включены: транскрипционное регулирование путем слияния каталитически неактивных мертвых Cas9 (dCas9) с транскрипционными доменами эффектора, чтобы активация и заглушить транскрипции3, применение для обоих Редактирование генома и регулятивные функции для метаболического пути инженерии путем одновременной активации, репрессии и удаление4, удаление крупных фрагментов из генома S. cerevisiae 5, и многохромные слияния6 .

Системы редактирования генома CRISPR/Cas находят свое происхождение в адаптивной иммунной системе бактерий и археев, и эти системы были адаптированы молекулярными биологами для редактирования генома. Их функциональность основана на кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic повторах (CRISPR) областях ДНК, кодирующих РНК, ответственных за распознавание чужеродной ДНК или РНК и связанных с CRISPR генов (Cas), который кодирует РНК-руководствось эндонуклизы1,7,8,9. На основе недавнего анализа генома систем CRISPR/Cas было предложено разделить системы CRISPR/Cas на два класса, пять типов и 16 подтипов10. Эти два класса отличаются на основе организации комплексов-эффекторов, участвующих в расщеплении целей. Как правило, системы CRISPR/Cas с многофункциональной организацией классифицируются как комплексы-эффекторы одного подразделения, в то время как комплексы одного субниунита относятся к классу 210,11. В этой статье мы исследуем класс 2 типа V Cas12a, ранее именовавшийся Cpf110,12, который является альтернативой классу 2 типа II Cas9. Хотя Cas9 хорошо характеризуется и широко используется в исследованиях, Cas12a предлагает дополнительные функции12. Во-первых, Cas12a образует комплекс с CRISPR РНК (crRNA) от 42 до 44 нуклеотидов, не требуя дополнительной трансактивации CRISPR РНК (тракрРНКа). Таким образом, более короткая направляющий РНК может быть использован в редактировании генома с помощью систем CRISPR/Cas12a по сравнению с CRISPR/Cas9. Во-вторых, уникальная эндонуклеаза и эндорибонуклизная деятельность Cas12a позволяет созревания его предварительноcrA13. Это действие RNase позволяет кодировать несколько CRRNA на одном массиве CRISPR crRNA, в то время как Cas9 требует отдельного выражения каждой так называемой однонаправной РНК (sgRNA) или альтернативно, например, выражения дополнительного эндонуклизии ( например, Csy4) в сочетании с мотивами распознавания для Csy4, окружающих каждый sgRNA14,15. В-третьих, Cas12a целевой сайт признания требует протосказер смежных мотив (PAM) в 5 'конец от цели и расщелин после no 18 / 23 позиции от его PAM в результате расщепляется ДНК с липкими концами, в то время как Cas9 требует PAM расположен на 3 'конец от цель и расщелин после -3 позиции создания тупых разрезов конца днк12. В-четвертых, консенсус нуклеотидной последовательности PAM отличается между Cas12a ((T)TTV) и Cas9 (NGG), что делает Cas12a перспективным кандидатом для ориентации T-богатых промоутер и терминатор последовательности16. Наконец, недавнее исследование сообщило больше целевой специфичности для Cas12a, чем для родного Cas917.

Мы представляем протокол для использования системы CRISPR/Cas12a для редактирования генома S. cerevisiae с особым акцентом на внедрение нескольких кассет экспрессии ДНК в независимые геномные локи одновременно (редактирование генома мультиплекса) с использованием единый массив CRRNA. Ключевые этапы протокола изображены на рисунке 1. В качестве доказательства концепции, система CRISPR/Cas12a была применена для введения трех экспресс-кассет в геном S. cerevisiae, которые позволяют производство каротина18, как схематично показано на рисунке 2. Производство каротина влияет на фенотип S. cerevisiae: т.е.при успешном введении всех трех гетерологических генов, необходимых для биосинтеза каротиноидов, белые клетки S. cerevisiae желтеют или оранжевые, в зависимости от силы экспрессии промоутера каждого гена. Благодаря простому визуальному считыванию этого пути, он был введен для разработки передовых систем и методов редактирования генома на основе CRISPR19,20. В этой работе, экспрессионные кассеты, кодируя каротиноидные гены crtE, crtYB и crtI были построены с использованием клонирования Золотые ворота (GGC) подход21 с гетерологическими промоутеров и гомологичных терминаторов используется для привода экспрессии генов. Кассеты выражения окружены уникальными 50-базовыми парами (bp) последовательностями, называемыми разъемами, которые позволяют сборку in vivo с интеграционными фланговыми последовательностями ДНК (фланговые области) с теми же последовательностями 50 bp и последующей интеграцией в геномную ДНК дрожжей в положении, определяемом фланговыми областями. С помощью различных сильных промоутер, штаммы с различными уровнями производства каротиноидов были получены в результате изменения цвета клеток. Эти штаммы - вдохновленный "Дрожжи Арт Проект"22 - были использованы в пятнистость установки с акустической жидкости обработчик для создания 4-цветной высокого разрешения "дрожжевой фотографии" Розалинд Франклин. Франклин (1920-1958) была английский химик и рентгеновский кристаллограф хорошо известен своим вкладом в открытие структуры ДНК фото 5123,24,25.

Protocol

1. Подготовка плазмидов Cas12a

ПРИМЕЧАНИЕ: плазмида, содержащая бактерию Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) Кодон, оптимизированный для выражения в S. cerevisiae, был ранее построен19, на хранение в плазмидном хранилище (см. таблицу Материалы). Это однокопиальный эпизодsmal S. cerevisiae/E. coli шаттл плазмид, содержащий ген маркера устойчивости KanMX, позволяющий отбирать трансформаторов S. cerevisiae на генетике (G418).

  1. Получить pCSN067 плазмида (см. Таблицу материалов).
  2. Усиль pCSN067 плазмида, чтобы получить большое количество.
    1. Преобразование 25 ЗЛ приобретенных химически компетентных клеток кишечной палочки с плазмидным pCSN067 в соответствии с протоколом производителя. Разбавить преобразование смесь 10 и 50 раз в 2x пептон-дрожжи (PY). Плита из 10x и 50x разбавления на 2x PY агар пластин, содержащих ампициллин (0,1 г / л) и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
    2. Выберите от 2 до 3 колоний и привить каждую колонию в 3 мл 2x PY и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию в встряхивая инкубатор на 180 об/мин.
    3. Очистите плазмида с помощью плазмидного комплекта очистки в соответствии с инструкциями производителя.

2. Подготовка кассеты выражения одного массива CRRNA

  1. Подготовьте единый массив CRRNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один массив CRRNA включает в себя SNR52 РНК полимеразы III промоутер от S. cerevisiae2, прямое повторение конкретных для LbCas12a и прокладка (геномные цели последовательности), вместе повторяется для каждой цели19 и заканчивается с терминатором SUP4 от S. cerevisiae2. Единый массив CRRNA собирается in vivo рекомбинации в линейной плазмиды pRN1120 для создания круговой плазмиды, таким образом, регионы гомологичные плазмид pRN1120 должны присутствовать в начале и конце одного массива CRRNA (см. Рисунок 2A ). Рекомендуется заранее оценить функциональность ряда разработанных CRRNA отдельно19. Эта информация впоследствии используется для выбора наиболее функциональных CRRNA объединить их в прямой повтор и прокладка последовательностей для создания единого массива CRRNA для цели мультиплексирования.
    1. Закажите единый массив CRRNA для экспериментов по редактированию генома мультиплекса в качестве синтетической ДНК (см. последовательность ДНК одного массива CRRNA в дополнительной таблице1).
    2. Увеличьте упорядоченный одинcrRNA массив(например,с помощью грунтовки KC-101 и KC-102 (Дополнительнаятаблица2)). Подготовьте смесь усиления ПЦР, содержащую: 0,5 л полимеразы ДНК, 10 юл 5-x буфера, необходимого для полимеразы ДНК, 1 л 10 мМ dNTPs, 2,5 л из 10 мкм передний грунт, 2,5 л из 10 мкм обратного грунтовки, 2 л шаблона ДНК в концентрации 5 нг/Л и ультрачистый H 2 O до общего объема 50 зл.
      1. Выполните реакцию в термоцикле, используя следующую программу: (i) 98 кв.м. в течение 3 мин, (ii) 98 градусов по Цельсию для 10 с, (iii) 60 градусов по Цельсию на 20 с, (iv) 72 градусов по Цельсию на 15 с - повторные шаги (ii) до (iv) 30 раз, (v) 72 c для 5 мин (vi) держать анализ на 12 градусов по Цельсию.
    3. Проанализируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза, запустив образцы на 0,8% агарозного геля при 5 В/см в течение 40 минут с помощью погрузочного красителя ДНК и ДНК-лестницы с фрагментами ДНК в диапазоне от 100 до 10 000 б.п.
    4. Очистите продукты ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Подготовьте один crRNA массив получателя плазмиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один массив crRNA выражается от S. cerevisiae/E. coli шаттл плазмид pRN112019 (см. Таблица материалов). Этот многокопительный плазмид содержит ген маркера сопротивления NatMX, позволяющий отбирать трансформаторы S. cerevisiae на нурсеотрицин (NTC).
    1. Получить pRN1120 плазмид.
    2. Усиль pRN1120 плазмид, чтобы получить большое количество.
      1. Преобразование 25 ЗЛ приобретенных химически компетентных клеток кишечной палочки с плазмидным pRN1120 в соответствии с протоколом производителя. Разбавить преобразование смесь 10 и 50 раз в 2x PY. Плита из 10x и 50x разбавления на 2x PY агар пластин, содержащих ампициллин (0,1 г / л) и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
      2. Выберите от 2 до 3 колоний и привить каждую колонию в 3 мл 2x PY и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию в встряхивая инкубатор на 180 об/мин.
      3. Очистите плазмид с помощью плазмидного комплекта очистки в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Линейная плазмида pRN1120 с EcoRI-HF и XhoI. Для этого приготовьте смесь пищеварения, состоящую из 1 мкг pRN1120, 5 кЛ 10-х буфера (1x буфер содержит 50 мм калийного ацетата, 20 мм трис-ацетат, 10 мм магния ацетата, 100 мкг/мл крупной сыворотки альбумина , 1 кЛ КхоI (20 U) и ультрачистый H2O до общего объема 50 зЛ. Инкубировать пищеварение смесь при 37 кс на 2 ч и инактивировать при 65 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
    4. Проанализируйте линейную плазмиду с помощью электрофореза на агарозном геле (0,8%, 40 мин, 5 В/см) с помощью погрузочного красителя ДНК и ДНК-лестницы с фрагментами ДНК в диапазоне от 100 до 10 000 б.п. В качестве контроля включают круговую плазмиду в анализе.
    5. Очистите линейную плазмиду с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.

3. Подготовка конструкций ДНК донора Промоутер-ORF-Терминатор (POT)

  1. Заказать набор промоутер (P) различной прочности, открытый кадр чтения (O) и терминатор (T) последовательности, как синтетическая ДНК, таким образом, что каждый элемент содержит стандартизированные 4-bp последовательности распознавания, которые в окружении BsaI сайтов, чтобы Золотые ворота клонирования ( GGC) сборка26 (см. подробные проекты в дополнительной таблице 3 и последовательности в дополнительной таблице 4).
  2. Соберите кассеты выражения POT, состоящие из промоутера, открытой рамки чтения, последовательности терминатора и разъемов с помощью 4-частичной сборки с помощью реакции GGC21,в вектор назначения, который уже содержит заранее определенные 50-bp разъемы последовательностей ( см. Дополнительную таблицу 4 и ссылки26,27).
    1. Измерьте концентрацию частей ДНК с помощью спектрофотометра. Разбавить каждую часть ДНК в ультрачистых H2O до конечной концентрации 15 фмоль / Л.
    2. Подготовьте реакционную смесь, состоящую из фрагментов ДНК: 2 злитропромената, 2 злитрового кадра с открытым чтением, 2 злитрового терминатора и 2 хэтчбека (векторы назначения уровня 1, как описано в 26),4 ЗЛ 5x T4 ДНК-лигаза буфера, 2,5 л 1 U/L T4 ДНК Ligase , 1,5 л 20 U /L BsaI-HF и ультрачистый H2O до общего объема 20 Зл.
    3. Выполните реакцию GGC в термоцикле, используя следующую программу: (i) 37 кв.м. в течение 2 мин, (ii) 16 градусов по Цельсию в течение 5 мин - повторные шаги (i) и (ii) 50 раз, (iii) 50 c в течение 60 мин, (iv) 80 c в течение 45 мин, (v) удерживайте при 12 c до дальнейшего анализа.
  3. Преобразование 25 зЛ приобретенных химически компетентных E. coli28 клеток с 3 зл и реакционными смесьми GGC в соответствии с протоколом производителя. Разбавить преобразование смесь 10 и 50 раз в 2x PY. Плита из 10x и 50x разбавления на 2x PY агар пластин, содержащих ампициллин (0,1 г / л) и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
  4. Выберите от 2 до 3 колоний и привить каждую колонию в 3 мл 2x PY и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию в встряхивая инкубатор на 180 об/мин.
  5. Очистите плазмиды с помощью плазмидного комплекта очистки в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Проверьте, правильно ли собраны кассеты с выражением POT в реакции GGC ПЦР.
    1. Дизайн праймеров дополняют последовательность разъема, присутствуют в начале и в конце каждого выражения кассеты (см. Рисунок 2B). Для разъемов, выбранных в этом протоколе, используйте грунтовки KC-103 до KC-108 (см. Дополнительную таблицу2).
    2. Подготовка PCR амплификации смеси для каждого плазмида, содержащая: 0,5 л корректуры ДНК полимеразы, 10 л 5x буфера, необходимых для ПОЛимеразы ДНК, 1 л 10 мМ dNTPs, 2,5 л из 10 мкм вперед праймер, 2,5 юл 10 мкм реверсивной грунтовки, 2 мл л шаблона ДНК с концентратором ион 5 нг/Л, и ультрачистый H2O до общего объема 50 л.
    3. Выполните реакцию ПЦР в термоцикле, используя следующую программу: (i) 98 КК 3 мин, (ii) 98 КК для 10 с, (iii) 60 кс для 20 с, (iv) 72 C в течение 2 мин 30 s - повторные шаги (ii) до (iv) 30 раз, (v) 72 c для 5 мин , (vi) удерживайте при 12 градусах Цельсия до дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате ПЦР продукты состоят из 50-bp 5' разъем, промоутер, открытый кадр чтения, терминатор и 50-bp 3' разъем.
  7. Проанализируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза, запустив образцы на 0,8% агарозного геля на 5 V/cm в течение 40 минут с помощью днк-загрузки красителя и ДНК-лестницы с фрагментами ДНК в диапазоне от 100 до 10 000 б.п.

4. Подготовка интеграционных фланговых последовательностей ДНК, содержащих последовательности разъемов

  1. Очистка геномной ДНК от дикого типа S. cerevisiae CEN.PK113-7D29.
    1. Выращивайте деформацию в колбе для встряхивания 500 мл, наполненной 100 мл дрожжевого экстракта пептон декстрозы (YEPD, 2% глюкозы) при 30 градусах Цельсия и тряски при 250 об/мин в течение 48 часов.
    2. Урожай клеток путем центрифугации 2 мл бульона на 16000 х г в течение 1 мин и отбросить супернатант.
    3. Приостанавливайте действие клеток в физиологической соли (200 л; 0,85% раствор naCl) с помощью RNase (10 л, 10 мг/мл) и дрожжевого литического фермента (4 л). Инкубировать суспензию клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
    4. Добавить 300 л раствора лиза клетки (см. Таблицаматериалов) и вихрь в ближайшее время.
    5. Добавьте 168 л раствора осадков белка (см. ТаблицуМатериалов) и вихрь энергично в течение 20 с.
    6. Разделите фракцию белка центрифугированием на уровне 16 000 х г и 4 кв с в течение 10 мин. Соберите 600 л супернатанта в новой трубке и смешайте с 600 л изопропанола и вихря в ближайшее время.
    7. Восстановление ДНК, вращаясь вниз на 16000 х г при комнатной температуре в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и сохранить гранулы.
    8. Вымойте гранулы с 200 л этанола (70%). Центрифуга при температуре 16 000 х г при комнатной температуре в течение 10 мин и удалите супернатант. Испарять этанол путем инкубации трубки при комнатной температуре в течение 10 минут с крышкой открыт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость в трубке все еще видна, повторите шаг 4.1.8. Не сушите гранулы дольше 10 мин, чтобы предотвратить снижение растворимости ДНК.
    9. Растворите ДНК в 50 зл буфера TE. Храните очищенную ДНК при 4 градусах Цельсия.
  2. Для каждого сайта интеграции, дизайн интеграции фланговых последовательностей ДНК (около 500 bp), таким образом, что около 1000 bp геномной ДНК будут удалены после введения донорской ДНК (см. схематический дизайн на рисунке 2B и последовательности в дополнительных Таблица 4).
  3. Дизайн грунтовки для генерации фланговых регионов по ПЦР.
    1. Для левого фланговогорегиона, дизайн вперед и обратные грунтовки, чтобы усилить около 500 bp геномной области ДНК расположен 5' (слева) от интеграции сайта интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя грунтовка включает в себя 20 bp гомологии с предполагаемым фланговым регионом. Обратный грунт включает в себя 20 bp с гомологией с предполагаемой областью фланга и содержит желаемую 50-bp разъем последовательность для включения виво сборки в Cas12a редактирования генома позже.
    2. Для правого фланговогорегиона, дизайн вперед и обратные грунтовки, чтобы усилить около 500 bp геномной области ДНК расположен 3' (справа) от интеграции сайта интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя грунтовка включает в себя 20 bp с гомологией с предполагаемой областью фланга и содержит желаемую 50-bp разъем последовательность, чтобы включить сборку in vivo в Cas12a редактирования генома позже. Обратный грунт включает в себя 20 bp гомологии с предполагаемым фланговым регионом.
  4. Усиль фланговые области сразработанными грунтовками (например, праймеры KC-109 до KC-120, заключенные в дополнительную таблицу2).
    1. Измерьте концентрацию очищенной геномной ДНК, которая будет служить шаблоном в ПЦР. Отрегулируйте концентрацию ДНК до 50 нг/Л.
    2. Подготовка pcR амплификации смеси, состоящие из геномной ДНК (1 - 4 л 50 нг / Л геномной разбавления ДНК) очищены в шаге 4.1, вперед и обратной грунтовки (10 мкм каждый), 1 Л 10 ММ dNTPs, 10 qL 5x буфера, необходимых для ПОЛимераза ДНК, 0,5 л полимерной ДНК (1.0) , и ультрачистый H2O до общего объема 50 Зл.
    3. Выполните ПХР в термоцикле, используя следующую программу: (i) 98 кв.к. в течение 3 мин, (ii) 98 кС для 20 с, (iii) 60 градусов по Цельсию на 20 с, (iv) 72 КС на 15 с, повторные шаги (ii) до (iv) 30 раз, (v) 72 c для 5 мин , (vi) удерживайте при 12 градусах Цельсия до дальнейшего анализа.
  5. Проанализируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза на 0,8% агарозного геля при 5 В/см в течение 40 минут с помощью погрузочного красителя ДНК и ДНК-лестницы с фрагментами ДНК в диапазоне от 100 до 10 000 б.п.
  6. Очистите правильные продукты ПЦР с помощью комплекта пЦР очистки в соответствии с инструкциями производителя.

5. Преобразование в S. cerevisiae

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните преобразование с помощью протокола, основанного на методах, разработанных Gietz et al. (1995) 30 и Хилл и др. 31, которые могут быть использованы для различных штаммов S. cerevisiae. Протокол, описанный ниже, достаточен для 1 преобразования.

  1. Подготовьте решения, необходимые для трансформации.
    1. Подготовьте следующие стоковые растворы и стерилизуйте фильтр: 10-кратный буфер TE, содержащий 100 мм Tris-HCl (pH 7.5), 10 мм EDTA, общий объем 50 мл; 1 М Лиакк при рН 7,5, общий объем 50 мл; 50% PEG 4000, общий объем 100 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проверяйте, что АКЦИИ PEG 4000 находится на рН 5. Этот запас не должен храниться дольше одного месяца.
    2. Подготовьте следующие решения с использованием запасов: Подготовьте раствор LiAc-TE, содержащий 0,1 М.Л. LiAc, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, общий объем 0,5 мл. Подготовьте решение PEG-LiAc-TE, содержащее 40% PEG 4000, 0.1 M LiAc, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, общий объем 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешной трансформации очень важно, чтобы решения PEG-LiAc-TE и LiAc-TE были приготовлены недавно.
  2. Первый раунд преобразования (подготовьте напряжение, предварительно выражающее Cas12a).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех шагах преобразования, используйте воду с рН выше, чем 5. Рекомендуется использовать деминерализованную воду на всех этапах преобразования.
    1. Подготовка предварительной культуры путем растущего напряжения CEN. PK113-7D в колбе для встряхивания 100 мл, содержащей 20 мл средней среды YEPD (2% глюкозы) и инкубирует на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин.
    2. Измерьте OD600 пре-культуры (ODpc). Рассчитайте факторразбавления (df) между объемом пре-культуры и объемом свежей среды, необходимой для подготовки клеток, предварительно выражающих Cas12a, которые будут использоваться в преобразовании (трансформации культуры). В расчетах предполагаем оптическую плотность культуры преобразования (ODtc)будет 1.0 после шага инкубации, описанного в 5.2.3(ti).
      Equation 1
      где ti и No являются время инкубации и удвоение времени, соответственно.
      1. Рассчитайте объем предварительнойкультуры (Vi), необходимый для прививки культуры трансформации (Vtc) на основе фактора разбавления.
        Equation 2
    3. Подготовьте культуру трансформации путем прививки 20 мл YEPD (2% глюкозы) (Vtc)с объемом предварительной культуры, определяемой на предыдущем этапе (Vi). Инкубировать при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин.
    4. Измерьте OD600 культуры преобразования до достижения OD600 из 1.0.
    5. Урожай клеток путем центрифугации 20 мл бульона на 2500 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и промойте клетки в 20 мл комнатной температуры деминерализованной воды. Повторите шаг центрифугации и держите клетку гранулы.
    6. Приостановите работу клеток в 100 л раствора LiAc-TE и перенесите в микроцентрифугную трубку.
    7. Добавьте 5 зЛ одноцепочечной ДНК носителя (10 мг/мл ДНК спермы лосося) и смешайте путем трубки.
    8. Пипетка 1 мкг плазмидного pCSN067 к микроцентрифуге трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем смеси ДНК не должен превышать 100 л, чтобы предотвратить более низкую эффективность преобразования.
    9. Добавьте 600 л раствора PEG-LiAc-TE и смешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 30 градусов при встряхивании при 450 об/мин в верхнем тепловом блоке стола.
    10. Добавить 70 л DMSO (100%) к преобразованию смеси и перемешать путем пипетки. Выполните тепло-шок, инкубируя преобразуемую смесь при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 15 минут на водяной бане.
    11. Восстановление клеток путем передачи смеси в 15 мл круглой нижней трубки и добавить 10 мл YEPD (2% глюкозы) в трубку. Инкубировать на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин.
    12. Centrifuge преобразование смесь на 2500 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend клеточной гранулы примерно в 200 зл.
    13. Плита из 150 л преобразования смеси и 20x разбавления в YEPD (2% глюкозы) преобразования смеси на YEPD (2% глюкозы) агар пластины дополнены 0,2 г / л G418. Инкубировать тарелки при 30 градусах по Цельсию в течение 48 - 72 часов.
    14. Выберите один трансформировать и повторно полоса на YEPD (2% глюкозы) агар пластины дополнены 0,2 г / l G418 для получения отдельных колоний.
  3. Второй раунд трансформации (выполнение редактирования генома мультиплекса с помощью CRISPR/Cas12a).
    1. Подготовка предварительной культуры путем выращивания штамма предварительно выражая Cas12a, созданный в первом раунде преобразования (шаг 5.2), в 100 мл встряхнуть колбу, содержащую 20 мл YEPD (2% глюкозы) среды дополнены 0,2 г / л G418. Инкубировать на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для нескольких преобразований адаптируйте объем предкультуры.
    2. Следуйте шагам 5.2.2 до 5.2.7 для первого раунда трансформации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для нескольких преобразований, адаптировать объемы необходимых решений и культуры штамма предварительно выражая Cas12a.
    3. Пипетка 1 мкг одного массива CRRNA, 1 мкг линейной плазмидре реципиента для массива CRRNA, 1 мкг донорской ДНК и 1 мкг каждой фланговой области (шаг 4.3) в микроцентрифуговой трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем смеси ДНК не должен превышать 100 л, чтобы предотвратить более низкую эффективность преобразования.
    4. Подготовьте следующие элементы управления для преобразования: отрицательный контроль (ультрачистый H2O); положительный контроль за определением эффективности преобразования (1 мкг кругового pRN1120); контрольная проверка, осуществляется ли введение донорской ДНК с помощью редактирования CRISPR (1 мкг кругового pRN1120, 1 мкг всех кассет экспрессии донорской ДНК и 1 мкг фланговых областей, но не один массив CRRNA); контроль, проверяющий, может ли донорская ДНК быть интегрирована вне целевого показателя (1 мкг линейной pRN1120, 1 мкг кассет экспрессии донорской ДНК и 1 мкг одного массива CRRNA, но без фланговых областей); контроль, проверяющий полную линейную излиемние pRN1120 (1 мкг линейного pRN1120).
    5. Следуйте шагам 5.2.9 до 5.2.12 для первого раунда трансформации.
    6. Плита из 150 л преобразования смеси и 20x разбавления в YEPD (2% глюкозы) преобразования смеси на YEPD (2% глюкозы) агар дополнен 0,2 г / л G418 и 0,2 г / L NTC. Плита из контроля на YEPD (2% глюкозы) агар дополнен соответствующим выбором (G418 и / или NTC или нет выбора). Инкубировать тарелки при 30 градусах по Цельсию в течение 48 - 72 часов.
    7. Выберите один цветной трансформатор и повторно полоса на YEPD (2% глюкозы) агар пластины для получения одного цветного колоний.

6. Оценка эффективности редактирования генома

  1. Подсчитайте количество цветных колоний и белых колоний на преображении пластин.
  2. Рассчитать эффективность редактирования генома, разделив количество цветных колоний на общее количество колоний (как белых, так и цветных), как показано в таблице 1.

7. Подтверждение интеграции донорской ДНК на предполагаемых локусов

  1. Повторно полоса цветной одной колонии из преобразования пластины на YEPD (2% глюкозы) агар пластины без G418 и NTC выбор и инкубировать в течение 48 часов при 30 градусов по Цельсию.
  2. Выберите одну колонию и привить 500 мл встряхивания колбу заполнены 100 мл YEPD (2% глюкозы) среды. Инкубировать в течение 48 часов при 30 градусах по Цельсию и тряски при 250 об/мин.
  3. Изолировать геномную ДНК, описанную в разделе 4.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте протокол для подготовки дрожжей для колонии PCR ранее предложенные Looke и др. 32. В этом случае можно пропустить рост жидкой среды (раздел 7.2).
  4. Проверьте правильную интеграцию путем усиления двух фрагментов на одну интегрированную кассету выражения.
    1. Дизайн праймеров, которые аннеал геномной ДНК за пределами преобразованных фланговых регионов и ген аинтересов (см. примеры в дополнительной таблице 2, KC-121 к KC-132). При использовании грунтовки KC-121 на KC-132 установите температуру аннулирования в программе ПЦР до 62 градусов по Цельсию.
    2. Усиливать интересуемый регион, как описано в разделе 4.4.2. Адаптируйте программу ПЦР, специально отрегулируйте время расширения шага в ПЦР в соответствии с длиной шаблона и рекомендациями производителя для полимеразовы хэтч-
  5. Проверьте размер продуктов ПЦР с помощью электрофореза на агарозном геле (0,8%, 40 мин, 5 В/см) с помощью погрузочного красителя ДНК и ДНК-лестницы с фрагментами ДНК в диапазоне от 100 до 10 000 б.п.

8. Создание дрожжевого пикселя искусства с помощью акустического жидких обработчик

  1. Подготовьте шаблон изображения для искусства пикселей дрожжей.
    1. Изменяйте исходное изображение RGB (220 и 280 пикселей, см. репрезентативные результаты), например, с помощью ImageJ для создания окончательного изображения серого масштаба размером 64 и 96 пикселей (ширина и высота), визуализированного в предназначенных цветах (Репрезентативные результаты).
    2. Преобразуйте изображение RGB в серое масштаб с помощью этой формулы:
      Equation 3
      где яgr, яг, яг, яb являются серый, красный, зеленый и синий интенсивности, соответственно.
    3. Для того, чтобы классифицировать пиксели, разработайте плагин ImageJ, применяющий следующие правила: (а) Если мне64 евро, используйте темно-оранжевые дрожжи (напряжение 1, Дополнительная таблица3) для этого пикселя. (b) Если 64 злт; яgr 128, используйте оранжевые дрожжи (напряжение 2, Дополнительная таблица3) для этого пикселя. с) Если 128 злт; яgr 192, используйте желтые дрожжи (напряжение 3, Дополнительная таблица 3) для этого пикселя. d) Если яgr йgt; 192, используйте белые дрожжи (CEN. PK113-7D) для этого пикселя.
  2. Пятно дрожжевых клеток для создания дрожжевого пикселя искусства.
    1. Прививать 500 мл встряхнуть колбы, содержащие 100 мл YEPD (2% глюкозы) среды с тремя по-разному цветные каротиноиды производства S. cerevisiae штамма и дикого типа CEN. PK113-7D. Инкубировать культуры на ночь при 30 градусах Цельсия с тряской при 250 об/мин.
    2. Передача 0,5 мл ночной культуры в трубку, заполненную 0,5 мл стерильной неионной среды градиента плотности (см. ТаблицуМатериалов). Смешайте путем вихря кратко.
    3. Перенесите подвеску ячейки в квалифицированный резервуар, 2 х 3 скважины. Выполните с помощью акустического инструмента обработчика жидкости от квалифицированной пластины источника резервуара до микроплиты (см. Таблицаматериалов), содержащей 50 мл агара YEPD (2% глюкозы). Чтобы упростить покрытие, определить скважины на тарелке, например. использовать микроплиту в качестве пластины 6144 скважины (64 и 96).
    4. Пятно 25 nL каждого Штамма S. cerevisiae от 2x 3 хорошо резервуара источник пластины с помощью файла .csv с жидкостью калибровки настройки 6RES-A'GPSA2 на назначение микроплиты. Определите каждую из этих капель 25 нл в виде пикселя в сетке 64 x 96, которая переводится на позиции скважины (A01, B01, C01 и т.д.).
    5. Инкубировать микроплиту при 30 градусах По цельсию в течение 48 часов. Чтобы усилить цвета штаммов хранить агар пластины на 4 кВ, по крайней мере 72 часов.

Representative Results

Протокол для редактирования генома мультиплекса с помощью CRISRP/Cas12a был продемонстрирован путем построения трех каротиноидов, производящих штаммы S. cerevisiae, выражающие crtE, crtYB и crtI гены с использованием гетерологических промоутеров высокая, средняя и низкая прочность: напряжение 1, 2 и, 3 соответственно(Дополнительная таблица3). Строительство этих штаммов требуется поколение из трех доноров ДНК экспрессионных кассет и шесть фланговых областей на штамм для ориентации на три различных локусов в геномной ДНК (показано на рисунке 2B). Как описано в этом, промоутер, открытый кадр чтения, терминатор и два смежных 50-bp разъемы последовательности были собраны в экспресс-кассету через Реакцию клонирования Золотые ворота и сборка была проверена PCR (Рисунок 3A). Единый массив CRRNA был заказан в качестве синтетического фрагмента ДНК и был усилен ПЦР(рисунок 3B). Получатель плазмиды для одного массива crRNA (плазмид pRN1120) был линейным с EcoRI-HF и XhoI и линейное было подтверждено электрофорезом (рисунок3C). Конструкция и нуклеотидные последовательности введенных кассет экспрессии ДОНОРа и фланговых областей показаны в дополнительной таблице 3 и дополнительной таблице4. Последовательность однозначных кассет экспрессии массива CRRNA представлена в дополнительной таблице1. Функциональность прокладок, включенных в единый массив CRRNA, была заранее проверена путем редактирования генома singleplex с помощью индивидуальных CRRNA19.

Эффективность редактирования генома с помощью Cas12a была впервую оценена на основе количества цветных колоний, полученных после трансформации(таблица 1, рисунок 4). Эффективность редактирования трех построенных штаммов варьировалась от 50% до 94%. Примечательно, что введение экспрессионных кассет, используемых для генерации штамма 1 отображается низкая эффективность редактирования, возможно, вызвано характером днк донора (т.е., эти кассеты выражения кодировать crtE, crtYB и crtI от трех высокопрочных промоутеров). Во-вторых, правильная интеграция трех донорских кассет экспрессии ДНК на предполагаемых локусах на геномной ДНК была подтверждена ПЦР(рисунок 5). Праймеры были разработаны таким образом, что пЦР продукты были получены, когда правильная интеграция донорской ДНК на предполагаемом локусе произошло. Для каждого эксперимента преобразования, 8 колоний были выбраны от плиты преобразования и испытаны (обратите внимание что только 3 представлены в рисунке 5). В целом, из 8 колоний, проверенных на ДНК донора, правильная интеграция ДНК донора crtE в локусе INT1, crtYB в локусе INT2 и crtI в локусе INT3 была подтверждена в Эти результаты демонстрируют, что система CRISPR/Cas12a в сочетании с одним массивом crRNA позволяет эффективно редактировать мультиплекс генома S. cerevisiae одновременно на нескольких локусовах.

Кроме того, мы демонстрируем создание "дрожжевого пиксельного искусства" с использованием трех каротиноидов, производящих штаммы, которые были построены вместе с неокрашенным штаммом дикого типа. Начиная с черно-белой картины Розалинд Франклин(Рисунок 6A), 4-цветное изображение (Рисунок 6B) и пятнистость список был создан, который затем был использован для выявления четырех различных штаммов дрожжей на микроплите агара, используя акустический жидкий обработчик, в результате чего в высоком разрешении "дрожжевой живописи" Розалинд Франклин(Рисунок 6C,D, E).

Figure 1
Рисунок 1 : Рабочий процесс протокола для редактирования генома генома CRISPR/Cas12a в S. cerevisiae. Рабочий процесс включает в себя важные шаги представленного метода. Для получения подробной информации см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Схема редактирования генома генома CRISPR/Cas12a с использованием одного массива CRRNA. (A) Один crRNA массив состоит из трех crRNAs единиц в их зрелой форме, 20-bp прямого повторения конкретных для LbCas12a (серые квадраты) с 23-bp руководство последовательности (цветные алмазы). Выражение массива crRNA включено промоутером SNR52 и терминатором SUP4. Преобразование S. cerevisiae с линейной pRN1120 и одной кассетой выражения массива CRRNA, содержащей гомологию с pRN1120 (диагональные полосы) позволяет рекомбинацию in vivo в круговую плазмиду в клетках, предварительно выражающих LbCas12a. Единый массив CRRNA впоследствии обрабатывается Cas12a. (B) Cas12a направляется к предназначенным INT1, INT2 и INT3 геномным целевым объектам и создает двойные разрывы на мель. В преобразование смеси, донорской ДНК, состоящей из фланговых областей и каротиноидной кассеты экспрессии гена были включены. Сборки ДНК донора были нацелены на один участок ДНК в геномной ДНК вокруг INT1(crtE),INT2 (crtYB) и INT3 (crtI) loci in vivo рекомбинации из-за присутствия 50-bp гомологических разъемов последовательностей, указано как 5, A, B, C, D или E. P1-P3, различные промоутеры; T1-T3, разные терминаторы. Эта цифра была изменена с Verwaal и др. 201819. Генетические конструкции показаны с использованием синтетической биологии Открытый язык (SBOL) Визуальные символы40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : ПЦР, проверяющая эксперименты по редактированию генома. (A) Проверка реакции клонирования Золотых ворот собранных кассет ДНК донора. Полученные результаты согласуются с ожидаемой продолжительностью. (B) PCR одного массива crRNA. (C) Линейная гамм плазмида pRN1120. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Плиты Преобразований S. cerevisiae с использованием подхода к редактированию генома мультиплекса. (A) Штамм 1, выражающий crtE, crtYB и crtI из трех сильных промоутеров (темно-оранжевые колонии). (B) Штамм 2 выражения crtE, crtYB и crtI из трех средних промоутеров силы (оранжевые колонии). (C) Штамм 3 выражения crtE, crtYB и crtI из трех низкой прочности промоутеров (желтые колонии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : ПЦР, проверяющая интеграцию кассет экспрессии донорской ДНК на предполагаемых локусов внутри геномной ДНК. (A) Проверка трех колоний штамма 1. (B) Проверка трех колоний штамма 2. (C) Проверка трех колоний штамма 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Дрожжи пиксель искусства Розалинд Франклин. (A) Черно-белая фотография RGB 220 и 280 пикселей Розалинд Франклин, которая была использована в качестве шаблона. (B) Компьютерная преобразование черно-белой фотографии Розалинд Франклин в 4-цветной список 64 и 96 пикселей. (C) Фото дрожжевого пикселя искусства с 64 и 96 дрожжей колоний с увеличенным в разделе. (D) Фото акустического жидких обработчик с двумя полными выращенных пластин. (E) Фото полной выращенной микроплиты с 64 и 96 дрожжевых колоний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Штамм 1 Штамм 2 Штамм 3
Цветные колонии 16 Год 279 220 г.
Белые колонии 16 Год 18 лет 18 лет
Всего колоний 32 год 297 Г. 238 год
Эффективность 50% 94% 92%

Таблица 1: Эффективность редактирования подхода к редактированию генома мультиплекса.

crRNA массив последовательностиa,b,c,d,e,f
CATGTTGACAGCTTATATATATATCCGGAGCTAGCATGCGCCCCTTAGAACTAGTGGCCCCCCGGGCGCGCGCGCGC ТКТТГАААА
ГАТААТАТТАТТАТАТГТГТТКТАКТАТТАТАТАСТАТАВАААКААААКТА
ТГАТАЧАТГТАКТТТТТГАТСТАГААГАГАГТАКААКТАКТАГТАТТТТГАТТГТГТГТККТЦТГГГТГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГККЧА
TTTTCACACCCTACAATGTTCTGTGTttCAAAGATTTGGTGGCAACGGgTAGAGTGAAGTTGGGGCGC
ATGTTGCGCGTCGCGAACTCTCCGCAGTGAAGATAATGATCAATCTACTACTAGTGTAGATATAT
CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTCTACTAGTGTAGATGTGCCGTAC
GCCGGAGCCGACGGAATTCTACTACTAGTGTAGATTGCCCCCtTATACGATTATATTTT
ТТТТТТТТТТТТГТККТГКТГГГГГГККККТТТТТТТГАГАГГ
GTTAATTCCGAGCTCTGGCGTAATCATGGCATAGCTTCCTGTGTGTGG
a. Гомология к pRN1120 (смелый).
b. Промоутер SNR52 (курсив).
c. Геномные целевые последовательности (подчеркнутые).
d. Руководство прямого повторяет конкретные для LbCas12a (курсив, смелый).
e. Терминатор SUP4 (курсив).
f. Гомология к pRN1120 (смелый).

Дополнительная таблица 1: Единый crRNA массив для LbCas12a, содержащий гомологию с плазмидом pRN1120.

Имя Последовательностьa Описаниеb Используется в точке
KC-101 CATGTTGACAGCTATCATC FW праймер для усиления одного массива CRRNA 2.1.4
KC-102 КАКАГАГАААКАТТАГТАКТГАКГАКТГАК Р. праймер для усиления одного массива CRRNA 2.1.4
KC-103 ААГГАктаТКККККТКТТТТГГК FW праймер для усиления донорской ДНК с разъемом 5 3.6.1
KC-104 АААГКААААГАГАГАГАГАГАГААКАК Р. праймер для усиления донорской ДНК с разъемом A 3.6.1
KC-105 CGGATCGATGTACACAACCGG FW праймер для усиления донорской ДНК с разъемом B 3.6.1
KC-106 КААГАЗГАЗГГРГГГАЗИТАТАТАК Р. праймер для усиления донорской ДНК с разъемом С 3.6.1
KC-107 ААКГТГТЦГТТТГТТАТК FW праймер для усиления донорской ДНК с разъемом D 3.6.1
KC-108 AGGTACAACAAGACCACCACCGG Р. праймер для усиления донорской ДНК с разъемом E 3.6.1
KC-109 КАКАКТАГАГАААТКТГГКТАТАТГ FW грунтовка для усиления INT1 5' с разъемом 5 4.4
KC-110 AAACGCCTGTGTGGGTGTGGGTGGTAC
TGGATATGCAAAGCGATTGGAA
ГТКГКТГАКТКТЦТЦГГТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТ
АТТЦк		 Р. грунтовка для усиления INT1 5' с разъемом 5 4.4
KC-111 TTGCCCATCGACGTACAAAG
TACTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTT
TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCC
ТТТГ		 FW грунтовка для усиления INT1 3' с разъемом A 4.4
KC-112 TGTCAACTGGAGAGCTATCG Р. грунтовка для усиления INT1 3' с разъемом A 4.4
KC-113 АГААГАТТКТЦЦААТКТКТКТКТКТКТКТКТКТ FW грунтовка для усиления INT2 5' с разъемом B 4.4
KC-114 TGCTAAGATTGTGTGTTCGTTTT
TGGGTGCGTGTGTGTGTGTGtACATCAT
CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC
TGGTTG		 Р. грунтовка для усиления INT2 5' с разъемом B 4.4
KC-115 АКГКТТЦККККТЦКТЦККА
ГАКАКАГАТТАТКККККККККККККККККККККККККККККККК
CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG
ГТГГ		 FW грунтовка для усиления INT2 3' с разъемом C 4.4
KC-116 ТКТКТКЦКГХАЦГГГгГгГ Р. грунтовка для усиления INT2 3' с разъемом C 4.4
KC-117 GGTCGTTTGTGTGCCATCATTGG FW грунтовка для усиления INT3 5' с разъемом D 4.4
KC-118 GCGGAATATTGGCGGAACGGGG
АКАКГТГГАТАЗАААККТГ
ГАКААКТТТТККААГАГГГГГГ
ААГААКГ		 Р. грунтовка для усиления INT3 5' с разъемом D 4.4
KC-119 АААТАААККАКАААКАТКТТ
CCCATGTTCGGTGCTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTTTTT
GTACCTGATGGGACGTCAGCACT
GTAC		 FW грунтовка для усиления INT3 3' с разъемом E 4.4
KC-120 ГАГКТАКТАТТАТАТАТКАТКАТКТКТКТЦ Р. грунтовка для усиления INT3 3' с разъемом E 4.4
KC-121 ГТТАКТАААКТГТАКТТЦКГТКГКГГГГКГ FW праймер для проверки интеграции con5-crtE-conA в INT1 5' 7.4.1
KC-122 КАКТОГТАКТАКТТТАКТТК FW праймер для проверки интеграции con5-crtE-conA в INT1 3' 7.4.1
KC-123 КАСТМАГААКТАГТТТАГТАГТГАГ FW праймер для проверки интеграции conB-crtYB-conC в INT2 5' 7.4.1
KC-124 ГТКЦКККККТГААТГТЦК FW праймер для проверки интеграции conB-crtYB-conC в INT2 3' 7.4.1
KC-125 CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC FW праймер для проверки интеграции conD-crtI-conE в INT3 5' 7.4.1
KC-126 ГАТКГГЦААТАГГАГАГГАГ FW праймер для проверки интеграции conD-crtI-conE в INT3 3' 7.4.1
KC-127 КТТГТЦКАГАГАГТГТК Р. праймер для проверки интеграции con5-crtE-conA в INT1 5' 7.4.1
KC-128 GCTGTCATGATGTGTGATAAC Р. праймер для проверки интеграции con5-crtE-conA в INT1 3' 7.4.1
KC-129 CTGGCAATGTTGACCAATTGC Р. праймер для проверки интеграции conB-crtYB-conC в INT2 5' 7.4.1
KC-130 CCAACGTGCCTTAAGTCTGG Р. праймер для проверки интеграции conB-crtYB-conC в INT2 3' 7.4.1
KC-131 КЦТТАКТТКТГГАГКГАГКГАГКАНГАГАГАГА Р. праймер для проверки интеграции conD-crtI-conE в INT3 5' 7.4.1
KC-132 CTGGTACTTCCCTAAGACTG Р. праймер для проверки интеграции conD-crtI-conE в INT3 3' 7.4.1
a. Смелые последовательности обозначают последовательности разъема.
b. Форвардные и обратные грунтовки обозначены как FW и RV, соответственно.

Дополнительная таблица 2: Праймер последовательности.

Supplementary Table 3
Дополнительная таблица 3: Дизайн построенных штаммов.

Supplementary Table 4
Дополнительная таблица 4: Последовательности кассет экспрессии донорской ДНК и области шелушения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Представленный протокол описывает редактирование мультиплексного генома S. cerevisiae с использованием Cas12a от бактерии Lachnospiraceae ND2006 в сочетании с единым массивом CRRNA и донорской ДНК. Подробно объясняется дизайн единого массива CRRNA и донорской ДНК. В отличие от хорошо зарекомендовавшей себя системы CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12a обладает уникальной дополнительной способностью обработки нескольких CRRN, выраженных из одного массива CRRNA13,33. Благодаря этой функции, одновременное редактирование нескольких целей легче настроить и может быть достигнуто в одной трансформации. Этот подход к единому массиву CRRNA был продемонстрирован ранее Цетше идр. 34, которые одновременно редактировали до четырех генов в клетках млекопитающих с помощью AsCas12a, и Swiat и др. 35, которые ввели четыре фрагмента ДНК в геном дрожжей с помощью FnCas12a. Насколько нам известно, большее количество одновременных геномных изменений с использованием системы Cas12a не было зарегистрировано, и максимальный предел целевых показателей на один массив для Cas12a еще не определен. Дальнейшие исследования с использованием одного crRNA массивов в сочетании с Cas12a включает в себя мультиплекс транскрипционной регуляции в широком диапазоне организмов33,36,37.

В представленном протоколе есть несколько важных шагов. Тщательно проектируйте все последовательности ДНК, которые участвуют в эксперименте по редактированию генома Cas12a, особенно в случае введения новых последовательностей ДНК. Определить функциональность новых последовательностей прокладки часть crRNA, например, с помощью эксперимента по редактированию генома singleplex, как описано Verwaal и др. 19 перед объединением их в единый массив crRNA. Следуйте рекомендациям по подготовке буферных решений преобразования, используемых в эксперименте по редактированию Cas12a для достижения хорошей эффективности преобразования дрожжей.

Есть некоторые дополнительные изменения техники. Рекомендуется использовать 1 мкг каждой донорской ДНК, линейную кассету экспрессии массива CRRNA в преобразовании, хотя использование более низкого количества ДНК также, как ожидается, приведет к удовлетворительной эффективности преобразования. Выполните тест преобразования, чтобы определить, можно ли использовать более низкие количества ДНК. Преобразование S. cerevisiae может быть осуществлено с использованием другого метода, чем тот, описанный в этом протоколе, например протокол, описанный Gietz et al. (2007) 38. Направляющий получатель РНК плазмид pRN1120 подходит для выражения одного CRRNA и одногоcrRNA массива различных вариантов Cas12a (например, от Acidaminococcus spp. BV3L6 или Francisella novicida U112), а также для выражения sgRNA в сочетании с Cas919. ДНК донора не должна ограничиваться каротиноидными генными экспрессионными кассетами и фланговыми участками, нацеленными на ДНК донора на описанные участки INT1, INT2 и INT3 в геномной ДНК. Любая ДНК, интересующаяся, может быть введена, в мультиплексном порядке, в геномную ДНК хозяина по принципам проектирования, описанным в этом протоколе, или же донорская ДНК может быть использована для удаления ДНК из генома хозяина. Модульная структура одного массива crRNA облегчает легкую регулировку прокладки и прямых повторяющихся последовательностей. Модификация последовательностей прокладки позволяет изменить предполагаемый интеграционный локус, который может быть разработан одним из инструментов для идентификации геномного целевого объекта, например, программного обеспечения GuideScan 1.039. Вместо использования больших фланговых последовательностей, содержащих последовательности разъемов, 50-bp фланговой области может быть включено в последовательности ДНК донора путем включения этих 50-bp фланговых последовательностей области в грунтовки, используемые в ПЦР. При этом всего для успешного эксперимента по редактированию генома мультиплекса требуется всего три вместо девяти фрагментов ДНК донора.

Таким образом, этот протокол предусматривает пошаговые указания для выполнения редактирования генома мультиплекса в S. cerevisiae с использованием Cas12a в сочетании с единым подходом массива crRNA. Протокол был продемонстрирован путем редактирования генома мультиплекса с использованием 9 фрагментов ДНК донора и кодирования одного массива CRRNA для трех гРНК. Мы показываем высокие общие частоты редактирования между 50% и 94% для трех конструкций деформации сообщили здесь. В заключение, уникальной особенностью Cas12a является возможность обработки одного массива CRRNA в отдельные CRRNA в клетке, что делает Cas12a отличным инструментом для редактирования мультиплексного генома и разработки транскрипционных модулей регулирования, ориентированных на несколько выражение кассеты на одном ходу. В конце концов, три штамма были получены производства каротиноидов на разном уровне и цвета в оттенках между желтым и оранжевым. С этими штаммами и дикого типа штамма, мы показали, как акустические жидкие обработчик может быть использован прямо, чтобы дрожжи пиксель искусства - это в честь Розалинд Франклин, который способствовал открытию структуры ДНК 65 лет назад ее знаменитой фотографии 5123 " /c1.

Disclosures

Авторы заявляют, что существует конфликт интересов. Авторы подали ИС, связанные с представленными методами.

Acknowledgments

Этот проект получил финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 686070 (DD-DeCaf) и 764591 (SynCrop), а также от исследовательской программы «Строительные блоки жизни» с проектом No 737.016.005 Нидерландская организация научных исследований (НВО). T.E.G. была поддержана Королевским обществом (грант UF160357) и BrisSynBio, Исследовательским центром синтетической биологии BBSRC/EPSRC (грант BB/L01386X/1). Мы благодарим Ци Ди и Джеффри ван Wijk за их вклад в дрожжи пятнистость экспериментов для создания дрожжевого пикселя искусства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018 Electrophoresis
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl) New England BioLabs R353L Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer New England BioLabs B7204S Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma Aldrich D1626 Transfromation of
S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs Invitrogen 10297018 PCRs
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis Merck 100983 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid Sigma Aldrich ED Transformation of
S. cerevisiae
G418 disulfate salt Sigma Aldrich A1720 Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz Sigma Aldrich D2158  Yeast pixel art
Isopropanol Merck 100993 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate Sigma Aldrich L6883 Transformation of
S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain Sigma Aldrich 1494 Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells New England BioLabs C3019H Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin Jena Bioscience AB102 Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer New England BioLabs M0530L PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530L PCRs
Polyethylene glycol 4000 Merck 7490 Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye New England BioLabs B7024S Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix Thermo Fisher Scientific AM2286 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer Invitrogen 46300-018 Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl) Invitrogen 1705218 Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500 Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit Promega A9282 Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol New England BioLabs R0146S Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) Zymo Research E1006 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer Zymo Research E1004-B Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar Plate growth of E. coli
2*PY medium Cultivation of E. coli
Demineralized water Transformation of
S. cerevisiae
ELFO buffer Electrophoresis
MQ Multiple steps
Physiological salt solution Transformation of
S. cerevisiae
TE buffer Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar Plate growth of
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067 Addgene ID 101748 https://www.addgene.org/
pRN1120 Addgene ID 101750 https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN.PK113-7D		 EUROSCARF collection http://www.euroscarf.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  2. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  3. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  4. Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system. Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).
  5. Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).
  6. Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
  10. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).
  11. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), (2016).
  12. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  13. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  14. Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).
  15. Ferreira, R., et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).
  16. Swarts, D. C., Martin, J. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).
  17. Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).
  18. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  19. Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).
  20. Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).
  21. Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3 (11), 3647 (2008).
  22. Yeast Art project. , Available from: http://www.yeastart.org (2018).
  23. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  24. Watson, J. D., Crick, F. H. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 171, 737-738 (1953).
  25. Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature. 171, 738-740 (1953).
  26. Young, E. M., et al. Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast. Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).
  27. Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. Cloning Method. , WO2013144257 (2013).
  28. Mandel, M., Higa, A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).
  29. Van Dijken, J. P., et al. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).
  30. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).
  31. Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).
  32. Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).
  33. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  34. Zetsche, B., et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).
  35. Swiat, M. A., et al. FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).
  36. Li, L., et al. CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces. Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell Discovery. 3, 17018 (2017).
  38. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).
  39. Perez, A. R., et al. GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design. Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).
  40. Cox, R. S., et al. Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0. Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).

Tags

Биоинженерия Выпуск 147 CRISPR/Cas12a CRISPR/Cpf1 CRISPR/Cas9 редактирование генома мультиплекса Saccharomyces cerevisiae искусство пикселей дрожжей
CRISPR/Cas12a Multiplex Геном Редактирование <em>Saccharomyces cerevisiae</em> и создание дрожжевого искусства пикселей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski,… More

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski, T. E., Roubos, J. A., Verwaal, R. CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art. J. Vis. Exp. (147), e59350, doi:10.3791/59350 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter