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Bioengineering

CRISPR/Cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造

Published: May 28, 2019 doi: 10.3791/59350
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 1
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

Summary

CRISPR/Cas12aシステムは単一のcrRNA配列と結合して複数の遺伝子座のS.セレビシエのゲノムの有効な多重編集を同時に可能にする。これは、その後、酵母ピクセル技術を作成するために使用される酵母株を生産するカロテノイドを構築することによって実証されます。

Abstract

クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)システムの高効率、使いやすさ、汎用性は、サッカロマイセスセレビシエの高度な遺伝子改変を促進しました。産業バイオテクノロジーにおける生物と馬力。CRISPR関連タンパク質12a(Cas12a)は、Cas9と区別できる特徴を有するRNA誘導エンドヌクレアーゼを本研究に適用し、ゲノム編集目的の分子ツールボックスをさらに拡張する。CRISPR/Cas12aシステムの利点は、単一の転写単位(単一のCRISPR RNA(crRNA)配列)から発現される複数のガイドRNAを用いた多重ゲノム編集で使用できることです。我々は、単一のcrRNA配列構築物から発現される複数のcrRNAを用いたCRISPR/Cas12aシステムを用いて、S.セレビシエゲノムの独立遺伝子に複数の異種遺伝子を多重統合するためのプロトコルを提示する。提案された方法は、S.cerevisiaeがDNA断片の生体内組み換えで行う能力を利用して、単一のcrRNAアレイを形質転換剤の選択に使用できるプラスミドに組み立てるだけでなく、ドナーDNAの組み立てを行う。意図した位置でゲノムに統合する配列。Cas12aは構成的に事前に発現され、単一crRNAアレイの発現時に意図された位置でS.セレビシエゲノムの切断を促進する。このプロトコルには、単一のcrRNAアレイとドナーDNA発現カセットの設計と構築が含まれており、ユニークな50bp DNAコネクタ配列と個別の統合フランクDNA配列を利用した統合アプローチを活用し、簡素化します。標準化とモジュール化を通じた実験設計を行い、幅広い用途に対応します。最後に、異なる色のカロテノイドを使用して、構築された酵母株を生成する音響液体ハンドラを用いて酵母ピクセルアートを作成するための簡単な技術を示す。

Introduction

CRISPR/Cas酵素は間違いなく分子生物学に革命を起こしており、これまで実現不可能だった速度でゲノムを工学的に使用するツールとして広く採用されています。CRISPR/Cas9ゲノム編集システムによるサッカロマイセスセレビシエゲノムの最初の改変は、DiCarloらによって報告された。2、成功した遺伝子ノックアウトを実証し、外部導入されたオリゴヌクレオチドを用いて点突然変異を行う。さらに酵母CRISPRツールボックスの開発が含まれています:触媒的に不活性な死んだCas9(dCas9)と転写エフェクタードメインの融合による転写調節3、両方のアプリケーション同時活性化、抑圧および欠失による代謝経路工学のゲノム編集および調節機能4, S. セレビシエゲノム5からの大きな断片の欠失, および多発染色体融合6.

CRISPR/Casゲノム編集システムは、細菌や考古学の適応免疫系に起源を見出し、これらのシステムはゲノム編集のために分子生物学者によって適応されています。その機能は、外来DNAまたはRNAの認識を担うRNAをコードするクラスター化された定期的な間隔異動性短いパリンドロミックリピート(CRISPR)DNA領域と、RNA誘導をコードするCRISPR関連遺伝子(Cas)に基づいています。エンドヌクレアーゼ1,7,8,9.CRISPR/Casシステムの最近のゲノム解析に基づいて、CRISPR/Casシステムを2つのクラス、5種類と16のサブタイプ10に分割することが提案された。2つのクラスは、ターゲット切断に関与するエフェクター複合体の組織に基づいて区別されます。通常、複数サブユニット組織を持つ CRISPR/Cas システムはクラス 1 として分類されますが、単一サブユニット エフェクタ 複合体はクラス 210,11に属します。本稿では、クラス2型V Cas12a(以前はCpf110、12と呼ばれていた)について、クラス2型II Cas9に代わる方法を検討する。Cas9は、よく特徴付けられており、研究で広く使用されていますが、Cas12aは追加機能12を提供しています。まず、Cas12aは、追加のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を必要とせずに、42〜44ヌクレオチドのCRISPR RNA(crRNA)との複合体を形成する。従って、CRISPR/Cas12aシステムとのゲノム編集に短いガイドRNAを利用できる。.CRISPR/Cas9と比較して。第二に、Cas12aのユニークなエンドナクレアーゼおよび内因性内因性リース活性は、その前crRNA13の成熟を可能にする。このRNase活性は、単一のCRISPR crRNAアレイ上の複数のcrRNAの符号化を可能にしますが、Cas9は、いわゆるシングルガイドRNA(sgRNA)または追加のエンドヌクレアーゼ(例えば追加のエンドヌクレアーゼの発現を別々に発現する必要があります)例えば、Csy4)は、各sgRNA14、15を取り囲むCsy4の認識モチーフと組み合わせて。第三に、Cas12aターゲットサイト認識は、ターゲットからの5'端の5'端にプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とし、そのPAMからの+18/+23位置の後に切断され、粘着性のある端を持つDNAが切断されますが、Cas9は3'端から3'端に位置するPAMを必要とします。DNA12の鈍い端の切り傷を作成する -3 位置の後にターゲットと切断.第四に、PAMのコンセンサスヌクレオチド配列は、Cas12a(((T)TTV)とCas9(NGG)の間で異なり、これはCas12aをTリッチプロモーターおよびターミネータ配列16を標的とする有望な候補としている。最後に、最近の研究では、ネイティブのCas917よりもCas12aのターゲット特異性が大きいことが報告されました。

S.セレビシエのゲノム編集にCRISPR/Cas12aシステムを用いるためのプロトコルを提示し、複数のDNA発現カセットを独立ゲノム遺伝子座に同時に導入することに重点を置く(多重ゲノム編集)。単一の crRNA アレイ。プロトコルの主要な手順を図 1に示します。概念実証として、CRISPR/Cas12aシステムは、図2に概略的に示すようにβ-カロテン18の産生を可能にするS.セレビシエのゲノムに3つの発現カセットを導入するために適用された。β-カロチエンの産生は、S.セレビシエの表現型に影響を与える:すなわち、カロテノイド生合成に必要な3つの不発遺伝子の導入に成功すると、白色S.セレビシア細胞は黄色またはオレンジ色に変わり、各遺伝子のプロモーターの発現強度に応じて。この経路の簡単な視覚的読み出しのために、それはゲノム編集のための高度なCRISPRベースのシステムおよび方法を開発するために導入された19、20.本研究では、カロテノイド遺伝子crtE、crtYBおよびcrtIをコードする発現カセットは、異種プロモーターおよび相同ターミネータを用いたゴールデンゲートクローニング(GGC)アプローチ21を用いて構築された。 遺伝子の発現を駆動するために使用されます。式カセットは、コネクタと呼ばれるユニークな50塩基対(bp)配列で囲まれ、同じ50bp配列を持つ統合フランクDNA配列(フランク領域)を持つ生体内アセンブリを可能にし、その後の統合側位領域によって決定される位置で酵母のゲノムDNAに。異なるプロモーター強度を用いることによって、カロテノイド産生の異なるレベルを持つ株が得られ、細胞の色の変化をもたらした。「酵母アートプロジェクト」22に触発されたこれらの株は、ロザリンド・フランクリンの4色の高解像度「酵母写真」を作成するために、音響液体ハンドラを備えたスポッティングセットアップで使用されました。フランクリン(1920-1958)は、写真51 23、24、25によるDNA構造の発見に彼女の貢献でよく知られている英国の化学者とX線結晶学者でした。

Protocol

1. Cas12aプラスミドの調製

注:ラクノスピラセア菌ND2006 Cas12a(LbCpf1、pCSN067)を含むプラスミドは、S.セレビシエにおける発現用に最適化されたコドンを、以前に19個構築し、プラスミドリポジトリに堆積した(表を参照)。材料)。これは、遺伝性に対するS.セレビシエ形形質転換剤の選択を可能にするKanMX耐性マーカー遺伝子を含む単一コピーエピソードS.セレビシエ/大腸菌シャトルプラスミドである(G418)。

  1. pCSN067プラスミドを入手してください(材料の表を参照)。
  2. pCSN067プラスミドを増幅し、高量に得る。
    1. メーカーのプロトコルに従ってプラスミドpCSN067で購入した化学的に有能な大腸菌細胞の25 μLを変換します。形質転換ミックスを2倍ペプトン酵母(PY)で10回及び50回希釈する。アンピシリン(0.1g/L)を含む2x PY寒天プレートに10xおよび50x希釈をプレートアウトし、37°Cで一晩インキュベートします。
    2. 2~3個のコロニーを選び、各コロニーを2x PYの3mLで接種し、180rpmで振るインキュベーターで37°Cで一晩成長します。
    3. 製造元の指示に従ってプラスミド精製キットを使用してプラスミドを浄化します。

2. 単一crRNAアレイ発現カセットの調製

  1. 単一 crRNA アレイを準備します。
    注:単一crRNAアレイは、S.セレビシエ2からのSNR52 RNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、LbCas12aおよびスペーサーに特異的な直接繰り返し(ゲノム標的配列)を、各標的19と終了ごとに繰り返し行うS. セレビシエ2からのSUP4ターミネータを使用します。単一crRNAアレイは、線形化プラスミドpRN1120に生体内組み合わせによって組み立てられ、円形プラスミドを生成するため、プラスミドpRN1120に相同な領域は、単一crRNAアレイの開始時と終了時に存在する必要があります(図2A参照)。).設計されたcrRNAの数の機能を個別に19を事前に評価することをお勧めします。この情報は、次に、ほとんどの機能的crRNAを選択して、これらを直接繰り返し配列とスペーサー配列に結合し、多重化目的で単一のcrRNA配列を作成するために使用されます。
    1. 多重ゲノム編集実験用の単一crRNA配列を合成DNAとして注文する(補足表1の単一crRNA配列のDNA配列を参照)。
    2. 順序付けされた単一crRNA配列(例えば、プライマーKC-101およびKC-102(補足表2)を使用して)を増幅する。PCR増幅ミックスを調用する:DNAポリメラーゼの0.5 μL、DNAポリメラーゼに必要な5倍バッファーの10 μL、10mM dNTPの1μL、10μMフォワードプライマーの2.5 μL、10μM逆プライマーの2.5 μL、5μLの濃度でのDNAテンプレートの2μL2最大50 μLの総容積まで。
      1. 次のプログラムを用いてサーモサイクラーで反応を行う:(i)98°Cを3分間、(ii)98°Cを10s、(iii)60°Cを20s、(iv)72°Cを15sで繰り返し(ii)から(iv)30回、(v)72°Cを5分間(vi)で5分間保持する。
    3. 100~10,000 bpの範囲のDNA断片を用いてDNAローディング色素とDNAラダーを用いて、0.8%のアガロースゲルを5V/cmで40分間実行することにより、電気泳動によるPCR製品を分析します。
    4. 製造元の指示に従って、PCR精製キットを使用してPCR製品を精製します。
  2. 単一crRNAアレイレシピエントプラスミドを準備します。
    注:単一crRNAアレイは、S.セレビシエ/大腸菌シャトルプラスミドpRN112019から発現される(材料の表を参照)。このマルチコピープラスミドは、ナルセオトリシン(NTC)上のS.セレビシエ形質転換剤の選択を可能にするNatMX耐性マーカー遺伝子を含有する。
    1. pRN1120プラスミドを得る。
    2. pRN1120プラスミドを増幅し、高量を得る。
      1. 製造元のプロトコルに従ってプラスミドpRN1120で購入した化学的に有能な大腸菌細胞の25 μLを変換します。変換ミックスを2x PYで10回と50回希釈します。アンピシリン(0.1g/L)を含む2x PY寒天プレートに10xおよび50x希釈をプレートアウトし、37°Cで一晩インキュベートします。
      2. 2~3個のコロニーを選び、各コロニーを2x PYの3mLで接種し、180rpmで振るインキュベーターで37°Cで一晩成長します。
      3. 製造元の指示に従ってプラスミド精製キットを使用してプラスミドを浄化します。
    3. エコRI-HFおよびXhoIでプラスミドpRN1120を線形化する。このために、pRN1120の1 μg、10倍バッファーの5μLからなる消化ミックスを調製する(1xバッファーには50mM酢酸カリウム、20mMの酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、100μg/mLウシ血清アルブミン[BSA];pH7.9)の100μg/mLのエブセルミンを含む。. 、XhoI(20U)と超純性H2Oの1 μLを50μLの総体積までインキュベートし、消化ミックスを2時間37°Cでインキュベートし、65°Cで20分間不活性化します。
    4. 100~10,000 bpの範囲のDNA断片を持つDNAローディング染料とDNAラダーを用いて、アガロースゲル上の電気泳動(0.8%、40分、5V/cm)で線形プラスミドを分析します。対照として、分析中に円形プラスミドを含む。
    5. メーカーの指示に従ってPCR精製キットを使用して線形プラスミドを浄化します。

3. プロモーター-ORFターミネーター(POT)ドナーDNA構築物の調製

  1. 異なる強度、開いた読み取りフレーム(O)およびターミネータ(T)配列のセットを合成DNAとして注文し、各要素にBsaI部位によって隣接する標準化された4-bp認識配列が含まれているように、ゴールデンゲートクローニングを可能にする(GGC) アセンブリ26 (補足表 3の詳細な設計と補足表 4のシーケンスを参照)。
  2. プロモーター、開いた読み取りフレーム、ターミネータ、コネクタシーケンスで構成されるPOT式カセットをGGC反応21を使用して4部構成のアセンブリを介して、事前に指定された50bpコネクタシーケンスを既に含んでいる宛先ベクトル((補足表 4および参照26,27を参照してください。
    1. 分光光度計を用いてDNA部品の濃度を測定します。超純性H2Oの各DNA部を15fmol/μLの最終濃度に希釈する。
    2. DNA断片からなる反応ミックスを調べる:プロモーターの2μL、開いた読み取りフレームの2μL、ターミネータの2μLおよび2 μLのバックボーン(26で説明したようにレベル1の起点ベクター)、5x T4 DNAリゲスバッファーの4 μL、1 U/μL T4 DNA Ligaseの2.5 μL、20 U/μL BsaI-HF および超純物 H2O の 1.5 μL を最大 20 μL の総容積まで。
    3. 次のプログラムを使用してサーモサイクラーでGGC反応を行います:(i)37°Cを2分間、(ii)16°Cを5分間繰り返しステップ(i)および(ii)50回、(iii)50分間、(iv)80°Cを45分間、(v)さらに分析するまで12°Cで保持します。
  3. メーカーのプロトコルに従ってGGC反応ミックスの3 μLで購入した化学的に有能な大腸菌28細胞の25 μLを変換します。変換ミックスを2x PYで10回と50回希釈します。アンピシリン(0.1g/L)を含む2x PY寒天プレートに10xおよび50x希釈をプレートアウトし、37°Cで一晩インキュベートします。
  4. 2~3個のコロニーを選び、各コロニーを2x PYの3mLで接種し、180rpmで振るインキュベーターで37°Cで一晩成長します。
  5. 製造元の指示に従ってプラスミド精製キットを使用してプラスミドを浄化します。
  6. POT式カセットがPCRによるGGC反応で正しく組み立てられているかどうかを確認します。
    1. 各式カセットの先頭と末端に存在するコネクタ シーケンスを補完するプライマーを設計します (図 2Bを参照)。このプロトコルで選択されたコネクタの場合は、プライマー KC-103 から KC-108 を使用します (補足表 2を参照)。
    2. 含有する各プラスミドに対するPCR増幅ミックスを調出す:0.5 μLの校正DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼに必要な5倍のバッファーの10 μL、10mM dNTPの1μL、10μMフォワードプライマーの2.5 μL、10μM逆プライマーの2.5 μL、2μLのDNAテンプレートを調べた。5 ng/μLのイオン、および超純性H2 Oの総容積は50 μLである。
    3. 次のプログラムを使用してサーモサイクラーでPCR反応を実行する:(i) 98 °C 3分、(ii) 98 °C 10s、(iii) 60 °C 20 s、(iv) 72 °C 2分30sの繰り返しステップ(ii)を(iv)30回、(v)72°Cを5分間、(vi)は、さらなる分析まで12°Cで保持します。
      注:結果として得られるPCR製品は、5'コネクタの50bp、プロモーター、開いている読書フレーム、ターミネータ、3'コネクタの50bpで構成されています。
  7. 100~10,000 bpの範囲のDNA断片を用いてDNAローディング色素とDNAラダーを用いて、0.8%のアガロースゲルを5V/cmで40分間実行することにより、電気泳動によるPCR製品を分析します。

4. コネクタ配列を含む統合フランクDNA配列の調製

  1. 野生型S.セレビシエCEN.PK113-7D29からゲノムDNAを精製する。
    1. 酵母エキスペプトンデキストロース(YEPD、2%グルコース)培地を100mLで満たした500mLのシェイクフラスコでひずみを30°Cで成長させ、250rpmで48時間振る。
    2. 1分間16,000 x gで2mLのブロスの遠心分離によって細胞を収穫し、上清を廃棄する。
    3. RNase(10 μL、10 mg/mL)および酵母溶解酵素(4 μL)を用いて、生理塩(200 μL;0.85%NaCl溶液)で細胞を再中断します。細胞懸濁液を37°Cで15分間インキュベートします。
    4. 300 μLの細胞溶解溶液(材料の表を参照)と渦をまもなく追加します。
    5. タンパク質沈殿溶液の168 μLを加え(材料の表を参照)、渦を20秒間激しく加えます。
    6. 16,000 x gと 4 °C での遠心分離によってタンパク質分画を 10 分間分離し、新しいチューブに 600 μL の上清を収集し、600 μL のイソプロパノールと渦をすぐに混合します。
    7. 室温16,000×16,000×10分でDNAを回収し、上清を捨て、ペレットを保管します。
    8. ペレットを200μLのエタノール(70%)で洗浄します。室温16,000 x gで10分間遠心分離機を使用し、上清を除去します。蓋を開けた後、室温でチューブを10分間インキュベートしてエタノールを蒸発させる。
      注: チューブ内の液体がまだ見える場合は、ステップ 4.1.8 を繰り返します。DNAの溶解度の低下を防ぐために、ペレットを10分以上乾燥させないようにしてください。
    9. TE バッファーの 50 μL で DNA を溶解します。精製されたDNAを4°Cに保存します。
  2. 各統合部位について、ドナーDNAの導入時に約1000bpのゲノムDNAが除去されるような設計統合フランクDNA配列(約500bp)を参照してください(図2Bの概略設計と補足の配列を参照)。 表4)
  3. PCR によって側面領域を生成するプライマーを設計します。
    1. 左側面領域については、目的の統合部位の5'(左)に位置するゲノムDNA領域の約500bpを増幅するように前方および逆プライマーを設計する。
      注:フォワードプライマーには、意図した側面領域を持つ相同学の20 bpが含まれています。リバースプライマーは、意図された側面領域との相同性を持つ20 bpを含み、後でゲノム上のCas12a編集で生体内アセンブリで有効にするために所望の50bpコネクタシーケンスが含まれています。
    2. 右側面領域の場合、目的の統合部位の3'(右)に位置するゲノムDNA領域の約500bpを増幅するように前方および逆プライマーを設計する。
      注:フォワードプライマーは、意図された側面領域と相同性を持つ20 bpを含み、後でゲノム上のCas12a編集で生体内アセンブリで有効にするために必要な50bpコネクタシーケンスが含まれています。逆プライマーは、意図された側面領域と相同学の20 bpを含む。
  4. 設計されたプライマー(例えば、補足表2に同封されるKC-109からKC-120)で側面領域を増幅する。
    1. PCRのテンプレートとして機能する精製ゲノムDNAの濃度を測定します。DNA濃度を50ng/μLに調整します。
    2. ステップ4.1で精製されたゲノムDNA(50 ng/μLゲノムDNA希釈の1-4 μL)からなるPCR増幅ミックスを調用し、フォワードとリバースプライマー(各10μM)、1μLの1μL、DNAポリメラーゼに必要な5倍のバッファーの10 μL、DNAポリマーの0.5μL(0.5μL)を調出す。、および超純粋なH2 Oは50 μLの総容積までである。
    3. 次のプログラムを使用してサーモサイクラーでPcRを実行する: (i) 98 °C 3 分, (ii) 98 °C 20 s, (iii) 60 °C 20 s, (iv) 72 °C 15 s, (iv) に繰り返しステップ (ii) 30 回, (v) 72 °C 5 分間、(vi)は、さらなる分析まで12°Cで保持します。
  5. 100~10,000 bpの範囲のDNA断片を持つDNAローディング色素とDNAはしごを用いて、5V/cmで0.8%のアガロースゲルを電気泳動で分析します。
  6. 製造元の指示に従って、PCR精製キットを使用して正しいPCR製品を精製します。

5. S.セレビシエへの変容

注: Gietz らによって開発されたメソッドに基づいてプロトコルを使用して変換を実行します。(1995年)30とヒルら.S.セレビシエの様々な株に使用することができる31.以下に説明するプロトコルは、1 変換に対して十分です。

  1. 変換に必要なソリューションを準備します。
    1. 次のストックソリューションとフィルタ殺菌を準備する:100 mMトリス-HCl(pH 7.5)、10 mM EDTA、50 mLの総容積を含む10x TEバッファ。pH 7.5で1 M LiAc、50 mLの総容積;50% PEG 4000、100 mLの総容積。
      注:PEG 4000ストックがpH 5であることを常に確認してください。この在庫は1ヶ月以上保管しないでください。
    2. 株式を使用して次の解決策を準備する:0.1 M LiAc、10 mMトリス-HCl、1 mM EDTA、0.5 mLの総容積を含むLiAc-TEソリューションを準備します。40%PEG 4000、0.1 M LiAc、10 mMトリス-HCl、1mM EDTA、1 mLの総容積を含むPEG-LiAc-TE溶液を調製します。
      注:PEG-LiAc-TEおよびLiAc-TEソリューションが新たに準備された変革を成功させるには不可欠です。
  2. 最初の変換ラウンド(Cas12aを事前に発現する歪みを調製)。
    注:すべての変換ステップで、pHが5より大きい水を使用します。変換のすべてのステップで脱塩水を使用することをお勧めします。
    1. 株CENを成長することにより、前培養を準備します。20 mLのYEPD(2%グルコース)培地を含む100mLのシェイクフラスコ中のPK113-7Dを、250rpmで振盪して30°Cで一晩インキュベートする。
    2. プレカルチャのOD600(OD PC)を測定する。形質転換に使用する前培養量と細胞の調製に必要な新鮮な培地の体積との間の希釈係数(df)を計算する。計算では、変換培養の光学密度(ODtc)は、5.2.3 (ti) で説明したインキュベーションステップの後に 1.0 であると仮定します。
      Equation 1
      ここで、tiと τ はそれぞれインキュベーション時間と倍倍の時間です。
      1. 希釈因子に基づいて、変換培養(Vtc)の接種に必要なプレカルチャ(Vi)の体積を計算する。
        Equation 2
    3. 前工程で決定した前培養量(Vi)でYEPDの20mL(2%グルコース)(Vtc)を接種して形質転換培養を調製する。250 rpmで振って30°Cでインキュベートします。
    4. 1.0 の OD600に達するまで、変換カルチャの OD600を測定します。
    5. 20 mLのブロスを2,500×5分で遠心分離して収穫し、上清を捨て、室温脱塩水の20mLで細胞を洗う。 遠心分離ステップを繰り返し、セルペレットを保持します。
    6. LiAc-TE溶液の100μLで細胞を再中断し、マイクロ遠心管に移す。
    7. 一本鎖キャリアDNA(10mg/mLサケ精子DNA)の5 μLを追加し、ピペッティングで混合します。
    8. マイクロ遠心管にプラスミドpCSN067のピペット1 μg。
      注:DNA混合物の総体積は、より低い変換効率を防ぐために100 μLを超えてはなりません。
    9. PEG-LiAc-TE溶液を600μL加え、ピペッティングで混ぜます。テーブルトップヒートブロックで450rpmで振りながら、30°Cで30分間インキュベートします。
    10. DMSO の 70 μL を追加する (100%)変換混合物にし、ピペッティングによって混合します。水浴中で42°Cで15分間形質転換混合物をインキュベートしてヒートショックを行う。
    11. 混合物を15mLの丸底チューブに移して細胞を回収し、10mLのYEPD(2%グルコース)をチューブに加えます。250 rpmで振りながら30°Cで一晩インキュベートします。
    12. 2,500 x gで5分間の形質転換ミックスを遠心分離し、上清を廃棄し、残りの溶液の約200μLで細胞ペレットを再懸濁する。
    13. 変換ミックスの150 μLをプレートアウトし、0.2g/L G418を補充したYEPD(2%グルコース)上の変換ミックスのYEPD(2%グルコース)の20x希釈を行う。プレートを30°Cで48~72時間インキュベートします。
    14. 単一の形質転換剤を選び、0.2 g/L G418を補充したYEPD(2%グルコース)寒天プレートに再ストリークして、単一のコロニーを得ます。
  3. 2回目の変換ラウンド(CRISPR/Cas12aで多重ゲノム編集を行います)。
    1. 第1形ラウンド(ステップ5.2)で作成された株を予現するCas12aを成長させることにより前培養を行い、0.2g/L G418を補充した20mLのYEPD(2%グルコース)培地を含む100mLのシェイクフラスコに入れる。250 rpmを振って30°Cで一晩インキュベートします。
      注: 複数の変換の場合は、プレカルチャのボリュームを調整します。
    2. 最初の変換ラウンドの手順 5.2.2 ~ 5.2.7 に従います。
      注:複数の変換の場合は、必要なソリューションの量と、Cas12aを事前に発現する歪みの培養量を調整します。
    3. 単一crRNAアレイのピペット1μg、crRNAアレイに対する線形化レシピエントプラスミドの1μg、マイクロ遠心管内の各横分領域の1μg(ステップ4.3)。
      注:DNA混合物の総体積は、より低い変換効率を防ぐために100 μLを超えてはなりません。
    4. 変換のための次のコントロールを準備します: 負のコントロール (超純粋な H2O)。変換効率の決定のための正の制御(円形pRN1120の1 μg);ドナーDNAの導入がCRISPR編集を介して行われるかどうかを検証する制御(円形pRN1120の1 μg、すべてのドナーDNA発現カセットの1 μg、横分部領域の1 μgが、単一のcrRNAアレイなし)。ドナーDNAが標的の外側に統合できるかどうかの制御検証(線形化pRN1120の1 μg、ドナーDNA発現カセットの1 μg、単一crRNAアレイの1μgが横分け領域なし)。pRN1120の完全な線形化を検証する制御(線形化pRN1120の1 μg)。
    5. 最初の変換ラウンドの手順 5.2.9 から 5.2.12 に従います。
    6. 0.2g/L G418および0.2g/L NTCを補充したYEPD(2%グルコース)上の変換ミックスの変換ミックスの150μLおよび20x希釈をプレートアウトした。適切な選択(G418および/またはNTCまたは選択なし)を補完するYEPD(2%グルコース)寒天上のプレートアウトコントロール。プレートを30°Cで48~72時間インキュベートします。
    7. 単色の形の変圧剤を選び、YEPD(2%グルコース)寒天プレートに再ストリークして、単一の色のコロニーを得ます。

6. ゲノム編集効率の評価

  1. 変換プレート上の色付きコロニーと白いコロニーの数をカウントします。
  2. 表 1に示すように、色付きコロニーの数をコロニーの総数 (白と色の両方) で割ってゲノム編集効率を計算します。

7. 目的の遺伝子座におけるドナーDNAの統合の確認

  1. G418およびNTC選択なしのYEPD(2%グルコース)寒天板上の形質転換プレートから着色された単一コロニーを再ストリークし、30°Cで48時間インキュベートする。
  2. 単一のコロニーを選び、100 mLのYEPD(2%グルコース)培地で満たされた500 mLシェイクフラスコを接種します。30°Cで48時間インキュベートし、250rpmで振ります。
  3. セクション4.1に記載されているようにゲノムDNAを分離する。
    注:または、以前にLookeらによって提案されたコロニーPCR用酵母の調製のためのプロトコルを使用してください。32.この場合、液体培地(セクション7.2)の成長はスキップすることができます。
  4. 統合式カセットごとに2つのフラグメントを増幅して正しい統合を検証します。
    1. 形質転換された側面領域および目的遺伝子の外側のゲノムDNAにアニールするプライマーを設計する(補足表2、KC-121からKC-132の例を参照)。プライマーKC-121をKC-132に使用する場合は、PCRプログラムのアニーリング温度を62°Cに設定します。
    2. セクション 4.4.2 に記載されているように、関心のある領域を増幅します。PCRプログラムを適応させ、具体的にはDNAポリメラーゼのテンプレートとメーカーの推奨事項の長さに応じてPCRの延長ステップの時間を調整します。
  5. 100~10,000 bpの範囲のDNA断片を持つDNAローディング染料とDNAラダーを用いて、アガロースゲル(0.8%、40分、5V/cm)の電気泳動によるPCR製品のサイズを確認します。

8. 音響液体ハンドラを用いて酵母ピクセルアートを作成

  1. 酵母ピクセルアートの画像テンプレートを準備します。
    1. 元の RGB 画像のサイズを変更します (220 × 280 ピクセル、代表的な結果を参照)、たとえばImageJ を使用して最終的な 64 × 96 ピクセル (幅 × 高さ) グレースケールの画像を意図した色で視覚化します (代表的な結果)。
    2. 次の数式を使用して、RGB 画像をグレースケールに変換します。
      Equation 3
      ここで私はgr、私はr、私はg、私はbは、それぞれ灰色、赤、緑と青の強度です。
    3. ピクセルを分類するために、次のルールを適用する ImageJ プラグインを開発します: (a) 私が≤ 64 の場合は、このピクセルに濃いオレンジ色の酵母 (ひずみ 1、補足表3) を使用します。(b) 64 < Igr ≤ 128 の場合は、このピクセルにオレンジ酵母 (ひずみ 2、補足表3) を使用します。(c) 128 < Igr ≤ 192 の場合は、このピクセルに黄色の酵母 (ひずみ 3、補足表3) を使用します。(d) 192を取る場合は、白酵母(CEN.このピクセルの PK113-7D) 。
  2. 酵母細胞をスポットして、酵母ピクセルアートを作成します。
    1. 100mLのYEPD(2%ブドウ糖)培地を含む500mLのシェイクフラスコを、S.セレビシエ株と野生型CENを産生する3つの異なる色のカロテノイドを含む接種する。PK113-7D250 rpmで振りながら30°Cで一晩培養する。
    2. 一晩培養物の0.5mLを無菌非イオン密度勾配媒体の0.5mLで満たされた管に移す(材料の表を参照)。簡単に渦を混ぜて混ぜます。
    3. 細胞懸濁液を適格な貯蔵所、2 x 3ウェルに移す。適格な貯水池のソースプレートから、50 mLのYEPD(2%グルコース)寒天を含むマイクロプレート(材料の表を参照)に音響液体ハンドラ器具を使用してスポッティングを行います。めっきを簡素化するには、プレート上の井戸を定義します。マイクロプレートを6144ウェルプレート(64×96)として使用します。
    4. 流体キャリブレーション設定6RES_AQ_GPSA2を使用して、2x 3ウェルリザーバーソースプレートから各S.セレビシエ株のスポット25 nLを宛先マイクロプレート上に表示します。これらの 25 nL 液滴を、ウェル位置 (A01、B01、C01 など) に変換される 64 x 96 グリッドのピクセルとして定義します。
    5. マイクロプレートを30°Cで48時間インキュベートします。株の色を強くするために、少なくとも72時間4°Cで寒天プレートを格納する。

Representative Results

CRISRP/Cas12aを用いた多重ゲノム編集のためのプロトコルは、crtE、crtYBおよびcrtI遺伝子を発現するS.セレビシア株を産生する3つのカロテノイドを構築することによって実証された。高、中、低強度:歪み1、2および、それぞれ3(補足表3)。これらの株の構築は、ゲノムDNA中の3つの異なる遺伝子座を標的にするために、3つのドナーDNA発現カセットおよび6つの側面領域の生成を必要としました(図2B参照)。本明細書に記載されているように、プロモーター、開いた読み取りフレーム、ターミネータおよび2つの連続した50bpコネクタシーケンスは、ゴールデンゲートクローニング反応を介して式カセットに組み立てられ、アセンブリをPCR(図3A)によって検証した。単一crRNAアレイを合成DNA断片として発注し、PCR(図3B)により増幅した。単一crRNAアレイ(プラスミドpRN1120)に対するレシピエントプラスミドをEcoRI-HFおよびXhoIで線形化し、電気泳動により線形化を確認した(図3C)。導入されたドナーDNA発現カセットおよび横面領域の設計およびヌクレオチド配列は、補足表3および補足表4に示されている。単一 crRNA 配列式カセットの配列は、補足表 1に示されています。単一crRNA配列に含まれるスペーサーの機能性は、個々のcrRNA19を使用したシングルプレックスゲノム編集によって事前に試験された。

Cas12aを用いたゲノム編集の効率は、まず、形質転換後に得られた着色コロニーの数に基づいて評価された(表1、図4)。3つの構築された株の編集効率は50%から94%に変化した。特に、株1を生成するために使用される発現カセットの導入は、ドナーDNAの性質によって引き起こされる可能性のある最も低い編集効率を示した(すなわち、これらの発現カセットはcrtE、crtYBおよびcrtIをコードする) 3つの高強度プロモーターから)。第二に、ゲノムDNA上の目的の遺伝子座における3つのドナーDNA発現カセットの正しい統合をPCR(図5)によって確認した。プライマーは、意図した遺伝子座でドナーDNAの正しい統合が発生したときにPCR産物が得られるような方法で設計された。各変換実験について、8つのコロニーを変換プレートから選択し、テストしました(図5に示すのは3つだけです)。一般に、ドナーDNA当たり試験された8つのコロニーのうち、INT1遺伝子座におけるcrtEドナーDNAの正しい統合、INT2イナクでのcrtYBおよびINT3遺伝子座におけるcrtIIは、形質の90%で確認された。これらの結果は、CRISPR/Cas12aシステムを単一のcrRNAアレイと組み合わせることで、複数の遺伝子座におけるS.セレビシエゲノムの効率的な多重編集を同時に可能にすることを実証しています。

さらに、非色の野生型株と共に組み立てられた3つのカロテノイド産生株を用いた「酵母ピクセルアート」の創作を実証する。ロザリンド・フランクリンの白黒写真(図6A)から始まり、4色の画像(図6B)とスポッティングリストが作成され、寒天マイクロプレート上の4つの異なる酵母株を見つけるために使用されました。ロザリンド・フランクリンの高解像度の「酵母絵画」を生み出した音響液体ハンドラ(図6C,D,E)。

Figure 1
図 1: S. cerevisiaeにおけるCRISPR/Cas12a多重ゲノム編集のためのプロトコルのワークフロー。ワークフローには、提示されたメソッドの重要な手順が含まれています。詳細については、プロトコルを参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 単一のcrRNA配列を用いたCRISPR/Cas12a多重ゲノム編集のスキーム。(A) 単一crRNA配列は、成熟した形態の3つのcrRNA単位で構成され、23bpガイドシーケンス(色付きダイヤモンド)を持つLbCas12a(灰色の正方形)に固有の20bp直接繰り返しで構成されています。crRNAアレイの発現は、SNR52プロモーターおよびSUP4ターミネータによって有効化される。線形化されたpRN1120とpRN1120(対角縞)との相同性を含む単一crRNA配列発現カセットを用いたS.セレビシエの形質転換は、細胞の前発現における円形プラスミドへの生体内組換を可能にするLbCas12a.単一crRNAアレイは、その後Cas12aによって処理されます。(B) Cas12a は、意図した INT1、INT2、および INT3 ゲノムターゲット サイトに向けられ、二重のストランド ブレークを作成します。形質転換混合物には、側面領域とカロテノイド遺伝子発現カセットからなるドナーDNAが含まれていた。ドナーDNAアセンブリは、50bp相同コネクタ配列の存在に起因する生体内組換により、INT1(crtE)、INT2(crtYB)およびINT3(crtI)遺伝子座の周りのゲノムDNAの1ストレッチを標的とし、5、A、B、C、DまたはE.P1-P3、異なるプロモーターとして示される。T1-T3、異なるターミネータ。この図は Verwaal et al. 201819から変更されています。合成生物学オープン言語(SBOL)ビジュアルシンボル40を使用して示される遺伝的構造。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3:ゲノム編集実験を検証するPCR。(A) 組み立てられたドナーDNAカセットのゴールデンゲートクローニング反応の検証得られた結果は、期待される長さと一致しています。(B) 単一 crRNA アレイの PCR。(C) プラスミドpRN1120の線形化。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 多重ゲノム編集アプローチを用いてS.セレビシエ変換のプレート。(A)株1は、3つの強いプロモーター(濃いオレンジ色のコロニー)からcrtE、crtYBおよびcrtIを発現する。(B)株2は、3つの培地強度プロモーター(オレンジコロニー)からcrtE、crtYBおよびcrtIを発現する。(C)株3は、3つの低強度プロモーター(黄色コロニー)からcrtE、crtYBおよびcrtIを発現する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5:ゲノムDNA内の目的の遺伝子座におけるドナーDNA発現カセットの統合を検証するPCR。(A) ひずみ1の3つのコロニーの検証。(B) 株2の3つのコロニーの検証。(C) 株3の3つのコロニーの検証。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6:ロザリンド・フランクリンの酵母ピクセルアート。(A) テンプレートとして使用されたロザリンド・フランクリンの220×280ピクセルの白黒RGB写真。(B) ロザリンド・フランクリンの白黒写真を4色64×96ピクセルリストに変換したコンピュータ。(C) ズームインセクションを持つ64×96酵母コロニーを持つ酵母ピクセルアートの写真。(D) 2つの完全に成長したプレートを持つ音響液体ハンドラーの写真。(E) 64×96酵母コロニーを含む完全に成長したマイクロプレートの写真。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ひずみ 1 ひずみ 2 ひずみ 3
色付きコロニー 16歳 279の 220の
白いコロニー 16歳 18歳 18歳
コロニーの合計 32歳 297の 238の
効率 50パーセント 94パーセント 92パーセント

表1:多重ゲノム編集アプローチの編集効率

crRNA配列配列配列a,b,c,d,e,f
CATGTTGACAGCTCATGCGCGGAGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTAGAACTAGTGGGGCCCGCGGCGCAGTCTTGAAAA
ガタッタッタッタットットTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTタカタタカグ
TGATTACATGGTTTGAGTACAACTTTTTTTTCTCTCTTCTGGGGTAGGGGGGGGGGGGAAGGTGCGCGC
TTTTTカッカッカッカッカトガットGTTAAAgATTTTTTTTTTGAAAGアグタグアガアグトグツググGCGC
ATGTTCGGCGTTCGAACTCTGCAGTAAAAAアガタガタガタガットCアトットクタクタアグタガット
CTGGGGGAGAAAGCTTGAAATTCTACTAGTGTAGTAGATGTGCCGTAC
GCCGGAGCCGCGGAATTTCTACTAGTGTAGTAGATTGCCCCTCTカタッタッタットTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
グッタットカッガットグッググッタットガットタグGTTTTTTGTG
a. pRN1120 (太字) に相同学。
b. SNR52プロモーター(斜体)。
c. ゲノムターゲット配列(下線付き)。
d. ガイドは、LbCas12aに固有の直接繰り返し(斜体、太字)。
e. SUP4 ターミネータ (斜体)
f. pRN1120 (太字) に相同学。

補足表1:プラスミドpRN1120を有する相同性を含むLbCas12a用単一crRNAアレイ。

名前 シーケンスa 説明b ポイントで使用
KC-101 キャットトガカグッタットカツ 単一crRNAアレイの増幅のためのFWプライマー 2.1.4
KC-102 カカカガアカグタガック 単一crRNAアレイの増幅用RVプライマー 2.1.4
KC-103 アグググアクトッカトCTTTGC コネクタ5を用いたドナーDNAの増幅用FWプライマー 3.6.1
KC-104 アガアガガガアック コネクタAを用いたドナーDNAの増幅用RVプライマー 3.6.1
KC-105 カッガットガッタッカカアッグ コネクタBを用いたドナーDNAの増幅用FWプライマー 3.6.1
KC-106 カラッガッガッタタック コネクタCを用いたドナーDNAの増幅用RVプライマー 3.6.1
KC-107 AACGTTGTCCAGGTTTATCC コネクタDを用いたドナーDNAの増幅用FWプライマー 3.6.1
KC-108 アッタカアカアガカッガッグ コネクタEを用いたドナーDNAの増幅用RVプライマー 3.6.1
KC-109 カクタクタクガット コネクタ5を使用したINT1 5'の増幅用FWプライマー 4.4年
KC-110 AAACGCGTGTGTGGGGGGTAC
TGGATGCAAGCGATGA
GTCGCTTガクトックCCCCGGTC
ATTCC		 コネクタ5を使用したINT1 5'の増幅用RVプライマー 4.4年
KC-111 TTGCCCCGAACGTACAAGAG
TACTCCTGTTCTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TGCTTTAAGCGTTGAGTTTTTTTTTTC
TTTG		 コネクタAを使用したINT1 3'の増幅用FWプライマー 4.4年
KC-112 TGTCAACTGガガグタッCG コネクタAを使用したINT1 3'の増幅用RVプライマー 4.4年
KC-113 アガガットトクトカトカツク コネクタBを使用したINT2 5'の増幅用FWプライマー 4.4年
KC-114 TGCAAGATTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TGGGTGCAGTGTGTGTGTACAT
CGATCCGCCCTTATCAATATACC
TGGTG		 コネクタBを使用したINT2 5'の増幅用RVプライマー 4.4年
KC-115 アグクットッチッカス
ガッカカガクタッカッハツクク
CCTGTTGグッガッタカアググ
GTGG		 コネクタCを使用したINT2 3'の増幅用FWプライマー 4.4年
KC-116 TCTCTCTCTCGATGGGGGGGGGGGGGG コネクタCを使用したINT2 3'の増幅用RVプライマー 4.4年
KC-117 GGTCGTTTTTGTGCAGCATTG コネクタDを使用したINT3 5'の増幅用FWプライマー 4.4年
KC-118 GCGGAATTGGCGGAACGG
アカカググガタカアック
ガカグットTTCCAAGGG
アガガCG		 コネクタDを使用したINT3 5'の増幅用RVプライマー 4.4年
KC-119 アアタカカアカアカカキャット
CCCATATGCTCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GTACCTガットッガグクトカクタクト
GTAC		 コネクタEを使用したINT3 3'の増幅用FWプライマー 4.4年
KC-120 ガグクタクタタットATTTC コネクタEを使用したINT3 3'の増幅用RVプライマー 4.4年
KC-121 GTTACTAACTGAACTCCG CON5-crtE-conA を INT1 5' に統合する FW プライマー 7.4.1
KC-122 CACTGCTAACTTTTTTTTC CON5-crtE-conA を INT1 3' に統合する FW プライマー 7.4.1
KC-123 カクトガアクトガクトガグ CONB-crtYB-conC を INT2 5' に統合した検証用 FW プライマー 7.4.1
KC-124 GTCTCCAGCTGAATTTCC CONB-crtYB-conC と INT2 3' の統合を検証するための FW プライマー 7.4.1
KC-125 CTCATGAAGCAGTC COND-crtI-conEをINT3 5' に統合した検証のための FW プライマー 7.4.1
KC-126 ガットググトカッタッタグガーグ COND-crtI-conEをINT3 3' に統合した検証のための FW プライマー 7.4.1
KC-127 CCTTGTCCAAGTAGGTCC CON5-crtE-conA を INT1 5' に統合するための RV プライマー 7.4.1
KC-128 GCTGTGTGATGTGTGTATATATATATATATATAT CON5-crtE-conA を INT1 3' に統合するための RV プライマー 7.4.1
KC-129 CTGGCAATTTGAATGC CONB-crtYB-conC と INT2 5' の統合を検証するための RV プライマー 7.4.1
KC-130 CCAACGTGCCTAGTG CONB-crtYB-conC と INT2 3' の統合を検証するための RV プライマー 7.4.1
KC-131 CCTTACCTTCTGCAGCAG COND-crtI-conE を INT3 5' に統合した検証用 RV プライマー 7.4.1
KC-132 CTGGTTTCTAAGACTG COND-crtI-conE を INT3 3' に統合した検証用 RV プライマー 7.4.1
a. 太字のシーケンスはコネクタ シーケンスを示します。
b. フォワードプライマーとリバースプライマーはそれぞれFWとRVとして指定されています。

補足表 2: プライマーシーケンス。

Supplementary Table 3
補足表3:構築された株の設計。

Supplementary Table 4
補足表4:ドナーDNA発現カセットおよび剥離領域の配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

提供されたプロトコルは、単一のcrRNAアレイおよびドナーDNAと組み合わせてラクノスピラセア属細菌ND2006からCas12aを用いたS.セレビシエの多重ゲノム編集について説明する。単一crRNAアレイおよびドナーDNAの設計について詳細に説明する。確立されたCRISPR/Cas9システムとは対照的に、CRISPR/Cas12aは単一のcrRNAアレイ13、33から発現される複数のcrRNAを処理する独特な付加的な機能を備えている。この機能により、複数のターゲットの同時編集が簡単に設定でき、1 回の変換で実現できます。この単一のcrRNAアレイアプローチは、Zetscheらによって以前に実証されました。AsCas12aを使用して哺乳動物細胞内で最大4つの遺伝子を同時に編集した34人、およびSwiatらによって.FnCas12aを用いて酵母ゲノムに4つのDNA断片を導入した35人。我々の知る限りでは、Cas12aシステムを用いた同時ゲノム修飾の数は報告されておらず、Cas12aの単一アレイあたりのターゲットの最大限界はまだ決定されていない。Cas12aと組み合わせて単一crRNAアレイを利用するさらなる研究は、生物33、36、37の広い範囲における多重転写調節を含む。

提示されたプロトコルにはいくつかの重要な手順があります。Cas12aゲノム編集実験に関与するすべてのDNA配列を慎重に設計します。CrRNAの新しいスペーサー配列の一部の機能を決定し、例えばVerwaalらによって説明されるシングルプレックスゲノム編集実験によって。単一のcrRNAアレイに組み合わせる前に19。酵母の良好な変換効率を達成するためにCas12a編集実験で使用される変換バッファソリューションの準備のための推奨事項に従ってください。

この手法には、いくつかのオプションの変更があります。各ドナーDNAの1μgを使用することが推奨され、形質転換における線形化pRN1120または単一crRNAアレイ発現カセットは、より低いDNA量の使用が満足のいく形質転換効率をもたらすことも期待される。テスト変換を実行して、より低い DNA 量を使用できるかどうかを判断します。S.cerevisiaeの変換は、このプロトコルで説明されているものとは異なる方法を使用して行われ、例えばGietzらによって記述されたプロトコルである。(2007年)38.ガイドRNAレシピエントプラスミドpRN1120は、異なるCas12a変異体の単一crRNAおよび単一crRNA配列の発現に適している(例えば、アシダミノコッカス菌から)。BV3L6またはフランセッラノビシダU112)だけでなく、Cas919と組み合わせてsgRNAの発現のために.ドナーDNAは、ゲノムDNA中の記載のINT1、INT2およびINT3部位にドナーDNAを標的とするカロテノイド遺伝子発現カセットおよび横振り領域に限定される必要はない。目的の任意のDNAは、多重的な方法で、このプロトコルに記載された設計原理によって宿主のゲノムDNAに導入することができ、または代わりにドナーDNAを使用して宿主ゲノムからDNAを削除することができる。単一crRNA配列のモジュラー構造はスペーサーおよび直接反復配列の容易な調節を促進する。スペーサー配列の変更は、ゲノムターゲットサイトを識別するためのツールの1つ、例えばGuideScanソフトウェア1.039によって設計することができる意図された統合遺伝子座の変更を可能にする。コネクタ配列を含む大きな横面配列を使用する代わりに、PCRで使用されるプライマーにこれらの50bp横分領域配列を組み込むことによって、フレーティング領域の50-bpをドナーDNA配列に含めることができる。この場合、多重ゲノム編集実験を成功させるには、9つのドナーDNA断片の代わりに合計3つだけが必要です。

要約すると、このプロトコルは、単一のcrRNAアレイアプローチと組み合わせてCas12aを使用してS.セレビシエで多重ゲノム編集を実行するためのステップバイステップの指示を提供します。このプロトコルは、9つのドナーDNA断片と3つのgRNAをコードする単一crRNA配列を用いた多重ゲノム編集によって実証された。ここでは報告された3つの歪み設計について、50%から94%の間で高い全体的な編集周波数を示しています。結論として、Cas12aのユニークな特徴は、単一のcrRNAアレイを細胞内の個々のCRRNAに処理する機能であり、Cas12aは多重ゲノム編集を可能にし、複数の標的となる転写調節モジュールを開発するための優れたツールです。一度に式カセット。最終的に、3つの株は、黄色とオレンジの間の色合いで異なるレベルと色でカロテノイドを生産するために得られました。これらの株と野生型株で、我々は音響液体ハンドラーが酵母ピクセルアートを作るために簡単に使用することができる方法を示しました - これは彼女の有名な写真51 23でDNA構造の発見に貢献したロザリンド・フランクリンに敬意を表して5123<。/c1>。

Disclosures

著者らは、利益相反があると宣言する。著者は、提示された方法に関連するIPを提出しました。

Acknowledgments

このプロジェクトは、補助金契約第686070号(DD-DeCaf)および764591(SynCrop)に基づき、欧州連合のHorizon 2020研究革新プログラムから資金を受け取り、プロジェクト番号737.016.005の研究プログラムから生命の構成要素を構築しました。オランダ科学研究機構(NWO)。T.E.G.は、王立協会(UF160357助成金)とBBSRC/EPSRC合成生物学研究センター(助成BB/L01386X/1)の支援を受けました。私たちは、酵母ピクセルアートを作成するための酵母スポッティング実験への貢献にZi Diとジェフリー・ファン・ワイクに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018 Electrophoresis
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl) New England BioLabs R353L Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer New England BioLabs B7204S Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma Aldrich D1626 Transfromation of
S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs Invitrogen 10297018 PCRs
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis Merck 100983 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid Sigma Aldrich ED Transformation of
S. cerevisiae
G418 disulfate salt Sigma Aldrich A1720 Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz Sigma Aldrich D2158  Yeast pixel art
Isopropanol Merck 100993 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate Sigma Aldrich L6883 Transformation of
S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain Sigma Aldrich 1494 Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells New England BioLabs C3019H Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin Jena Bioscience AB102 Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer New England BioLabs M0530L PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530L PCRs
Polyethylene glycol 4000 Merck 7490 Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye New England BioLabs B7024S Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix Thermo Fisher Scientific AM2286 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer Invitrogen 46300-018 Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl) Invitrogen 1705218 Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500 Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit Promega A9282 Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol New England BioLabs R0146S Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) Zymo Research E1006 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer Zymo Research E1004-B Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar Plate growth of E. coli
2*PY medium Cultivation of E. coli
Demineralized water Transformation of
S. cerevisiae
ELFO buffer Electrophoresis
MQ Multiple steps
Physiological salt solution Transformation of
S. cerevisiae
TE buffer Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar Plate growth of
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067 Addgene ID 101748 https://www.addgene.org/
pRN1120 Addgene ID 101750 https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN.PK113-7D		 EUROSCARF collection http://www.euroscarf.de

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References

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バイオエンジニアリング 問題 147 CRISPR/Cas12a CRISPR/Cpf1 CRISPR/Cas9 多重ゲノム編集,サッカロマイセスセレビシエ 酵母ピクセルアート
CRISPR/Cas12a サ<em>ッカロマイセスセレビシエ</em>の多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造
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Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski,… More

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski, T. E., Roubos, J. A., Verwaal, R. CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art. J. Vis. Exp. (147), e59350, doi:10.3791/59350 (2019).

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