CRISPR/Cas12a प्रणाली एक एकल crRNA सरणी के साथ संयोजन में एस cerevisiae जीनोम के कुशल बहुसंकेतन संपादन एक साथ कई loci पर सक्षम बनाता है. यह बाद में खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए उपयोग किया जाता है जो खमीर उपभेदों का उत्पादन carotenoid निर्माण द्वारा प्रदर्शन किया है.
उच्च दक्षता, उपयोग में आसानी और संकुल की बहुमुखी प्रतिभा नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता है/CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रणाली ने Saccharomyces cerevisiaeके उन्नत आनुवंशिक संशोधन की सुविधा प्रदान की है, एक मॉडल जीव और औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी में workhorse. CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 12a (Cas12a), Cas9 से अलग सुविधाओं के साथ एक आरएनए निर्देशित endonuclease इस काम में लागू किया जाता है, आगे जीनोम संपादन प्रयोजनों के लिए आणविक उपकरण बॉक्स का विस्तार. CRISPR/Cas12a प्रणाली का एक लाभ यह है कि यह एकाधिक गाइड RNAs एक एकल प्रतिलिपि इकाई (एकल CRISPR आरएनए (crRNA) सरणी से व्यक्त के साथ मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन में इस्तेमाल किया जा सकता है। हम कई हेटेरोलॉजियस जीनों के मल्टीप्लेक्स एकीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो एक ही crRNA सरणी निर्माण से व्यक्त कई crRNAs के साथ CRISPR/Cas12a प्रणाली का उपयोग करके एस सेरेविसी जीनोम के स्वतंत्र लोकी में होता है। प्रस्तावित विधि एस cerevisiae की क्षमता का शोषण डीएनए टुकड़े के vivo पुनर्संयोजन में प्रदर्शन करने के लिए एक प्लाज्मिड कि transformant चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एकल crRNA सरणी इकट्ठा करने के लिए, साथ ही दाता डीएनए की विधानसभा दृश्यों कि इरादा पदों पर जीनोम में एकीकृत. Cas12a पूर्व expressed गठन है, एकल crRNA सरणी की अभिव्यक्ति पर इरादा पदों पर एस cerevisiae जीनोम के दरार की सुविधा. प्रोटोकॉल डिजाइन और एक एकल crRNA सरणी और दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण भी शामिल है, और एक एकीकरण दृष्टिकोण अद्वितीय 50-बीपी डीएनए कनेक्टर्स दृश्यों और अलग एकीकरण पार्श्व डीएनए दृश्यों, जो सरल का उपयोग कर शोषण मानकीकरण और प्रतिरूपीकरण के माध्यम से प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुप्रयोगों की सीमा फैली हुई है। अंत में, हम अलग तरह से रंग carotenoid का निर्माण खमीर उपभेदों कि निर्माण किया गया का उपयोग कर एक ध्वनिक तरल हैंडलर के साथ खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए एक सीधी तकनीक का प्रदर्शन.
CRISPR/Cas एंजाइमों ने निर्विवाद रूप से आण्विक जीव विज्ञान में क्रांति ला दीहै और इसे इंजीनियरिंग जीनोम के लिए उस गति से उपकरण के रूप में व्यापक रूप से अपनाया गया है जो पहले अव्यवहार्य था . CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली द्वारा एक Saccharomyces cerevisiae जीनोम के पहले संशोधन DiCarlo एट अल द्वारा सूचित किया गया था. 2, सफल जीन नॉक आउट का प्रदर्शन और बाह्य शुरू oligonucleotides का उपयोग कर बिंदु उत्परिवर्तन बनाने. इसके अलावा खमीर CRISPR Toolbox विकास शामिल: उत्प्रेरक निष्क्रिय मृत Cas9 के संलयन द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन (dCas9) ट्रांसक्रिप्शन प्रभावक डोमेन के साथ ट्रांसक्रिप्शन प्रभावक डोमेन के साथ ट्रांसक्रिप्शन3,दोनों के लिए आवेदन जीनोम संपादन और एक साथ सक्रियण, दमन और विलोपन4द्वारा चयापचय मार्ग इंजीनियरिंग के लिए नियामक कार्यों , एस cerevisiae जीनोम5से बड़े टुकड़े को हटाने , और एकाधिक क्रोमोसोम संलयन6 .
CRISPR/Cas जीनोम संपादन प्रणालियों बैक्टीरिया और आर्किया के अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में अपने मूल पाते हैं और इन प्रणालियों जीनोम संपादन के लिए आणविक जीवविज्ञानियों द्वारा अनुकूलित किया गया है. उनकी कार्यक्षमता क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता है पर आधारित है (CRISPR) डीएनए क्षेत्रों विदेशी डीएनए या आरएनए और CRISPR संबद्ध जीन (Cas) जो आरएनए निर्देशित encodes की मान्यता के लिए जिम्मेदार आरएनए एन्कोडिंग क्षेत्रों अंत:प्रणय1,7,8,9. CRISPR/Cas प्रणालियों के हाल के जीनोम विश्लेषण के आधार पर यह प्रस्ताव किया गया था कि CRISPR/Cas प्रणालियों को दो वर्गों, पांच प्रकार और 16 उपप्रकारों10में विभाजित किया जाए। दोनों वर्गों को लक्ष्य दरार में शामिल effector परिसरों के संगठन के आधार पर प्रतिष्ठित कर रहे हैं. आमतौर पर, एक बहु-उपइकाई संगठन के साथ CRISPR/Cas प्रणालियों को वर्ग 1 के रूप में वर्गीकृत किया गया है, जबकि एकल सबयूनिट प्रभावक परिसर कक्षा 210,11के हैं। इस कागज में, हम वर्ग 2 प्रकार V Cas12a, पूर्व Cpf110,12कहा जाता है, जो वर्ग 2 प्रकार द्वितीय Cas9 के लिए एक विकल्प है का पता लगाने. हालांकि Cas9 अच्छी तरह से विशेषता है और व्यापक रूप से अनुसंधान में इस्तेमाल किया, Cas12a अतिरिक्त सुविधाओं12प्रदान करता है. सबसे पहले, Cas12a एक अतिरिक्त ट्रांस-सक्रिय CRISPR आरएनए (tracrRNA) की आवश्यकता के बिना 42 से 44 न्यूक्लिओटाइड के CRISPR आरएनए (crRNA) के साथ एक जटिल रूपों। इसलिए, CRISPR/Cas12a प्रणालियों के साथ जीनोम संपादन में एक छोटी गाइड आरएनए का उपयोग किया जा सकता है, जो CRISPR/Cas9 की तुलना में है। दूसरे, Cas12a की अद्वितीय एंडोनोक्यूलेस और एंडोरिबोनेक्यूलेस गतिविधि इसके पूर्व crRNA13की परिपक्वता को सक्षम बनाती है। यह RNase गतिविधि एक एकल CRISPR CRNA सरणी पर कई crRNAs के एन्कोडिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि Cas9 प्रत्येक तथाकथित एकल गाइड आरएनए (sgRNA) या वैकल्पिक रूप से एक अतिरिक्त endonuclease के उदाहरण अभिव्यक्ति के लिए अलग अभिव्यक्ति की आवश्यकता है ( उदाहरण के लिए, Csy4 प्रत्येक sgRNA14,15आसपास के Csy4 के लिए मान्यता रूपांकनों के साथ संयोजन में . तीसरे, Cas12a लक्ष्य साइट मान्यता लक्ष्य से 5 के अंत में एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) की आवश्यकता है और अपने PAM से +18/+23 स्थिति के बाद claves चिपचिपा समाप्त होता है के साथ cleaved डीएनए में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि Cas9 एक PAM की आवश्यकता है 3 के अंत में से 3 ‘ अंत पर स्थित डी.एन.ए.12में कुंद अंत कटौती बनाने की स्थिति के बाद लक्ष्य और क्लीव्स . चौथे, पीएएम की आम सहमति न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम Cas12a ((टी)टीटीवी) और Cas9 (NGG) के बीच अलग है, जो Cas12a टी अमीर प्रमोटर और टर्मिनेटर अनुक्रम16को लक्षित करने के लिए एक होनहार उम्मीदवार बनाता है. अंत में, हाल ही में एक अध्ययन देशी Cas917के लिए की तुलना में Cas12a के लिए अधिक से अधिक लक्ष्य विशिष्टता की सूचना दी.
हम एस सेरेविसिया ई के जीनोम संपादन के लिए CRISPR/Cas12a प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक साथ स्वतंत्र जीनोमिक लोसी (मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन) का उपयोग करके एकाधिक डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट की शुरूआत पर विशेष ध्यान दिया जाता है। एक एकल crRNA सरणी. प्रोटोकॉल के मुख्य चरण चित्र 1में दर्शाया गया है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में CRISPR/Cas12a प्रणाली को तीन अभिव्यक्ति कैसेटों को एस सेरेविएसिया के जीनोम में लागू करने के लिए लागू किया गया था जो चित्र 2में योजनाबद्ध रूप से दर्शाए गए के रूप में $ कैरोटीन18 के उत्पादन को सक्षम करता है। जेड कैरोटीन का उत्पादन एस सेरेविसीके फीनोटाइप को प्रभावित करता है: अर्थात,कैरोटीनोइड जैव संश्लेषण के लिए आवश्यक सभी तीन विषमजीवी जीनों का सफल परिचय पर, सफेद एस सेरेविएसाइड कोशिकाएं पीले या नारंगी हो जाती हैं, प्रत्येक जीन के प्रमोटर की अभिव्यक्ति की ताकत पर निर्भर करता है. इस मार्ग के सरल दृश्य पठन-पाठन के कारण, इसे उन्नत CRISPR-आधारित प्रणालियों और जीनोम संपादन के लिए विधियों को विकसित करने के लिए शुरू किया गयाहै 19,20. इस काम में, अभिव्यक्ति कैसेट कैरोटीनॉयड जीन crtEएन्कोडिंग, crtYB और crtI एक गोल्डन गेट क्लोनिंग (GGC) दृष्टिकोण21 विषम प्रवर्तकों और समजात टर्मिनेटर के साथ का उपयोग कर निर्माण किया गया है जीनों की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए प्रयोग किया जाता है। अभिव्यक्ति कैसेट अद्वितीय 50-आधार जोड़े (बीपी) दृश्यों से घिरे हुए हैं, कनेक्टर्स कहा जाता है, कि एकीकरण पार्श्व डीएनए दृश्यों के साथ vivo विधानसभा में के लिए अनुमति देते हैं (फ्लैंकिंग क्षेत्रों) एक ही 50-बीपी दृश्यों के साथ, और बाद में एकीकरण flanking क्षेत्रों द्वारा निर्धारित स्थिति पर खमीर के जीनोमिक डीएनए में. विभिन्न प्रमोटर शक्तियों का उपयोग करके, carotenoids उत्पादन के विभिन्न स्तरों के साथ उपभेदों कोशिकाओं के रंग में भिन्नता में जिसके परिणामस्वरूप प्राप्त किए गए थे. इन उपभेदों – “ईस्ट आर्ट प्रोजेक्ट”22 से प्रेरित – Rosalind फ्रेंकलिन के एक 4-रंग उच्च संकल्प “यास तस्वीर” बनाने के लिए एक ध्वनिक तरल हैंडलर के साथ एक खोलना सेटअप में इस्तेमाल किया गया। फ्रैंकलिन (1920-1958) एक अंग्रेजी रसायनज्ञ और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफर थे जो फोटो 5123,24,25द्वारा डीएनए संरचना की खोज में उनके योगदान के लिए जाने जाते थे .
प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में एक crRNA सरणी और दाता डीएनए के संयोजन में Lachnospiraceae जीवाणु ND2006 से Cas12a का उपयोग कर एस cerevisiae के मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन का वर्णन करता है। एकल crRNA सरणी और दाता डीएनए के डिजाइन विस्तार से समझाया गया है. सुस्थापित CRISPR/Cas9 प्रणाली के विपरीत, CRISPR/Cas12a एक एकल crRNA सरणी13,33से व्यक्त कई CRRNAs प्रसंस्करण की अद्वितीय अतिरिक्त क्षमता है. इस सुविधा के कारण, कई लक्ष्यों का एक साथ संपादन स्थापित करने के लिए आसान है और एक ही परिवर्तन में प्राप्त किया जा सकता है. इस एकल crRNA सरणी दृष्टिकोण से पहले ज़ेत्शे एट अलद्वारा प्रदर्शन किया गया था . 34 जो एक साथ AsCas12a का उपयोग कर स्तनधारी कोशिकाओं में चार जीन को संपादित, और Swiat एट अलद्वारा . 35 जो एक खमीर जीनोम में चार डीएनए टुकड़े FnCas12a का उपयोग शुरू की. हमारे ज्ञान के लिए, एक Cas12a प्रणाली का उपयोग कर एक साथ जीनोमिक संशोधनों की एक उच्च संख्या की सूचना नहीं दी गई है और Cas12a के लिए एक सरणी प्रति लक्ष्यों की अधिकतम सीमा अभी तक निर्धारित किया जाना है. इसके अलावा , कास12क के संयोजन में एकल सीआरआरएनए सरणियों काउपयोग करने वाले शोध में अनेक जीवों की विस्तृत श्रृंखला में बहुसंकेत प्रतिलेखनीय विनियमन 33 ,36,37शामिल हैं .
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं। ध्यान से सभी डीएनए दृश्यों कि Cas12a जीनोम संपादन प्रयोग में शामिल हैं डिजाइन, विशेष रूप से मामले में जब उपन्यास डीएनए दृश्यों शुरू कर रहे हैं. एक crRNA के नए स्पेसर दृश्यों भाग की कार्यक्षमता का निर्धारण, उदाहरण के लिए एक एकल plex जीनोम संपादन प्रयोग द्वारा के रूप में Verwaal एट अलद्वारा वर्णित. 19 उन्हें एक एकल crRNA सरणी में संयोजन से पहले. खमीर का एक अच्छा परिवर्तन दक्षता प्राप्त करने के लिए Cas12a संपादन प्रयोग में इस्तेमाल परिवर्तन बफर समाधान की तैयारी के लिए सिफारिशों का पालन करें.
तकनीक के कुछ वैकल्पिक संशोधन कर रहे हैं. यह एक कम डीएनए राशि का उपयोग भी एक संतोषजनक परिवर्तन दक्षता में परिणाम की उम्मीद है, हालांकि परिवर्तन में प्रत्येक दाता डीएनए, linearized pRN1120 या एकल crRNA सरणी अभिव्यक्ति कैसेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. कम डीएनए मात्रा का उपयोग किया जा सकता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक परीक्षण रूपांतरण निष्पादित करें। S. cerevisiae का रूपांतरण इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक से एक अलग विधि का उपयोग कर के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए Gietz एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल. (2007) 38. गाइड आरएनए प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड PRN1120 विभिन्न Cas12a वेरिएंट के एक crRNA और एकल crRNA सरणी की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है (उदाहरणके लिए , Acidaminococcus spp से. BV3L6 या फ्रांसिसेला novicida U112) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Cas919के साथ संयोजन में sgRNA की अभिव्यक्ति के लिए . दाता डीएनए carotenoid जीन अभिव्यक्ति कैसेट और क्षेत्र ों कि वर्णित INT1, INT2 और जीनोमिक डीएनए में INT3 साइटों के लिए दाता डीएनए लक्ष्य flanking तक सीमित होने की जरूरत नहीं है. ब्याज का कोई भी डीएनए, एक मल्टीप्लेक्स तरीके से, इस प्रोटोकॉल में वर्णित डिजाइन सिद्धांतों द्वारा मेजबान के जीनोमिक डीएनए में पेश किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से दाता डीएनए एक मेजबान जीनोम से डीएनए को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल CRRNA सरणी की मॉड्यूलर संरचना स्पेसर और प्रत्यक्ष दोहराने दृश्यों के आसान समायोजन की सुविधा. स्पेसर दृश्यों के संशोधन इच्छित एकीकरण टिड्डी जो एक जीनोमिक लक्ष्य साइट की पहचान के लिए उपकरणों में से एक द्वारा डिजाइन किया जा सकता है के परिवर्तन के लिए अनुमति देता है, उदाहरण के लिए GuideScan सॉफ्टवेयर 1.039. कनेक्टर्स दृश्यों होते हैं कि बड़े flanking दृश्यों का उपयोग करने के बजाय, पीसीआर में इस्तेमाल प्राइमर में इन 50-बीपी flanking क्षेत्र दृश्यों को शामिल करके दाता डीएनए दृश्यों में शामिल किया जा सकता है। इस मामले में, नौ दाता डीएनए टुकड़े के बजाय कुल सिर्फ तीन में एक सफल मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन प्रयोग के लिए आवश्यक हैं.
सारांश में, यह प्रोटोकॉल S. cerevisiae में एक एकल crRNA सरणी दृष्टिकोण के साथ संयोजन में Cas12a का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन द्वारा 9 दाता डीएनए टुकड़े और तीन gRNAs के लिए एकल crRNA सरणी कोडिंग का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. हम तीन तनाव डिजाइन यहाँ की सूचना के लिए 50% और 94% के बीच उच्च समग्र संपादन आवृत्तियों दिखा. समापन, Cas12a की अनूठी विशेषता के लिए एक सेल में अलग-अलग crRNAs में एक एकल crRNA सरणी प्रक्रिया की क्षमता है, जो Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन सक्षम करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाता है और प्रतिलिपि विनियमन मॉड्यूल विकसित करने के लिए कई लक्ष्यीकरण अभिव्यक्ति कैसेट एक ही बार में. अंत में, तीन उपभेदों एक अलग स्तर पर कैरोटीनोइड और पीले और नारंगी के बीच रंगों में रंग का उत्पादन प्राप्त किया गया. उन उपभेदों और एक जंगली प्रकार तनाव के साथ, हम कैसे एक ध्वनिक तरल हैंडलर सीधे खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाया – Rosalind फ्रेंकलिन के सम्मान में यह जो डीएनए संरचना की खोज में योगदान दिया 65 साल पहले उसे प्रसिद्ध तस्वीर 5123 द्वारा /c1].
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से अनुदान समझौते संख्या 686070 (डीडी-डीसीएएफ) और 764591 (SynCrop) के तहत और परियोजना संख्या 737.016.005 के साथ जीवन के अनुसंधान कार्यक्रम बिल्डिंग ब्लॉक से धन प्राप्त हुआ। नीदरलैंड आर्गेनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ)। T.E.G. रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान UF160357) और BrisSynBio, एक BBSRC/EPSRC सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान केंद्र (अनुदान BB/ खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए खमीर खोलना प्रयोगों के लिए उनके योगदान के लिए हम ज़ी डि और Jeffrey वैन Wizk धन्यवाद.
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
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ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
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TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
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Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |