단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템은 여러 로시에서 동시에 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 가능하게 합니다. 이것은 이후에 효모 픽셀 예술을 만드는 데 사용되는 효모 균주를 생산하는 카로티노이드를 구성하여 입증됩니다.
고효율, 사용 편의성 및 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 시스템은 사카로마이스 세레비시아의고급 유전자 변형을 촉진시켰습니다. 산업 생명 공학의 유기체 및 주력. CRISPR 관련 단백질 12a (Cas12a), Cas9와 구별되는 특징을 가진 RNA 유도 엔도뉴클러가 이 작업에 적용되어 게놈 편집을 위한 분자 도구 상자를 더욱 확장합니다. CRISPR/Cas12a 시스템의 장점은 단일 전사 유닛(단일 CRISPR RNA(crRNA) 어레이로부터 발현되는 다중 가이드 RNA를 이용한 멀티플렉스 게놈 편집에 사용될 수 있다는 것이다. 우리는 단일 crRNA 어레이 구조에서 발현된 다중 crRNA를 가진 CRISPR/Cas12a 시스템을 사용하여 S. 세레비시아 게놈의 독립적인 궤체로 다중 이종 유전자의 다중 통합을 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법은 S. cerevisiae가 DNA 단편의 생체 내 재조합을 수행하여 단일 crRNA 어레이를 변형제 선택뿐만 아니라 기증자 DNA의 조립에 사용할 수 있는 플라스미드로 조립하는 능력을 이용합니다. 의도된 위치에서 게놈에 통합되는 서열. Cas12a는 단일 crRNA 어레이의 발현 시 의도된 위치에서 S. 세레비시아 게놈의 절단을 용이하게 구성적으로 미리 발현된다. 이 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA 발현 카세트의 설계 및 시공을 포함하고 있으며, 고유한 50bp DNA 커넥터 서열과 별도의 통합 측면 DNA 서열을 사용하여 단순화하는 통합 접근 방식을 활용합니다. 표준화 및 모듈화를 통한 실험 설계및 적용 범위를 확장합니다. 마지막으로, 우리는 구성 된 효모 균주를 생산하는 다른 색깔의 카로티노이드를 사용하여 음향 액체 처리기로 효모 픽셀 아트를 만드는 간단한 기술을 보여줍니다.
CRISPR/Cas 효소는 의심할 여지없이 분자 생물학에 혁명을 일으켰으며 이전에는 실현 불가능한 속도로게놈공학 도구로 널리 채택되었습니다 1. CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템에 의한 사카로마이세스 세레비시아 게놈의 첫 번째 변형은 디카를로 외에 의해 보고되었다. 2,성공적인 유전자 녹아웃을 시연하고 외부적으로 도입 된 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 포인트 돌연변이를 만듭니다. 추가 효모 CRISPR 툴박스 개발 포함: 촉매 비활성 죽은 Cas9 (dCas9)와 전사 이펙터 도메인의 융합에 의한 전사조절 3, 둘 다에 대한 응용 프로그램 동시 활성화, 억압 및 결실에 의한 대사 경로 공학을 위한게놈 편집 및 규제 기능 4, S. cerevisiae 게놈5,다중 염색체 융합에서 큰 파편의 삭제6 .
CRISPR/Cas 게놈 편집 시스템은 박테리아와 고고학의 적응형 면역 계통에서 기원을 발견하며, 이러한 시스템은 게놈 편집을 위해 분자 생물학자에 의해 조정되었습니다. 그들의 기능은 외국 DNA 또는 RNA및 RNA 유도를 인코딩하는 CRISPR 관련 유전자 (Cas)의 인식에 책임 있는 RNA를 인코딩하는 군집된 정규 간격 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR) DNA 지구에 근거를 두었습니다 endonucleases1,7,8,9. CRISPR/Cas 시스템의 최근 게놈 분석을 기반으로 CRISPR/Cas 시스템을 두 가지 클래스, 5가지 유형 및 16개의 아류형10으로나눌 것을 제안했습니다. 두 클래스는 대상 분열에 관련된 이펙터 복합체의 조직에 따라 구별된다. 전형적으로, 다중 소단위 조직을 가진 CRISPR/Cas 시스템은 클래스 1로 분류되는 반면, 단일 서브유닛 이펙터 컴플렉스는 클래스 210,11에속한다. 이 문서에서는 클래스 2 유형 II Cas9에 대한 대안인 Cpf110,12라고불리는 클래스 2 형식 V Cas12a를 살펴봅습니다. Cas9는 잘 특성화되어 널리 연구에 사용되지만 Cas12a는 추가 기능12를제공합니다. 첫째로, Cas12a는 추가적인 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 요구하지 않고 42~44개의 뉴클레오티드의 CRISPR RNA(crRNA)를 가진 복합체를 형성한다. 따라서, 더 짧은 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9에 비해 CRISPR/Cas12a 시스템을 사용하여 게놈 편집에 사용될 수 있다. 둘째, Cas12a의 독특한 엔도뉴클리스 및 엔도리보뉴클리스 활성은 프리 crRNA13의성숙을 가능하게 한다. 이 RNase 활동은 단일 CRISPR crRNA 배열상에 다중 crRNA의 인코딩을 허용하는 반면, Cas9는 각각의 소위 단일 가이드 RNA(sgRNA) 또는 대안적으로 추가엔도뉴클러의 발현을 필요로 한다( 예를들어, Csy4)는 각 sgRNA14,15를둘러싸는 Csy4에 대한 인식 모티프와 함께 한다. 셋째, Cas12a 대상 사이트 인식은 대상에서 5′ 끝에서 protospacer 인접 모티프 (PAM)를 필요로하고 고정 된 끝으로 절단 된 DNA를 초래하는 PAM에서 +18 /+23 위치 후 갈라진 반면 Cas9는 3 ‘끝에서 PAM을 필요로합니다. DNA12에서무딘 끝 절단을 만드는 -3 위치 후에 표적 및 절단. 넷째, PAM의 합의 뉴클레오티드 서열은 Cas12a(((T)TTV)와 Cas9(NGG) 사이에서 다르며, 이는 Cas12a를 T-풍부 프로모터 및 터미네이터 서열을 표적으로 하는 유망한 후보(16)를 만든다. 마지막으로, 최근 연구는 네이티브 Cas917에대 한 보다 Cas12a에 대 한 더 큰 대상 특이성을 보고.
우리는 독립적 인 게놈 로시에 여러 DNA 발현 카세트를 동시에 도입에 특히 초점을 맞춘 S. cerevisiae의 게놈 편집을위한 CRISPR / Cas12a 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제시합니다 (멀티 플렉스 게놈 편집)을 사용하여 단일 crRNA 배열. 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 개념의 증명으로, CRISPR/Cas12a 시스템은 도2에 도시된 바와 같이 β-카로틴18의 생산을 가능하게 하는 S. cerevisiae의 게놈내로 3개의 발현 카세트를 도입하기 위해 적용되었다. β-카로틴의 생산은 S. 세레비시아의표현형에 영향을 미칩니다 : 즉, 카로티노이드 생합성에 필요한 세 가지 이종 유전자를 성공적으로 도입하면 백색 S. 세레비시아 세포가 노란색 또는 주황색으로 변합니다. 각 유전자의 발기인의 발현 강도에 따라 달라집니다. 이 통로의 간단한 시각적 판독으로 인해, 그것은 게놈 편집을위한 고급 CRISPR 기반 시스템 및 방법을 개발하기 위해 도입되었다19,20. 이 작품에서, 카로티노이드 유전자 crtE, crtYB 및 crtI를 코딩하는 발현 카세트는 이종 프로모터 및 상동성 종기를 이용한 골든 게이트 클로닝(GGC) 접근법21을 사용하여 제작되었습니다. 유전자의 발현을 유도하는 데 사용됩니다. 발현 카세트는 커넥터라고 불리는 고유한 50-base 쌍(bp) 서열로 둘러싸여 있으며, 동일한 50bp 서열과 동일한 50bp 서열과 통합 측면 DNA 서열(flanking regions)을 사용하여 생체 내 조립을 허용합니다. 측면 부위에 의해 결정된 위치에서 효모의 게놈 DNA로 들어갑니다. 상이한 프로모터 강도를 사용하여, 카로티노이드 생산의 상이한 수준을 가진 균주는 세포의 색깔에 있는 변이의 결과로 얻어졌다. “효모 예술 프로젝트”22에서 영감을 얻은 이 균주는 로잘린드 프랭클린의 4색 고해상도 “효모 사진”을 만들기 위해 음향 액체 핸들러와 함께 스포팅 셋업에 사용되었습니다. 프랭클린 (Franklin, 1920-1958)은 사진 5123,24,25에의해 DNA 구조의 발견에 그녀의 기여로 잘 알려진 영어 화학자 및 X 선 결정기.
제공된 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA와 조합하여 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006으로부터의 Cas12a를 사용하여 S. 세레비시아의 멀티플렉스 게놈 편집을 기술한다. 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA의 설계는 자세히 설명된다. 잘 확립된 CRISPR/Cas9 시스템과는 달리, CRISPR/Cas12a는 단일 crRNA 어레이13,33에서발현되는 다중 crRNA를 처리하는 독특한 추가 능력을 가지고 있다. 이 기능으로 인해 여러 대상을 동시에 편집하는 것이 더 쉬우며 단일 변환으로 수행할 수 있습니다. 이 단일 crRNA 배열 접근법은 Zetsche 외.에의해 이전에 입증되었습니다. 34명의 동시 는 AsCas12a를 사용하여 포유류 세포에 있는 4개의 유전자까지 편집하고, Swiat 외에의해. FnCas12a를 사용하여 효모 게놈에 4개의 DNA 단편을 도입한 35명. 우리의 지식에, Cas12a 시스템을 사용하여 동시 게놈 수정의 더 높은 수는 보고되지 않았으며 Cas12a를 위한 단일 배열당 표적의 최대 한계는 아직 결정되지 않았습니다. Cas12a와 조합하여 단일 crRNA 어레이를 활용하는 추가 연구는 광범위한 유기체33,36,37에서다중 전사 조절을 포함한다.
제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 특히 새로운 DNA 서열이 도입되는 경우 Cas12a 게놈 편집 실험에 관여하는 모든 DNA 서열을 신중하게 설계합니다. Verwaal et al.에의해 기술된 바와 같이 단일 플렉스 게놈 편집 실험에 의해 예를 들어 crRNA의 새로운 스페이서 서열 부분의 기능을 결정한다. 19를 단일 crRNA 어레이로 결합하기 전에. 효모의 좋은 변환 효율을 달성하기 위해 Cas12a 편집 실험에 사용되는 변환 버퍼 솔루션의 준비에 대한 권장 사항을 따르십시오.
이 기술의 몇 가지 선택적 수정 사항이 있습니다. 각 공여자 DNA의 1 μg, 선형화된 pRN1120 또는 단일 crRNA 배열 발현 카세트를 변형에 사용하는 것이 권장되지만, 더 낮은 DNA 양을 사용하는 것은 또한 만족스러운 형질전환 효율을 초래할 것으로 예상된다. 더 낮은 DNA 양이 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 시험 변환을 능력을 발휘합니다. S. 세레비시아의 변형은 이 프로토콜에 기재된 것과는 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Gietz et al. (2007년) 38.가이드 RNA 수용자 플라스미드 pRN1120은 상이한 Cas12a 변이체(예를 들어, 산아미노코커스 종으로부터의 단일 crRNA 및 단일 crRNA 어레이의 발현에 적합하다. BV3L6 또는 프란체셀라 노비시다 U112) 뿐만 아니라 Cas919와조합하여 sgRNA의 발현. 공여자 DNA는 유전체 DNA에서 기재된 INT1, INT2 및 INT3 부위에 공여자 DNA를 표적으로 하는 카로티노이드 유전자 발현 카세트 및 측면 영역으로 제한될 필요가 없다. 관심 있는 임의의 DNA는, 멀티플렉스 방식으로, 본 프로토콜에 기재된 설계 원리에 의해 숙주들의 게놈 DNA내로, 또는 대안적으로 공여자 DNA가 숙주 게놈으로부터 DNA를 삭제하는데 사용될 수 있다. 단일 crRNA 어레이의 모듈식 구조는 스페이서 및 직접 반복 서열의 쉬운 조정을 용이하게 합니다. 스페이서 서열의 변형은 게놈 표적 부위의 식별을 위한 도구 중 하나인 GuideScan 소프트웨어 1.039에의해 설계될 수 있는 의도된 통합 궤적의 변화를 허용한다. 커넥터 서열을 포함하는 큰 측면 서열을 사용하는 대신, 50-bp 의 측면 영역은 PCR에 사용되는 프라이머에 이들 50-bp 플랭킹 영역 서열을 통합함으로써 공여자 DNA 서열에 포함될 수 있다. 이 경우, 성공적인 멀티플렉스 게놈 편집 실험을 위해 9개의 공여자 DNA 단편 대신에 총 3개만 이요구된다.
요약하면, 이 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 접근법과 조합하여 Cas12a를 사용하여 S. 세레비시아에서 멀티플렉스 게놈 편집을 수행하는 단계별 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 3개의 gRNA를 위한 9개의 공여자 DNA 단편 및 단 하나 crRNA 배열 코딩을 사용하여 다중 게놈 편집에 의해 입증되었습니다. 여기에 보고된 세 가지 변형 설계에 대해 전체 편집 주파수가 50%에서 94% 사이로 표시됩니다. 결론적으로, Cas12a의 독특한 특징은 단일 crRNA 어레이를 세포의 개별 crRNA로 처리하는 기능으로, Cas12a는 멀티플렉스 게놈 편집을 가능하게 하고 다중을 대상으로 하는 전사 조절 모듈을 개발하는 훌륭한 도구입니다. 한 번의 방식으로 카세트를 표현할 수 있습니다. 결국, 세 가지 균주는 노란색과 주황색 사이의 음영에서 다른 수준과 색상에서 카로티노이드를 생산을 얻었다. 그 균주와 야생 형 변형으로, 우리는 음향 액체 핸들러가 효모 픽셀 아트를 만들기 위해 간단하게 사용할 수있는 방법을 보여 주었다 – 그녀의 유명한 사진에 의해 DNA 구조의 발견에 기여 로잘린드 프랭클린의 명예에 65 년 전 그녀의 유명한 사진 5123.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 보조금 협정에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(DD-DeCaf) 및 764591(SynCrop)에서 자금을 지원받았으며, 프로젝트 번호 737.016.005를 가진 연구 프로그램 빌딩 블록오브라이프에서 지원받았습니다. 과학 연구를위한 네덜란드 기구 (NWO). T.E.G.는 왕립 학회 (UF160357 부여)와 브리신 바이오, BBSRC / EPSRC 합성 생물학 연구 센터 (부여 BB / L01386X / 1)에 의해 지원되었다. 우리는 효모 픽셀 아트를 만들기위한 효모 발견 실험에 기여한 Zi Di와 Jeffrey van Wijk에게 감사드립니다.
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
||
ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
||
TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
||
Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |