CRISPR/Cas12a-systemet i kombination med en enda crRNA-array möjliggör effektiv multiplex-redigering av S. cerevisiae -genomet vid flera loci samtidigt. Detta demonstreras genom att konstruera karotenoid producerar jäststammar som sedan används för att skapa jäst pixel konst.
Hög effektivitet, användarvänlighet och mångsidighet av de grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner/CRISPR-Associated protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet har underlättat avancerad genetisk modifiering av Saccharomyces cerevisiae, en modell organism och arbetshäst i industriell bioteknik. CRISPR-associerat protein 12a (Cas12a), en RNA-guidad endonukleas med funktioner som skiljer sig från Cas9 tillämpas i detta arbete, ytterligare utvidga den molekylära verktygslådan för genom redigering ändamål. En fördel med CRISPR/Cas12a-systemet är att den kan användas i multiplex genom redigering med flera RNAs-ledare som uttrycks från en enda transkriptionell enhet (Single CRISPR RNA (crRNA) array). Vi presenterar ett protokoll för multiplex integration av flera heterologa gener i oberoende loci av S. cerevisiae genomet med hjälp av CRISPR/Cas12a systemet med flera crRNAs uttrycks från en enda crrna array konstruera. Den föreslagna metoden utnyttjar förmågan hos S. cerevisiae att utföra in vivo rekombination av DNA-fragment för att montera den enda crrna matrisen i en Plasmid som kan användas för transformant urval, samt montering av givar-DNA sekvenser som integreras i genomet vid avsedda positioner. Cas12a är pre-uttryckt konstitutivt, underlätta klyvning av S. cerevisiae genomet vid de avsedda positionerna vid uttryck av den enda crrna array. Protokollet omfattar utformning och konstruktion av en enda crRNA array och givare DNA-uttryck kassetter, och utnyttjar en integrationsstrategi som använder sig av unika 50-BP DNA-kopplingar sekvenser och separata integration flank DNA-sekvenser, vilket förenklar experimentell design genom standardisering och modularisering och utökar utbudet av applikationer. Slutligen, vi visar en enkel teknik för att skapa jäst pixel konst med en akustisk flytande hanterare med olikfärgade karotenoid producerar jäst stammar som konstruerades.
CRISPR/CAS-enzymer har otvivelaktigt revolutionerat molekylärbiologi och antagits i stor utsträckning som verktyg för ingenjörs genom i en hastighet som tidigare inte var genomförbar1. Den första modifieringen av en Saccharomyces cerevisiae genom genom redigering av CRISPR/Cas9 Genome rapporterades av DiCarlo et al. 2, demonstrera framgångsrik gen knock-out och göra punktmutationer med hjälp av externt introducerade oligonukleotides. Ytterligare jäst CRISPR Toolbox utveckling ingår: transkriptionell reglering genom fusion av katalytiskt inaktiva Dead Cas9 (dCas9) med transkriptionella effektordomäner för aktivering och ljuddämpning av transkription3, ansökan för både genom redigering och reglerande funktioner för metabolisk vägteknik genom samtidig aktivering, förtryck och radering4, radering av stora fragment från S. cerevisiae Genome5, och multipel-kromosom fusioner6 .
CRISPR/CAS genom redigering system hitta sitt ursprung i adaptiva immunsystem av bakterier och arkéer och dessa system har anpassats av molekylär biologer för genomredigering. Deras funktionalitet är baserad på de grupperade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner (CRISPR) DNA regioner kodning RNA som ansvarar för erkännandet av den främmande DNA eller RNA och CRISPR associerade gener (CAS) som kodar RNA-guidad endonukleaser1,7,8,9. Baserat på den senaste genomanalys av CRISPR/CAS-system föreslogs det att dela upp CRISPR/CAS-systemen i två klasser, fem typer och 16 subtyper10. De två klasserna är framstående baserat på organisationen av effektor komplex inblandade i mål klyvning. Vanligtvis kategoriseras CRISPR/CAS-system med en organisation med flera subenheter som klass 1, medan enstaka subenhet effektor-komplex tillhör klass 210,11. I detta dokument utforskar vi klass 2 typ V Cas12a, tidigare kallad Cpf110,12, vilket är ett alternativ till klass 2 typ II Cas9. Även om Cas9 är väl kännetecknas och ofta används i forskning, Cas12a erbjuder ytterligare funktioner12. För det första, Cas12a bildar ett komplex med CRISPR RNA (crRNA) av 42 till 44 nukleotider utan att kräva en ytterligare trans-aktiverande CRISPR RNA (tracrRNA). Därför kan ett kortare guide-RNA utnyttjas i genomredigering med CRISPR/Cas12a-system jämfört med CRISPR/Cas9. För det andra, den unika Endonuklease och endoribonuclease aktivitet Cas12a möjliggör mognad av dess pre-crRNA13. Denna RNase aktivitet möjliggör kodning av flera crRNAs på en enda CRISPR crRNA array, medan Cas9 kräver separat uttryck för varje så kallade Single-guide RNA (sgRNA) eller alternativt till exempel uttryck för en ytterligare Endonuklease ( t. ex.Csy4) i kombination med igenkännings motiv för Csy4 kring varje sgrna14,15. För det tredje kräver Cas12a mål plats erkännande ett protospacer angränsande motiv (PAM) vid 5 ‘ från målet och klyver efter + 18/+ 23 position från sin PAM resulterar i klyvs DNA med klibbiga ändar, medan Cas9 kräver en PAM ligger på 3 ‘ slutet från mål och klyver efter-3 position skapa trubbiga slutet nedskärningar i DNA12. För det fjärde, den konsensus nukleotid sekvens av PAM skiljer mellan Cas12a ((T) TTV) och Cas9 (NGG), vilket gör Cas12a en lovande kandidat för inriktning T-Rich promotor och Terminator sekvenser16. Slutligen rapporterade en nyligen studie större mål specificitet för Cas12a än för de infödda Cas917.
Vi presenterar ett protokoll för användning av CRISPR/Cas12a-systemet för genomredigering av S. cerevisiae med särskilt fokus på införandet av flera DNA-uttryckskassetter i oberoende genomisk loci samtidigt (multiplex genom redigering) med hjälp av en enda crRNA array. Protokollets viktigaste steg återges i figur 1. Som ett konceptbevis tillämpades CRISPR/Cas12a-systemet för införande av tre uttrycks kassetter i genomet hos S. cerevisiae som möjliggör framställning av β-karoten18 som schematiskt visas i figur 2. Produktion av β-karoten påverkar fenotyp av s. cerevisiae: dvs., efter en lyckad introduktion av alla tre heterologa gener som krävs för karotenoider biosyntes, vita S. cerevisiae celler blir gula eller orange, beroende på uttrycks styrkan hos varje gen promotor. På grund av den enkla visuella uppläsning av denna väg, har det införts för att utveckla avancerade CRISPR-baserade system och metoder för genomredigering19,20. I detta arbete, uttrycks kassetter kodning av karotenoid gener crte, crtyb och crti har konstruerats med hjälp av en Golden Gate kloning (GGC) Approach21 med heterologa initiativtagare och homolog Terminators används för att framföra geners uttryck. Uttrycket kassetter är omgivna av unika 50-Base par (BP) sekvenser, kallas anslutningar, som möjliggör in vivo montering med integration flank DNA-sekvenser (Flanking regioner) med samma 50-BP sekvenser, och efterföljande integration i det genomiska DNA av jäst vid den position som bestäms av kompletterande regioner. Genom att använda olika promotor styrkor, stammar med olika nivåer av karotenoider produktionen erhölls resulterar i variation i färgen på cellerna. Dessa stammar-inspirerad av “Jästkonstprojektet”22 -användes i en spotting setup med en akustisk flytande hanterare för att skapa en 4-färg högupplöst “jäst fotografi” av Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kemist och röntgenkristallograf välkänd för sitt bidrag till upptäckten av DNA-strukturen genom foto 5123,24,25.
Det tillhandahållna protokollet beskriver multiplex genom redigering av S. cerevisiae med hjälp av Cas12a från Lachnospiraceae bakterie ND2006 i kombination med en enda crrna array och donator DNA. Utformningen av den enda crRNA-matrisen och givar-DNA förklaras i detalj. I motsats till det väletablerade CRISPR/Cas9-systemet har CRISPR/Cas12a den unika ytterligare förmågan att bearbeta flera crrnas som uttrycks från en enda crrna-matris13,33. På grund av den här funktionen är samtidig redigering av flera mål enklare att ställa in och kan uppnås i en enda omvandling. Denna enda crRNA array tillvägagångssätt visades före av Zetsche et al. 34 som samtidigt redigerade upp till fyra gener i däggdjursceller med hjälp av AsCas12a, och genom Swiat et al. 35 som introducerade fyra DNA-fragment i ett jästgenomet med FnCas12a. Till vår kännedom har ett större antal samtidiga genomiska modifieringar med hjälp av ett Cas12a-system inte rapporterats och den maximala gränsen för mål per enskild matris för Cas12a är ännu inte fastställt. Ytterligare forskning som utnyttjar enstaka crrna matriser i kombination med Cas12a inkluderar multiplex transkriptionell reglering reglering i ett brett spektrum av organismer33,36,37.
Det finns några kritiska steg i det presenterade protokollet. Noggrant utforma alla DNA-sekvenser som är inblandade i Cas12a genom redigering experiment, särskilt i fall när nya DNA-sekvenser introduceras. Bestäm funktionaliteten hos nya spacer sekvenser del av ett crRNA, till exempel genom en singleplex genomredigering experiment som beskrivs av VERWAAL et al. 19 innan du kombinerar dem till en enda crrna array. Följ rekommendationerna för beredning av omvandling buffert lösningar som används i Cas12a redigering experiment för att uppnå en god omvandling effektivitet jäst.
Det finns några valfria modifieringar av tekniken. Det rekommenderas att använda 1 μg av varje givardna, linearized pRN1120 eller enda crRNA array Expression kassett i omvandlingen, även om användningen av ett lägre DNA-belopp förväntas också resultera i en tillfredsställande omvandlings effektivitet. Utför en test omvandling för att avgöra om lägre DNA-mängder kan användas. Omvandlingen av S. cerevisiae kan utföras med en annan metod än den som beskrivs i detta protokoll, till exempel det protokoll som beskrivs av Gietz et al. (2007) 38. guiden RNA-mottagare plasmid pRN1120 lämpar sig för uttrycket av ett enda crrna och ett enda crrna-utbud av olika Cas12a varianter (t. ex.från acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) as well as för uttryckt av sgRNA i kombination med Cas919. Givaren DNA behöver inte begränsas till karotenoid gen uttrycks kassetter och kompletterande regioner som riktar sig till donator DNA till de beskrivna int1, INT2 och INT3 platser i genomiskt DNA. Alla DNA av intresse kan införas i ett multiplex sätt, till genomiskt DNA av värden av de konstruktionsprinciper som beskrivs i detta protokoll, alternativt kan donator DNA användas för att ta bort DNA från en värd arvsmassa. Den modulära strukturen av Single crRNA array underlättar enkel justering av spacer och direkta upprepningssekvenser. Modifiering av spacer sekvenser möjliggör en ändring av den avsedda integrations Locus som kan utformas med ett av verktygen för identifiering av en genomisk mål plats, t. ex. guidescan programvara 1,039. Istället för att använda stora flanerande sekvenser som innehåller kopplingar sekvenser, 50-BP i kompletterande regionen kan ingå i givaren DNA sekvenser genom att införliva dessa 50-BP kompletterande region sekvenser i primers som används i PCR. I det här fallet, totalt bara tre i stället för nio givare DNA-fragment krävs för en lyckad multiplex Genome redigering experiment.
Sammanfattnings, detta protokoll ger steg-för-steg-anvisningar för att utföra multiplex genom redigering i S. cerevisiae med Cas12a i kombination med en enda crrna array metod. Protokollet demonstrerades av multiplex genom redigering med 9 givardna fragment och en enda crRNA array kodning för tre gRNAs. Vi visar höga övergripande redigerings frekvenser mellan 50% och 94% för de tre stam konstruktioner som rapporteras här. Avslutande, den unika funktionen hos Cas12a är möjligheten att bearbeta en enda crRNA array i enskilda crRNAs i en cell, vilket gör Cas12a ett utmärkt verktyg för att möjliggöra multiplex genom redigering och utveckla transkriptionella förordning moduler inriktning flera uttrycks kassetter på en och samma gå. I slutändan, tre stammar erhölls producera karotenoider på en annan nivå och färger i nyanser mellan gult och orange. Med dessa stammar och en vild-typ stam, vi visade hur en akustisk vätska hanterare kan användas rakt för att göra jäst pixel konst-detta för att hedra Rosalind Franklin som bidrog till upptäckten av DNA-strukturen 65 år sedan av hennes berömda foto 5123 .
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt fick finansiering från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram enligt bidragsavtal nr 686070 (DD-DeCaf) och 764591 (SynCrop), och från forskningsprogrammet byggstenar i livet med projektnummer 737.016.005 av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO). T.E.G. stöddes av Royal Society (Grant UF160357) och BrisSynBio, en BBSRC/EPSRC syntetisk biologi Research Centre (Grant BB/L01386X/1). Vi tackar Zi di och Jeffrey van Wijk för deras bidrag till jäst spotting experiment för att skapa jästen pixel konst.
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
||
ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
||
TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
||
Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |