Automatisert 3D optisk sammenheng tomografi til belyse biofilm Morphogenesis over store romlige skalaer
Summary
Mikrobiell biofilm danner komplekse arkitekturer på interphases og utvikler seg til svært skala-avhengige romlige mønstre. Her introduserer vi et eksperimentelt system (hard-og programvare) for automatisert anskaffelse av 3D optisk sammenheng tomografi (OCT) datasett. Dette verktøysettet tillater ikke-invasiv og multi-skala karakterisering av biofilm morphogenesis i rom og tid.
Abstract
Biofilm er en mest vellykkede mikrobiell livsstil og råde i en rekke miljømessige og konstruerte innstillinger. Forståelse biofilm morphogenesis, som er den strukturelle diversifisering av biofilm under samfunnet forsamlingen, representerer en bemerkelsesverdig utfordring på tvers av romlige og timelige skalaer. Her presenterer vi en automatisert biofilm Imaging system basert på optiske sammenheng tomografi (OCT). OCT er en fremvoksende Imaging teknikk i biofilm forskning. Men mengden av data som for tiden kan skaffes og behandles hemmer statistisk slutning av stor skala mønstre i biofilm morfologi. Det automatisert OCT tenkelig system innrømmer avdekker stor romlig og utbygget Temporal skalaer av biofilm oppblomstringen. Den syndikatene en kommersielt anvendelig OCT system med en Robotic plasserer plattform og en suite av programvare løsninger å administrere plasseringen av det OCT skanning sonde, likeledes idet oppkjøpet og bearbeiding av 3D biofilm tenkelig datasett. Denne setup innrømmer det inne situ og ingen-invasjonen automatisert avlytting av biofilm utviklingen og kanskje være fremme bebygget å par okt tenkelig med macrophotography og microsensor profilering.
Introduction
Biofilm er en svært vellykket mikrobiell livsstil tilpasning og disse Interphase-assosiert og Matrix-vedlagte samfunn av mikroorganismer dominerer mikrobiell liv i naturlige og industrielle innstillinger1,2. Der biofilm form komplekse arkitekturer, slik som langstrakte strøm strømmer3, bølgene4 eller sjampinjong-lignende caps5 med viktige konsekvenser for biofilm vekst, strukturell stabilitet og motstand mot stress6. Mens mye om biofilm strukturelle differensiering har blitt lært fra arbeid på mono-arter kulturer vokst i miniatyr Flow kamre, de fleste biofilm er svært komplekse samfunn ofte inkludert medlemmer av alle domener av livet6. Verdsette disse komplekse biofilm som mikrobielle landskap7 og forstå hvordan biofilm struktur og funksjon samhandle i komplekse samfunn er dermed i forkant av biofilm forskning.
En mekanistisk forståelse av morphogenesis av komplekse biofilm som svar på miljømessige stikkord krever nøye utformede eksperimenter i forbindelse med romlig og timelig løst observasjoner av biofilm fysiske struktur på tvers av relevante skalaer8. Imidlertid har den ikke-destruktive observasjonen av biofilm vekst i eksperimentelle systemer blitt sterkt begrenset av logistikk begrensninger som behovet for å flytte prøver (for eksempel til et mikroskop) ofte skade den delikate biofilm strukturen.
Protokollen som presenteres her introduserer et helautomatisk system basert på optisk sammenheng tomografi (OCT), som gjør at in situ, ikke-invasiv overvåking av biofilm morphogenesis på mesoscale (mm rekkevidde). OCT er en fremvoksende Imaging teknikk i biofilm forskning med applikasjoner i vannbehandling og begroing forskning, medisin9 og stream økologi10. I OCT, en lav sammenheng lys kilde er delt inn i en prøve og referanse arm; forstyrrelser i lyset som reflekteres og spres av biofilm (prøve armen) og lyset fra referanse armen analyseres. En serie med aksial intensitet profiler (A-skanner) som inneholder dybde-løst strukturelle informasjon er ervervet og fusjonert inn i en B-Scan (et tverrsnitt). En serie med tilstøtende B-skanninger komponerer det endelige 3D-volumet for skanning10. Oct gir en lateral optisk oppløsning i området på ca 10 μm og er derfor godt egnet til å studere Mesoskopisk strukturelle differensiering av biofilm10,12. For en mer detaljert beskrivelse av OCT, se Drexler og Fujimoto13og Fercher og kolleger14. Til tross for feltet-av-utsikt av en enkelt OCT XY-avsøke når til flere hundre av kvadrat mikrometer, større-skalaen mønstre kan ikke være kvantifisert ved hjelp av OCT inne en enkelt avsøke. Med hensyn til biofilm i naturlige habitater som bekker og elver, begrenser denne tiden vår evne til å vurdere biofilm morphogenesis i vekter som matcher den fysiske og hydrauliske malen til habitat.
For å overgå disse romlige grensene og å erverve OCT skanninger automatisk, en Spectral-domene OCT Imaging probe ble montert på en 3-akse posisjoneringssystem. Installasjonen tillater oppkjøpet av flere OCT skanninger i en overlappende mosaikk mønster (flis skanning), effektivt oppnå klare avbildning av overflateområder opp til 100 cm2. Den høye posisjonerings presisjonen til dette systemet gjør det dessuten mulig å overvåke veksten og utviklingen av biofilm funksjoner på bestemte steder i løpet av langsiktige eksperimenter på en pålitelig måte. Systemet er modulær og individuelle komponenter (dvs. posisjonering enheten og Oct) av installasjonen kan brukes som frittstående løsninger eller fleksibelt kombinert. Figur 1 gir en oversikt over hard-og programvarekomponenter i installasjonen.
Systemet ble testet med en kommersielt tilgjengelig GRBL-kontrollerte CNC posisjonerings enhet (tabell med materialer). Drifts avstander for denne spesifikke posisjonerings plattformen er 600 × 840 × 140 mm, med en produsent-indikert nøyaktighet på +/-0,05 mm og en programmerbar oppløsning på 0,005 mm. GRBL er en åpen kildekode (GPLv3 License), høyytelses bevegelseskontroll for CNC Enheter. Derfor bør hver GRBL-baserte (versjon > 1,1) posisjonering enheten være kompatibel med retningslinjer og programvarepakker som presenteres her. Videre kan programvaren bli tilpasset andre stepmotor kontrollere med STEP-DIR Inndatatype med få modifikasjoner.
OCT enheten brukes til å vurdere ytelsen til systemet (tabell av materialer) har en lav sammenheng lyskilde med et senter bølgelengde på 930 NM (båndbredde = 160 NM) og justerbar referanse arm lengde og intensitet. I eksempelet som presenteres her, en nedsenking adapter for dyppe OCT sonden i rennende vann ble også brukt (tabell over materialer). Programvarepakken utviklet her for automatisert OCT Scan oppkjøpet kritisk avhenger av SDK leveres sammen med den spesifikke OCT system, men, OCT systemer fra samme produsent med ulike skanne linser og sentrale bølgelengder bør er lett kompatible.
GRBL-enheten styres av en webserver som er installert på en datamaskin med én tavle (figur 1). Dette gir fjernkontroll over enheten fra en hvilken som helst datamaskin med lokale nettverk eller Internett-tilgang. OCT-enheten styres av en egen datamaskin, slik at driften av OCT-systemet til side det automatiserte eksperimentelle oppsettet. Til slutt, programvaren pakkene inkluderer bibliotekene å synkronisere OCT probe posisjonering og OCT Scan oppkjøpet (dvs. å automatisk erverve 3D Imaging datasett i en mosaikk mønster eller i et sett med definerte posisjoner). Definere plasseringen av OCT sonden i 3D effektivt gjør det mulig å justere fokalplanet spesielt for (regionale) sett av skanninger. Spesielt på ujevne overflater kan forskjellige fokal plan (dvs. forskjellige posisjoner i z-retning) spesifiseres for hvert søk i OCT.
Et sett med programvarepakker ble utviklet for å behandle rå OCT-skanninger (tabell 1). Navigering av posisjonerings enheten, OCT skanning oppkjøp og datasett behandling utføres med Python-kodet Jupyter notatbøker, som tillater bemerkelsesverdig fleksibilitet i utvikling og optimalisering av programvaren. To jobbet og kommenterte eksempler på slike notatbøker (for bildeoppkjøp og prosessering, henholdsvis) er tilgjengelige fra https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git de er ment som utgangspunkt for tilpasning av metoden. En Jupyter notisbok er en nettleser basert program som inneholder celler med kommenterte Python-kode. Hvert trinn finnes i en celle i notatblokken, som kan utføres separat. På grunn av den forskjellige lengden på lys banen gjennom skanne linsen (sfærisk avvik)15, RAW Oct skanninger vises forvrengt (figur 2a). Vi utviklet en algoritme for å automatisk korrigere for denne forvrengningen i ervervet OCT skanninger (finnes i ImageProcessing. ipynb, supplerende fil 1). Videre kan biofilm morfologi bli vist som en 2D høyde kart, som tidligere ble brukt i membran systemer16, og vi illustrerer hvordan høyde kart innhentet fra skanninger tatt i en flislegging Array kan bli sydd.
Til slutt, er funksjonaliteten til den beskrevne laboratoriet installasjonen illustrert ved hjelp av en flume eksperiment der phototrophic stream biofilm er utsatt for en gradient av strømningshastighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT Imaging er godt egnet til å løse strukturer i mikrometer rekkevidde med en FOV av flere kvadratmillimeter. Det er således et kraftig verktøy for biofilm forskning10,18. Imidlertid er OCT foreløpig begrenset til et maksimalt skanneområde på 100-256 mm2, mens biofilm strukturelle mønstre ofte overstiger denne romlige skalaen19, spesielt når morfologiske differensiering er drevet av stor skala miljømessige graderinger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mauricio Aguirre Morales for sitt bidrag til utviklingen av dette systemet. Finansiell støtte kom fra Swiss National Science Foundation til T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
