我们在这里提出了一个方案, 分化为每个体细胞衍生物 (肌细胞, 硬化体, 皮肤和合成) 在化学定义的条件下, 这在未来的疾病建模和骨科手术中基于细胞的治疗。
为了响应 Wnt 等信号, 骨形态发生蛋白 (Bmp) 和从周围组织分泌的声波刺猬 (SHH), 体细胞 (Sonic) 产生多种细胞类型, 包括肌瘤 (MYO)、菌核 (SCL)、皮肤病体 (d) 和合成体 (SYN), 依次发展为骨骼肌、轴向骨骼、背真皮和轴向肌腱韧带。因此, 从人类诱导的多能干细胞 (Ipsc) 中生成 Sm 及其衍生物对于获得多能干细胞 (Psc) 用于再生医学和骨科外科领域的疾病研究至关重要。尽管一些研究人员以前曾报告过来自 Psc 的 MYO 和 SCL 诱导协议, 但尚未有研究表明从 Ipsc 中引入了 SYN 和 D。因此, 高效诱导完全胜任的 Sm 仍然是一项重大挑战。在这里, 我们通过模仿鸡鼠 SM 发展过程中的信号环境, 在体外总结人类 Sm 模式, 并报告了在化学条件下从人类 Ipsc 系统诱导 sm 衍生物 (MYO、SCL、D 和 SYN) 的方法。通过预压中胚层 (PSM) 和 SM 状态定义的条件。成功地将有关鸡鼠 SM 发展的知识应用于人 Ipsc 对 Sm 的诱导。该方法可作为研究人体体细胞生成和模式的新工具, 不使用胚胎, 并用于基于细胞的治疗和疾病建模。
从 Psc 开发所需细胞类型的定向分化方法是将 psc 衍生细胞的研究转化为临床应用的必要步骤。关键基因的强迫表达是一种很有希望的从 Psc 分化的细胞, 并提高了我们对胚胎发生过程中细胞命运测定、器官形态发生和组织的遗传调控的认识.此外, 以小鼠和小鸡胚胎的发育为路线图, 对内源性信号环境进行概述, 被认为是 Psc 定向分化的关键。然而, 考虑到 psc 衍生细胞在基于细胞的疗法等临床研究中的应用, 后一种策略更合适, 因为它不需要基因操纵。
几项研究报告了在化学定义条件下从人类和小鼠 Psc 中诱导的中胚层。通常情况下, 这些方法依赖于活性因子β (TGFβ) 信号和骨形态发生蛋白 (BMP) 信号, 被认为是进行中胚层和中胚层分化, 导致低诱导效率副轴中胚层 (约 20%)2。换句话说, 这些信号通路诱导的 psc 衍生的中胚层主要是侧板中胚层, 而不是后轴中胚层。最近, 一些研究证明了基于不同策略3、4、5、6、7、8的psc 衍生的副轴中胚层的高效生产.在这些研究中, 用相对较高浓度的糖原合成酶激酶激酶 3 (wsk3) 抑制剂 (wnt 信号激活剂) 培养 psc, 使副轴间胚层的诱导效率达到 70%-95%6,7.
在体细胞发生过程中, 后轴间胚层首先形成前部中胚层 (psm), 然后通过中膜至上皮过渡9,10在前部形成体细胞 (sm)。缺口配体 delta 样 1 (DLL1) 已知在体体发生过程中起着关键作用, 因为在 mRNA 和蛋白质水平上对 DLL1 表达的振荡控制, 调节 SM 分割。SMs 最终细分为两部分, 导致皮肤内和腹侧硬膜体 (SCL).随后, DM 区分为皮肤科 (D), 真皮的前体, 肌母细胞 (MYO), 骨骼肌的前体;另外, SCL 的腹侧部分形成突触 (SYN), 肌腱和韧带 12的前体 (图 1)。一些研究人员报告了 psc 衍生 sm 衍生物的诱导, 如 myo4、13和 scl14;然而, 这些研究有几个局限性。值得注意的是, 由于我们对 D 和 SYN 信号环境的了解是零碎的, 因此还没有系统地建立 D 和 SYN 的归纳协议。为了证明从 Psc 诱导的 Sm 的充分能力, 有必要显示诱导的 Sm 对所有四种衍生物 (D、MYO、SCL 和 SYN) 的多重分化能力, 而以前的研究只集中在特定的 SM 衍生物。在这里, 我们报告如何通过 PSM 和 SM 命运从人类 Ipsc 15 生成所有四个 SM 导数, 包括 D 和 SYN.我们相信, 建立一个体外逐步方法, 模型 SM 发展过程可以有助于研究人类 SM 如何发展在胚胎发生过程中, 而不使用胚胎。
通过 PSM 诱导 psc 衍生 sm 的一种众所周知的方法是在 PSC 诱导 psm 期间, 而不是在 PSM 成熟过程6中, 将 chr99021 + A83-01 (tgfβ抑制剂) 结合起来。在本研究中, 用 C59 诱导 sm 抑制 Wnt/β-catenin 信号转导。然而, 我们引入了使用 SIR99021 激活 wnt 途径在 SM 分化过程中。这一决定是根据以下调查结果作出的: 在 SM 的周围组织中表达了几个 Wnt, 并考虑到 WNT 记者在sm 20 中处于活跃状态。因此, 我们观察到上皮化, 这是 SM 在体内的一个特征, 只有在 SIR99021 的条件下, 基于 CDH11 在细胞连接中的积累 (图 2e)。这一观察表明, WNT 信号在 PSM 分化和 SM 上皮化过程中的关键参与, 因此我们的协议可以更好地重述内源性信号环境。然而, 这也意味着在分化过程中微调 Wntyβ-catenin 信号通路的进一步可能性, 因为分化的鲁棒性和效率可能因细胞类型、细胞系和各种不同而有显著差异每个研究人员使用的 wnt 诱导剂的化合物。
这种方法还允许我们从人类 Ipsc 生成所有四个 SM 导数, MYO、D、SCL 和 SYN。我们使用 CDM 的逐步协议可用于识别人体体细胞模型中的信号需求, 并为人类 SM 的发展提供重要的见解。例如, 我们的方法可以用于研究分割时钟机制, 一个分子振荡系统, 调节 SM 的形成。它已在小鼠、小鸡和斑马鱼身上进行了彻底的研究, 但由于缺乏适当的实验工具, 在人类身上没有进行过彻底的研究。
此外, 我们的方法还可以适用于未来的临床细胞疗法。例如, 人类 ipsc 衍生的 D 或 SYN 可以移植到严重受伤的皮肤或肌腱断裂进行再生和治疗。但是, 在实际应用此方法之前, 需要解决几个限制。虽然在本研究中, 我们使用 SNL 馈线细胞进行 iPSC 维护和 ECM 解决方案, 这是从恩格尔布雷斯-霍尔姆-热小鼠肉瘤提取, 作为在诱导过程中在盘子表面涂层, 这些非人类动物衍生试剂应该是以提高临床质量。此外, 还必须提高细胞数量和质量, 包括所需细胞的纯度和成熟度。此外, 不仅细胞数量, 而且细胞强度也是肌腱韧带再生的重要特征。此外, 开发用于纯化的表面标记和一种新的三维重建方法对于推进我们的临床细胞疗法方案是必不可少的。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢博士. Junya Toguchida (CiRA) 协助项目管理和资金收购, Mitsuaki Shibata 先生 (CiRA) 和 Mei Terashima 女士 (CiRA) 提供技术援助, Yayoi Toyooka 博士 (CiRA) 和 Daisuke Kamiya 博士 (CiRA)他们校对了手稿, 并为 Masaya Todani 先生 (CiRA) 提供了一个插图 (图 1)。我们还感谢池亚和托古奇达实验室 (CiRA) 的所有成员在本研究期间给予的支持。这项工作得到了日本科学促进会 (26670661) 科学研究赠款的支持, 该项目是利用日本科学和技术局针对疾病的 ips 细胞进行的难治性疾病研究方案机构 (JST) 和日本医学研究与发展机构 (AMED)、实现再生医学研究中心网络的 iPS 细胞研究核心中心以及 iPS 细胞研究基金 (部分前往 Makoto Ikeya 和Junya Toguchida)。Makoto Ikeya 还得到了科学研究赠款 (JSPS) (16H05447) 和利用特定疾病 iPS 细胞进行难治性疾病研究加速方案的支持。
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |