Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتفريق بين الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent في كل مشتق سميط (ميوتومي، سكليروتومي، ديرماتومي، وسينديتومي) في ظروف محددة كيميائيا، والتي لها تطبيقات في النمذجة المرض مستقبلا و العلاجات المستندة إلى الخلية في جراحة العظام.
Abstract
واستجابة لإشارات مثل WNTs، العظام البروتينات مورفوجينيتيك (BMPs)، والقنفذ سونيك (SHH) ويفرز من الأنسجة المحيطة، سميتس (SMs) أن تؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك ميوتومي (ميو)، سكليروتومي (SCL)، ديرماتومي (د)، وسينديتومي (SYN) ، التي تتطور بدورها إلى الهيكل العظمى والعضلات والهيكل العظمى المحوري، الأدمة الظهرية ووتر المحوري/الرباط، على التوالي. ولذلك، توليد SMs ومشتقاتها من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أمر حاسم للحصول على الخلايا الجذعية pluripotent (PSCs) للتطبيق في الطب التجديدي والبحوث في مجال الأمراض في مجال جراحة العظام. على الرغم من أن بروتوكولات تحريض ميو و SCL من PSCs أبلغ سابقا بالعديد من الباحثين، قد دللت دراسة لا بعد التعريفي اصطناعي ومد من إيبسكس. ولذلك، يظل كفاءة تحريض SMs مؤهلة تماما تحديا كبيرا. هنا، نحن الخص الزخرفة SM البشرية مع إيبسكس البشرية في المختبر عن طريق محاكاة البيئة إرسال الإشارات خلال التنمية SM الفرخ/الماوس، وتقرير عن طرق الاستقراء المنهجي لمشتقات SM (ميو SCL، د وأزل) من إيبسكس البشرية تحت كيميائيا شروط محددة من خلال بريسوميتيك mesoderm (PSM) والدول SM. المعرفة بشأن التنمية SM الفرخ/الماوس تم تطبيقها بنجاح على استحثاث SMs مع إيبسكس البشرية. هذا الأسلوب يمكن أن تكون أداة جديدة لدراسة سوميتوجينيسيس البشري والزخرفة دون استخدام الأجنة والنمذجة المرض والعلاج يستند إلى الخلية.
Introduction
تطوير أسلوب المفاضلة موجهة لنوع خلايا المطلوب من PSCs خطوة ضرورية لترجمة دراسة الخلايا المستمدة من PSC إلى التطبيقات السريرية. التعبير القسري من الجينات الرئيسية هو استراتيجية واعدة لتمايز خلايا الجهاز من شركات الأمن الخاصة وتحسن فهمنا لتنظيم الوراثية لتحديد مصير الخلية والجهاز morphogenesis والمنظمة خلال embryogenesis1. وباﻹضافة إلى ذلك، لخص البيئات الإشارات الذاتية، باستخدام تطوير الأجنة الفأرة والفرخ كخارطة طريق، تعتبر ضرورية للتفريق بين توجيه PSCs. ومع ذلك، نظراً للتطبيق المستمدة من PSC خلايا في الدراسات السريرية مثل العلاجات المستندة إلى الخلية، الاستراتيجية الأخيرة أكثر ملاءمة نظراً لأنها لا تتطلب معالجة الجينات.
أفادت دراسات عدة تحريض ميسوديرم من البشر وكيميائيا المعرفة PSCs الماوس في الظروف. عادة، قد اعتمدت على أضافت/العقدي/تحويل عامل النمو β (TGFβ) مما يشير إلى هذه الأساليب والعظام إشارات morphogenetic البروتين (BMP)، ويعتقد أن أداء التمايز ميزو-الأنسجة و mesoderm، مما أدى كفاءة منخفضة التعريفي إلى ال برازيل mesoderm (20 في المائة تقريبا)2. وبعبارة أخرى، كان mesoderm المستمدة من PSC التي تحدثها هذه المسارات مما يشير إلى أساسا mesoderm اللوحة الجانبية، ولا باراكسيال mesoderm. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت الدراسات قليلة الإنتاج الفعال ل mesoderm المستمدة من PSC برازيل استناداً إلى استراتيجيات مختلفة3،،من45،،من67،8 . وفي هذه الدراسات، كانت مثقف PSCs مع تركيزات عالية نسبيا من الجليكوجين synthase كيناز 3 (GSK3) مثبطات (WNT تفعيل الإشارات)، وبالتالي كفاءة التعريفي paraxial mesoderm بلغت 70% – 95%6،7 .
أولاً في سوميتوجينيسيس، mesoderm برازيل أشكال mesoderm بريسوميتيك (PSM) جيدة، ويشكل سميتس (SMs) ثم في الجزء الأمامي من خلال مرحلة انتقالية mesenchyme إلى الظهارية9،10. يجند الدرجة 1 مثل دلتا (DLL1) المعروف أن يكون دوراً محوريا خلال سوميتوجينيسيس، كما تحكم متذبذبة DLL1 التعبير، سواء في مستوى البروتين ومرناً، وينظم تجزئة SM. تقسيم الرسائل القصيرة في نهاية المطاف إلى اثنين من الأجزاء، مما أدى إلى ديرموميوتومي (ألماني) دورسالي وسكليروتومي (SCL) بطنيا11. وفي وقت لاحق، يميز مارك ألماني في ديرماتومي (د)، مقدمة من الأدمة، وميوتومي (ميو)، تمهيدا للهيكل العظمى والعضلات؛ بالإضافة إلى ذلك، تشكل نسبة البطني من SCL سينديتومي (SYN)، تمهيدا ل الأوتار والأربطة12 (الشكل 1). وأفادت بعض الباحثين التعريفي للمشتقات المالية المستمدة من PSC SM مثل ميو4،13 و14من SCL؛ ومع ذلك، هناك العديد من القيود في هذه الدراسات. جدير بالذكر أن نظراً لمعرفتنا بالبيئات مما يشير إلى د وأزل مجزأ، بروتوكولات التعريفي د وأزل لا بعد بشكل منهجي أنشئت. لشرح الكامل-اختصاص SMs التي يتسبب فيها من شركات الأمن الخاصة، من الضروري إظهار التمايز المتعدد قدرة SMs المستحث في جميع المشتقات أربعة (د، ميو، SCL واصطناعي)، في حين أن الدراسات السابقة ركزت فقط على المشتقات SM محددة. هنا، نحن تقريرا عن كيفية توليد جميع المشتقات SM أربعة، بما في ذلك مد واصطناعي، من خلال مصائر PSM و SM من إيبسكس البشرية15. ونحن نعتقد أن إنشاء أسلوب متدرج في المختبر أن النماذج التي يمكن أن تسهم عملية التنمية SM دراسة SM البشرية كيف يتطور خلال embryogenesis، دون استخدام الأجنة.
Protocol
كافة البروتوكولات التجريبية التي تنطوي على إيبسكس البشرية بموافقة "لجنة الأخلاقيات" لقسم الطب ومدرسة الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو.
1-الإنسان إيبسكس "التحضير قبل التعريفي"
ملاحظة: خلايا إيبسكس (201B7-PAX3-بروتينات فلورية خضراء) الثقافة البشرية على تغذية SNL16 مع الرئيسيات ES الخلية المتوسطة وتستكمل مع 4 نانوغرام/مليلتر عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية البشرية المؤتلف (FGF2) والبنسلين 0.5% وستربتوميسين (يشار إليها كالمتوسطة هيسك، انظر الجدول 1). عند التقاء نسبة تصل إلى 70% – 80%، مرور الخلايا كما هو موضح سابقا17.
-
باساجينج من إيبسكس البشرية في SNL تغذية الخلايا17
- باساجينج، إضافة برنامج تلفزيوني في الطبق تثقيف الخلية وشطف الخلايا. ثم إزالة برنامج تلفزيوني (، هذه العملية سوف يكون يشار إلى غسل مع برنامج تلفزيوني).
- أضف 1 مل من محلول التشيكية (انظر الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة (RT) والانتظار حتى تبدأ الخلايا المغذية SNL فصل من الجزء السفلي من الطبق.
- إزالة الحل التشيكية ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- أضف 1 مل متوسطة هيس (انظر الجدول 1) إلى الطبق، ثم تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة وجمع في أنبوب مخروطي 15 مل.
- بلطف "الماصة؛" محتويات خمس مرات استخدام تلميح ميليلتر 1,000، ومن ثم نقل إلى طبق جديدة مليئة بالمتوسطة هيس. استخدام أي انقسام بنسبة 1:4 إلى 01:10، اعتماداً على نسبة التقاء قبل باساجينج. أيضا، يختلف حجم المتوسطة هيس تبعاً لحجم الطبق (مثلاً، 3 مل لطبق 6 سم, 8 مل لطبق 10 سم).
- احتضان إيبسكس البشرية في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
- تغيير الحياة اليومية المتوسطة (باستثناء اليوم بعد باساجينج) وثقافة الخلايا حتى باساجينج الإجراء التالي.
-
خالية من علبة التغذية بالورق استزراع من إيبسكس البشرية قبل التعريفي PSM
ملاحظة: لتقليل تأثير عوامل النمو يفرز من الخلايا المغذية SNL، الثقافة إيبسكس البشرية تحت ظروف خالية من علبة التغذية بالورق مع وسيلة ثقافة خلية خالية من علبة التغذية بالورق (انظر الجدول 1) على الحلول المصفوفة خارج الخلية (ECM) (انظر الجدول 1) المغلفة طبق لمدة 3 أيام قبل تحريض إدارة المشتريات والتوريدات.- اليوم-4 (أربعة أيام قبل البدء بتحريض إدارة المشتريات والتوريدات)
- لتحضير طبق المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة، إضافة 4 مل محلول ECM على طبق 10 سم في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: حل مكان ECM على الجليد أثناء التحضير.
- لتحضير طبق المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة، إضافة 4 مل محلول ECM على طبق 10 سم في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- اليوم-3
- أولاً، إزالة الحل ECM من الطبق وإضافة 8 مل من الخلية خالية من تغذية الثقافة المتوسطة.
- لبدء استزراع خالية من علبة التغذية بالورق، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني شطف الخلايا المستزرعة.
- أضف 1 مل من محلول التشيكية في الرايت حتى تبدأ الخلايا المغذية SNL فصل من الجزء السفلي من الطبق.
ملاحظة: استخدام الفحص المجهري لتأكيد هي فصل كل وحدة تغذية خلايا من القاعدة إلى القمة. - إزالة الحل التشيكية وتغسل مع برنامج تلفزيوني مرتين، حيث أن كافة الخلايا المغذية SNL تتم إزالتها تماما.
- أضف 1 مل من الخلية خالية من تغذية الثقافة المتوسطة إلى الطبق، ثم تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة وجمعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
- بلطف "الماصة؛" محتويات ثلاث مرات باستخدام تلميح 1,000 ميليلتر، ثم نقل إلى طبق المغلفة بحل 10 سم إدارة المحتوى في المؤسسة جديدة (أعد أثناء الخطوة 1.2.1). تستخدم بنسبة حوالي 1:2 إلى 1:4، اعتماداً على نسبة التقاء قبل خالية من علبة التغذية بالورق استزراع انقسام.
- احتضان إيبسكس البشرية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 3 أيام، تغيير في المتوسط في اليوم-1.
- اليوم-4 (أربعة أيام قبل البدء بتحريض إدارة المشتريات والتوريدات)
2-إدارة المشتريات والتوريدات التمايز والعزل بواسطة Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
-
إدارة المشتريات والتوريدات التمايز (0 – يوم 4)
- نضح مستنبت الخلية خالية من التغذية وإضافة 8 مل من PSM التعريفي المتوسطة (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 10 ميكرون SB431542، 10 ميكرون CHIR99021، 2 ميكرومتر DMH1، و 20 نانوغرام/مل FGF2، انظر الجدول 1).
ملاحظة: التقاء الخلية في الشروع في تمايز PSM حاسم بالنسبة لكفاءة التعريفي. استخدام الفحص المجهري للتأكد من أن نسبة المتلاقية هي حوالي 30%. - احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 4 أيام، تغيير المتوسطة في يوم 3.
- حصاد الخلايا لنظام مراقبة الأصول الميدانية في يوم 4 (الفرع 2-2، أدناه).
- نضح مستنبت الخلية خالية من التغذية وإضافة 8 مل من PSM التعريفي المتوسطة (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 10 ميكرون SB431542، 10 ميكرون CHIR99021، 2 ميكرومتر DMH1، و 20 نانوغرام/مل FGF2، انظر الجدول 1).
-
عزل الخلايا PSM إيجابية DLL1 خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
ملاحظة: أدناه إجراء لإعداد الخلية قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إيجابية DLL1. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز باستخدام سيتوميتير تدفق، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.- نضح المتوسطة، ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني. وفي وقت لاحق، إضافة 1 مل كاشف تفكك خلية وتترك لمدة 3 دقائق في الرايت
- إضافة 4 مل من إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة وجمعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
- حساب عدد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية، ثم الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق.
- بعناية إزالة المادة طافية بالطموح وريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (انظر الجدول 1) بتركيز 1.0 × 107 خلايا/مل. لنموذج الرقابة سلبية (مراقبة ايستب، أو في الاتفاقية دون جسم) ونقل 50 ميليلتر في أنبوب مخروطي 15 مل وتعليق ثم مع 450 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
- إضافة جسم DLL1 (انظر الجدول للمواد) في نسبة 1/200. حماية الأنبوب من الضوء والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند في نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (1.0 × 107 خلايا/مل) وتستكمل مع 1 ملغ/مل DAPI بعناية.
- نقل إلى أنبوب جمع، تدمج مع شبكة نايلون 35 ميكرون في عملية النداء الموحد للتصفية، ثم ضع الأنبوبة على الجليد حتى اكتمال الفرز. تنفيذ نفس الإجراء مع مراقبة سلبية العينة (الخطوة 2.2.4).
- إجراء الفرز باستخدام cytometer تدفق وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- جمع الخلايا إيجابية DLL1 تم فرزها في أنبوب مخروطي 15 مل، التي تحتوي على 4 مل من إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 10 ميكرون من Y27632. لاستخراج الحمض النووي الريبي المجموع، الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق ثم ريسوسبيند في المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي وتخزينها عند-30 درجة مئوية. انظر استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي، وإجراءات RT-قبكر (قسم 5.1) للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً.
- إجراء المفاضلة SM استخدام الخلايا تم فرزها وفقا لأدناه البروتوكول (المادة 3).
3-SM التمايز من إدارة المشتريات والتوريدات
-
تمايز SM من فرزها DLL1 إيجابية PSM الخلايا (اليوم يوم 4-8)
ملاحظة: إعداد لوحات 12-جيدا المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة اليوم قبل الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. إعداد صفيحة 12-جيدا المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة وإضافة 1 مل من محلول ECM في كل بئر في 4 درجات مئوية وتترك بين عشية وضحاها. يبقى الحل ECM على الجليد أثناء التحضير.- وبعد الخطوة 2.2.10، أجهزة الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق.
- نضح المادة طافية بعناية وريسوسبيند في 1 مل من SM التعريفي المتوسطة (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 10 ميكرون SB431542 و 5 ميكرون CHIR99021، انظر الجدول 1).
- حساب عدد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية.
- بذور 1.0 × 105 خلايا على كل بئر من لوحات 12-جيدا المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحتوي على 1 مل من SM التعريفي المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون من Y27632.
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة 4 أيام حتى يوم 8. تغيير المتوسطة لا تحتوي على Y27632 في يوم 5 (اليوم بعد فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويوم 7.
- إجراء المفاضلة المشتقات SM استخدام الخلايا SM العمدي وفقا للبروتوكولات أدناه. لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا SM المستحث، جمع الخلايا إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق، ثم ريسوسبيند في المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي وتخزينها عند-30 درجة مئوية.
4-SM المشتقات (مارك ألماني، ميو، د، SCL، أزل) التمايز من SM
ملاحظة: لشرح الكامل-اختصاص SM الخلايا، أولاً أداء مارك ألماني (ديرموميوتومي) والاستقراء SCL (sclerotome) تبعاً لذلك باستخدام خلايا SM المستمدة من اللجنة التوجيهية. وفي وقت لاحق، أداء ميو (myotome) والاستقراء د (ديرماتومي) باستخدام خلايا مارك ألماني، وإجراء التعريفي اصطناعي (سينديتومي) باستخدام الخلايا SCL. وفيما يلي البروتوكولات من أجل تنظيم دورات تعريفية لكل مشتق (مارك ألماني وميو، د، SCL وازل) من فعل SM الخلايا في المختبر.
-
تمايز مارك ألماني من الخلايا SM (8 – يوم 11 يوم)
- نضح المتوسطة، ثم أضف 1 مل متوسطة التعريفي مارك ألماني (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 5 ميكرومتر CHIR99021 و 10 نانوغرام/مل BMP4، انظر الجدول 1).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 3 أيام حتى 11 يوما. تغيير المتوسطة في يوم 10 (التعريفي يوم 2 مارك ألماني).
- أداء ميو واستخدام التمايز د الناجمين عن الخلايا البلدية وفقا للبروتوكولات أدناه.
-
تمايز ميو من خلايا مارك ألماني (اليوم يوم 11 – 41)
- نضح المتوسطة، ثم أضف 1 مل من ميو التعريفي المتوسطة (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 5 ميكرومتر CHIR99021، انظر الجدول 1).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 30 يوما حتى يوم 41. تغيير في المتوسط كل ثلاثة أيام.
-
د التمايز من خلايا مارك ألماني (اليوم يوم 11 – 20)
- نضح المتوسطة، ثم أضف 1 مل من د التعريفي المتوسطة (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 5 ميكرومتر CHIR99021 و 10 نانوغرام/مل BMP4، انظر الجدول 1).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 9 أيام حتى 20 يوم. تغيير في المتوسط كل ثلاثة أيام.
-
تمايز SCL من الخلايا SM (8 – يوم 11 يوم)
- نضح المتوسطة، ثم أضف 1 مل من SCL التعريفي المتوسطة (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 100 نانومتر تبلد و 0.6 ميكرومتر LDN193189، انظر الجدول 1)14.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 3 أيام. تغيير المتوسطة في يوم 10 (2 SCL اليوم التعريفي).
- إجراء تمييز اصطناعي استخدام الخلايا SCL العمدي وفقا للبروتوكول أدناه.
-
تمييز اصطناعي من خلايا SCL (اليوم يوم 11 – 32)
ملاحظة: إعداد لوحات 24-جيدا المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة اليوم قبل بدء التعريفي اصطناعي. إعداد صفيحة 24-جيدا المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة وإضافة 0.5 مل من محلول ECM في كل بئر في 4 درجات مئوية وتترك بين عشية وضحاها. يبقى الحل ECM على الجليد أثناء التحضير.- نضح المتوسطة ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 0.2 مل كاشف تفكك خلية لكل بئر وتترك لمدة 3 دقائق في الرايت
- إضافة 0.8 مل من إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية لكل بئر ثم كشط وجمع كافة الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق.
- نضح المادة طافية بعناية وريسوسبيند في 1 مل من أزل التعريفي المتوسطة-1 (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 20 نانوغرام/مل FGF8، انظر الجدول 1)، ثم عد عدد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية.
- بذور 5.0 × 104 خلايا في كل بئر من ألواح 24-جيدا المغلفة بحل إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحتوي على 1 مل من أزل التعريفي المتوسطة-1.
- احتضان في 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 3 أيام.
- على 14 يوما (3 اصطناعي اليوم التعريفي)، استبدال المتوسطة بازل التعريفي المتوسطة-2 (إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية وتستكمل مع 10 نانوغرام/مل BMP7 و 10 نانوغرام/مل TGFβ3، انظر الجدول 1).
- احتضان في 37 درجة مئوية، مع 5% CO2، لمدة 18 يوما حتى 32 يوما. تغيير في المتوسط كل ثلاثة أيام.
5-وصف للمنتجات المشتقة من اللجنة التوجيهية
ملاحظة: عند المفاضلة، تميز مشتقات إيبسكس البشرية باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-قبكر)، إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية) وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) وفحوصات التحفيز تمتد الميكانيكية، تبعاً لذلك.
-
خلية الحصاد ومجموع استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي والتحليل الكمي لبكر (RT-qPCR) في الوقت الحقيقي
- جمع عينات الخلايا (إجراءات 2.2.10، 3.1.6، 5.4.3) في أنبوب 1.5 مل، ثم الطرد المركزي في 280 x ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية، ثم ريسوسبيند في 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي، قدمتها مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي مجموع مناسبة.
- استخراج الحمض النووي الريبي إجمالي استخدام عدة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- عكس نسخ ميكروغرام 1 معزولة من مجموع الحمض النووي الريبي لكدنا، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- أداء RT-قبكر استخدام الإنزيمات مناسبة والكاشفات والإشعال ووفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. وترد في الجدول 2تسلسل التمهيدي التي استخدمت في هذه الدراسة.
-
إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية)
- قبل تنفيذ إيمونوسيتوتشيميستري مع الأجسام المضادة، إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 2% عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- ل permeabilization، احتضان مع 0.2 ٪ الميثانول أو 0.2% بوليسوربيت 20/برنامج تلفزيوني (يشار إليه فيما يلي برنامج تلفزيوني-T) عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إزالة الكواشف permeabilization وعلاج الخلايا مع مناسبة حجب المخزن المؤقت أو 1% بقرى الزلال/برنامج تلفزيوني عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- إضافة جسم أول المخفف مع المخزن المؤقت حظر 10% في برنامج تلفزيوني-T ومكان على جهاز تهتز عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- أغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-T (إضافة برنامج تلفزيوني-T ووضع على آلة الهز على RT لمدة 10 دقائق).
- إضافة جسم الثاني، تضعف مع المخزن المؤقت حظر 10% في برنامج تلفزيوني-T والمكان على الجهاز تهتز في RT لمدة 60 دقيقة. وترد في الجدول 3الأجسام المضادة الأولى والثانية للمحكمة الجنائية الدولية المستخدمة في هذه الدراسة.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، حماية اللوحة/الطبق من الضوء بالتفاف في إحباط. - تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني-ت.
- لتلطيخ العداد، إضافة DAPI 1/5000 المخفف ببرنامج تلفزيوني والمكان على الجهاز تهتز في RT لمدة 5 دقائق.
- إزالة الحل DAPI وإضافة برنامج تلفزيوني في كل بئر.
- الاحتفال بتلوين الخلية استخدام مجهر الأسفار. بدلاً من ذلك، تخزن اللوحة/الطبق عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
-
مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) للتحليل الوظيفي (د) المستمدة من اللجنة التوجيهية
ملاحظة: الخلايا البشرية تنتجها الخلايا الليفية الجلد (HDF) متوفرة تجارياً. ثقافة المركز الثقافي الفرنسي في دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (انظر الجدول 1).- بذور 1.0 × 105 خلايا د المستمدة من اللجنة التوجيهية والمركز الثقافي الفرنسي على لوحات 24-البئر الذي يحتوي على 1 مل من كل ثقافة متوسطة (د د: التعريفي المتوسط، المركز الثقافي الفرنسي: دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين).
- بعد 3 أيام من استزراع الخلايا، جمع 100 ميليلتر من كل المتوسطة، ضع في أنبوب 1.5 مل، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تنفيذ سلسلة الإجراءات، مثل إضافة الكشف عن الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتحديد العدد الأهداف عن طريق توليد منحنى قياسي ضد تركيز عنصر التحكم عينات أكثر.
-
والرزن التحفيز تمتد الميكانيكية للتحليل الوظيفي لازل المستمدة من اللجنة التوجيهية
ملاحظة: تينوسيتيس البشرية الكبار متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد). الثقافة البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية اصطناعي والكبار تينوسيتيس البشرية في خلية تمتد الجهاز للمقايسة التحفيز تمتد الميكانيكية كما هو موضح أدناه18،19. استخدام SYN التعريفي المتوسط-2 وتينوسيتيس المتوسطة النمو (انظر الجدول للمواد) كوسيلة تثقيف لكل SYN المستمدة من اللجنة التوجيهية والكبار تينوسيتيس البشرية، على التوالي.- في 24 ساعة قبل تمتد، لوحة 1.0 × 105 خلايا اصطناعي المستمدة من اللجنة التوجيهية وتينوسيتيس البشرية على إدارة المحتوى في المؤسسة المتعددة المغلفة بالحل جيدا من نوع السليكون المطاط الدوائر، كل مع سطح ثقافة من 1.5 × 1.5 سم (انظر الجدول للمواد).
- تعيين الدوائر على الجهاز للخلية تمتد، وقوة إجهاد دوري مونواكسيال (0.5 هرتز، 5%) ح 12.
- لاستخراج الحمض النووي الريبي المجموع، إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي، ثم كشط وجمع الخلايا في أنبوب 1.5 مل مجموع استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل RT qPCR اللاحقة (انظر الإجراء 5.1).
Representative Results
وتم الحصول على جميع الأرقام الواردة في هذا التقرير مع إيبسكس 201B7-PAX3-التجارة والنقل، الذي يستبدل اجفب اليل واحد للتسلسل الترميز PAX3 في إكسون 1. وسيكون إنشاء إيبسكس 201B7-PAX3-التجارة والنقل الوارد وصفها في أماكن أخرى (H. ساكوراي، اتصال شخصي). وجرى تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام البرنامج الإحصائي. فقيم أقل من 0.05 اعتبرت هامة.
وصف البشرية خلايا PSM و SM المستمدة من اللجنة التوجيهية
وأجريت لتقييم التفريق بين إيبسكس البشرية نحو SM من خلال الدولة PSM (الشكل 2A)، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، تحليل المحكمة الجنائية الدولية، وتحليل RT-قبكر. كما هو مبين في الشكل 2، ما يزيد على 85% الخلايا كانت إيجابية ل DLL1، علامة على إدارة المشتريات والتوريدات، لكن السلبية ل PAX3، علامة على SM، بعد 4 أيام تحريض PSM مع إيبسكس البشرية. بعد ذلك، أصبح هذا السكان PAX3 إيجابية SM الخلايا بعد 4 أيام من SM التعريفي. وأكد الانتقال PSM-SM أيضا RT-قبكر (الشكل 2D) وغرفة التجارة الدولية (الشكل 2). كانت علامات PSM TBX6، و MSGN1، و WNT3A، المعرب عنها في الدولة PSM (اليوم الرابع)، ولكن لا المعرب عنها في الدولة SM (اليوم الثامن). باراكسيس، MEOX1، و PAX3، علامات SM، أعربت في SM ولكن لا المعرب عنها في إدارة المشتريات والتوريدات. وعلاوة على ذلك، تلطيخ من CDH11، علامة على SM متظهرنه، تراكمت فقط عند تقاطع خلية خلية، بعد إضافة SB431542 مع CHIR99021 (الشكل 2E).
وصف مشتقات SM المستحث من الخلايا البشرية SM المستمدة من اللجنة التوجيهية
لتقييم فاعلية التمايز SM البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية، وقيمت التمايز تجاه مارك ألماني، ميو، د، SCL وأزل (الشكل 3A) بتحليل المحكمة الجنائية الدولية و PAX3 (التجارة والنقل)-الأسفار. كما هو موضح في الشكل 3، التمايز مارك ألماني أكد ALX4 و EN1 تلطيخ، و PAX3 التجارة والنقل-الأسفار؛ وأكد تمايز ميو دخولها، ميج، والميوسين الثقيلة سلسلة (MHC) تلطيخ؛ وأكد تمايز د EN1 و PDGFRa تلطيخ؛ وأكد تمايز SCL PAX1، PAX9، و NKX3.2 تلطيخ؛ وأكد تمييز اصطناعي SCX، تحشر، و COL1A1، و COL1A2 تلطيخ.
توصيف المستحث د واصطناعي
1-مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) للتحليل الوظيفي (د) المستمدة من اللجنة التوجيهية
في الجسم البشري، وهي واحدة من المهام الرئيسية للخلايا الليفية الجلد لإفراز البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مثل الكولاجين وحمض الهيالورونيك هيدرات الجلد والمساعدة في الحفاظ على بنية الجلد. لإثبات أن كانت يفرز كمية مماثلة من بروتينات الكولاجين من نوع 1 وحمض الهيالورونيك في الأجلين المتوسط والثقافة المستمدة من اللجنة التوجيهية د والمركز الثقافي الفرنسي، أنجز أليسا، كما هو مبين في الشكل 4A.
2-الميكانيكية تمتد المقايسة التحفيز للتحليل الوظيفي لازل المستمدة من اللجنة التوجيهية
وكما سبق لي أن ذكرت عدة دراسات، التحفيز الميكانيكي يؤثر على وتر التنمية قبل وبعد الولادة، ويعزز التفريق بين تينوسيتيس من18،الخلايا السلائف19. ولذلك، من المعروف جيدا أن مفاعليه إلى الإجهاد الميكانيكية واحدة من خصائص تينوسيتيس. بإثبات مفاعليه المقارنة اصطناعي البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية والبشرية تينوسيتيس الكبار، أنجز مقايسة تحفيز تمتد ميكانيكية كما هو موضح في الشكل 4 باء.
رقم 1: عرض تخطيطي للتفريق بين التسلسل الهرمي mesoderm برازيل. ميسوديرم بريسوميتيك من سكان خلية عابر يظهر خلال embryogenesis المبكر ويخضع لتجزئة للنموذج سميتس. سميتس، هي عدد سكان عابر خلايا الجذعية الذي يؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا، مثل خلايا سكليروتومي، ديرموميوتومي، سينديتومي، ديرماتومي وميوتومي، التي تميز في نهاية المطاف في باطن الجلد والهيكل العظمى والعضلات، وتر/الرباط والعظم/الغضروف الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، الرايت-قبكر، والمحكمة الجنائية الدولية PSM البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية والدمتوسط (أ) عرض التخطيطي لبروتوكول للتمايز SM من خلال إدارة المشتريات والتوريدات. (ب) الأرض دوت الممثل لتلطيخ DLL1 و PAX3 (التجارة والنقل)-الأسفار في يوم 4 التعريفي PSM ويوم 4 (يوم 8 من اللجنة التوجيهية) SM التعريفي. صور الممثل immunocytochemical (ج) و PAX3 (التجارة والنقل)-الأسفار في يوم 4 التعريفي PSM ويوم 4 (يوم 8 من اللجنة التوجيهية) SM التعريفي. الخلايا كانت ملطخة بمكافحة TBX6، وباراكسيس، و MEOX1 الأجسام المضادة (أحمر) وشارك ملطخة DAPI (أزرق) أو الكشف عنها مع PAX3 التجارة والنقل-الأسفار (أخضر). (د) تحليل RT-qPCR لعلامات لإدارة المشتريات والتوريدات و SM في اللجنة التوجيهية، PSM و SM. وترد وسائل ± الخطأ القياسي (جنوب شرق) من ثلاث مجموعات من التجارب. صور immunocytochemical الممثل (ه) في يوم 4 (يوم 8 من اللجنة التوجيهية) SM، مثقف في S10I10 (خليط من SB431542 و IWR1، مثبط لإشارات WNT)، S10 (SB431542)، و S10C5 الظروف (مجموعة من SB431542 و CHIR99021). الخلايا كانت ملطخة بالأجسام المضادة CDH11 (أحمر) وشارك ملطخة DAPI (أزرق). البرامج المتكاملة، الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent؛ إدارة المشتريات والتوريدات، ميسوديرم بريسوميتيك؛ SM، سميط؛ S10، SB431542 10 ميكرومترات؛ C5, CHIR99021 5 ميكرومترات؛ I10، IWR1 10 ميكرومترات؛ تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من ناكاجيما et al. (2018)15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل المحكمة الجنائية الدولية مارك ألماني، ميو، د، SCL وأزل متباينة من البشر الدمتوسط المستمدة من اللجنة التوجيهية (أ) عرض التخطيطي من البروتوكولات للتمايز المشتقات SM. (ب) ممثل إيمونوسيتوتشيميكال الصور و PAX3 (التجارة والنقل)-الأسفار في يوم 3 (يوم 11 من اللجنة التوجيهية) الاستقراء مارك ألماني ويوم 30 (يوم 41 من اللجنة التوجيهية) الاستقراء ميو، يوم 9 (يوم 20 من اللجنة التوجيهية) الاستقراء د، 3 (يوم 11 من اللجنة التوجيهية) SCL التعريفي، واليوم 21 (يوم 32 من اللجنة التوجيهية) الاستقراء اصطناعي. مارك ألماني، والخلايا كانت ملطخة بمكافحة ALX4 والأجسام المضادة EN1 (أحمر) وشارك ملطخة DAPI (أزرق) أو الكشف عنها مع PAX3 التجارة والنقل-الأسفار (الأخضر)؛ ميو، خلايا كانت ملطخة بمكافحة دخولها، ميج (أحمر)، والأجسام المضادة MHC (سماوي)، كما شارك ملطخة DAPI (أزرق)؛ د من الخلايا كانت ملطخة بمكافحة-EN1 (أحمر) والأجسام المضادة PDGFRa (سماوي) وشارك ملطخة DAPI (أزرق)؛ كانت الزنزانات SCL، ملطخة بمكافحة PAX1، و PAX9، و NKX3.2 الأجسام المضادة (أحمر)، وشارك ملطخة DAPI (أزرق)؛ اصطناعي، وكانت الزنزانات ملطخة بمكافحة SCX، تحشر، COL1A1، و COL1A2 الأجسام المضادة (أحمر)، وشارك ملطخة DAPI (أزرق). مارك ألماني، ديرموميوتومي؛ ميو، ميوتومي؛ د، ديرماتومي؛ SCL، سكليروتومي؛ SYN، سينديتومي؛ تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من ناكاجيما et al. (2018)15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: المقايسة الوظيفية المستحثة د و SYN. (أ) كمية الكولاجين من نوع 1 وهيالورونيك حامض تم تحليل البروتينات في الأجلين المتوسط والثقافة قبل أليسا. (ب) تأثير تمتد الميكانيكية التحفيز اصطناعي المستحث والبشرية تينوسيتيس الكبار قيمت قبل RT-قبكر. وترد وسائل ± الخطأ القياسي (جنوب شرق) من ثلاث مجموعات من التجارب. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01؛ ف < 0.001 ب Dunnett's عدة مقارنات اختبار t مقارنة بامتداد (-)؛ n.s، ليس كبيرا، المركز الثقافي الفرنسي، البشرية الكبار عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية. وقد تم تعديل هذا الرقم من ناكاجيما et al. (2018)15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| متوسطة/الحل | ريجانت | تركيز |
| إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | Iscove لتعديل F12 المتوسطة/لحم الخنزير دولبيكو | 1:1 |
| البنسلين/ستربتوميسين | 0.5% | |
| تعريف تركز الدهون كيميائيا | 1% | |
| ترانسفيرين Apo | 15 ملغ/مل | |
| مونوثيوجليسيرول | 450 مم | |
| ألبومين المصل البقري | 5 ملغ/مل | |
| الأنسولين | 7 مغ/مل | |
| الحل التشيكية | المياه | - |
| التربسين | 0.25% | |
| كولاجيناز الرابع | 0.1 مغ/مل | |
| كلوريد الكالسيوم | 1 مم | |
| ريال خروج المغلوب | 20% | |
| د الاستقراء المتوسطة | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| CHIR99021 | 5 ميكرومتر | |
| BMP4 | 10 نانوغرام/مل | |
| مارك ألماني التعريفي المتوسطة | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| CHIR99021 | 5 ميكرومتر | |
| BMP4 | 10 نانوغرام/مل | |
| حل إدارة المحتوى في المؤسسة | المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية | 0.3 ملغ/مل |
| DMEM/F12 | - | |
| المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية | برنامج تلفزيوني | - |
| ألبومين المصل البقري | 0.1% | |
| الخلية الحرة تغذية ثقافة متوسطة | mTeSR1 | - |
| البنسلين/ستربتوميسين | 0.5% | |
| المركز الثقافي الفرنسي الثقافة المتوسطة | دميم | - |
| مصل الدم البقري الجنين | 10 ٪ | |
| المتوسطة هيسك | الرئيسيات دإط الخلايا المتوسطة | - |
| البنسلين/ستربتوميسين | 0.5% | |
| FGF2 | 4 نانوغرام/مليلتر | |
| ميو التعريفي المتوسطة | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| CHIR99021 | 5 ميكرومتر | |
| إدارة المشتريات والتوريدات التعريفي المتوسطة | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| SB431542 | 10 ميكرومتر | |
| CHIR99021 | 10 ميكرومتر | |
| DMH1 | 2 ميكرومتر | |
| FGF2 | 20 نانوغرام/مليلتر | |
| SCL التعريفي المتوسطة | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| تبلد | 100 نانومتر | |
| LDN193189 | 0.6 ميكرومتر | |
| SM التعريفي المتوسطة | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| SB431542 | 10 ميكرومتر | |
| CHIR99021 | 5 ميكرومتر | |
| أزل التعريف المتوسطة-1 | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| FGF8 | 20 نانوغرام/مليلتر | |
| أزل التعريف المتوسطة-2 | إليه التنمية النظيفة متوسطة القاعدية | - |
| BMP7 | 10 نانوغرام/مل | |
| TGFΒ3 | 10 نانوغرام/مل |
الجدول 1: وصفات وسائل الإعلام والحل.
| الاسم | إلى الأمام | عكس |
| أكتب | كاككاتجكاتجاجكجتك | أجتكتتجكجاتجتككاكجت |
| COL1A1 | جاكاكاجاجتتكاجتغت | جكاككاتكاتتككاكجاجك |
| MEOX1 | جاجاتجكجتااككتجا | جاكتجاجاجكتجتجا |
| MSGN1 | جاجاجكتكاجاتجاجا | جتكتجتجاجتككككجاتجت |
| باراكسيس | تككتجاجاجكتجتجاجات | كاكاكككتجتكاككاكاجت |
| PAX3 | أجاجاجكاجاجااج | كاجكتجتكتجكتجتجاج |
| SCX | كككااكاجاتكتجكاككتك | جكجاتكجكتجتكتتكتجتك |
| TBX6 | أجككتجتجتكتتككاتكجت | أجكتجتكاكجاجاتجات |
| تنمد | كككتكاتجكتجاجككاكت | كتكاكتتكاجكاجاتججج |
| WNT3A | كاجاتجكاتككاجاجت | أتجاجكجتجتكاكتجكااج |
الجدول 2: تسلسل التمهيدي لتحليل RT-قبكر.
| تركيز | ||
| 1 جسم مضاد |
ALX4_Goat | 1/50 |
| CDH11_Mouse | 1/1000 | |
| COL1A1_Rabbit | 1/100 | |
| COL2A1_Mouse | 1-2 ميكروغرام/مل | |
| EN1_Rabbit | 1/50 | |
| MEOX1_Rabbit | 1/50 | |
| MHC_Rabbit | 1/200 | |
| MKX_Rabbit | 1/50 | |
| MYOD_Rabbit | 1/500 | |
| MYOG_Mouse | 1/400 | |
| NKX3.2_Rabbit | 1/50 | |
| PARAXIS_Rabbit | 1/50 | |
| PAX1_Rabbit | 1/50 | |
| PAX9_Rabbit | 1/50 | |
| PDGFRa_Goat | 1/100 | |
| SCX_Rabbit | 1/50 | |
| TBX6_Goat | 1/50 | |
| 2 جسم مضاد |
حمار المضادة antibody555 الثانوية IgG(H+L) الماعز | 1/500 |
| حمار المضادة antibody647 الثانوية IgG(H+L) الماعز | 1/500 | |
| ماعز لمكافحة antibody555 IgG(H+L) الماوس الثانوي | 1/500 | |
| ماعز المضادة antibody555 الثانوية IgG(H+L) الأرنب | 1/500 | |
| ماعز المضادة antibody647 الثانوية IgG(H+L) الأرنب | 1/500 |
الجدول 3: الأولى والثانية الأجسام المضادة للمحكمة الجنائية الدولية.
Discussion
طريقة معروفة لاستحثاث المستمدة من PSC SM من خلال إدارة المشتريات والتوريدات هو المزيج من CHIR99021 + A83-01 (مثبط TGFβ) خلال الاستقراء PSM من PSC، ولكن ليس أثناء عملية النضج PSM6. في هذه الدراسة، إشارات WNT/بيتا-كاتينين كان يعوق استخدام C59 للحث على SM من إدارة المشتريات والتوريدات. ومع ذلك، ادخلنا استخدام CHIR99021 لتنشيط مسار WNT خلال التمايز SM. اتخذ هذا القرار بناء على استنتاج أن WNTs عدة أعربت في الأنسجة المحيطة بها من SM ونظرا لحقيقة أن الصحفيين WNT ينشط في SM20. نتيجة لذلك، لاحظنا epithelialization، سمة من سمات SM الحية، إلا بموجب الشرط مع CHIR99021، استناداً إلى تراكم CDH11 في تقاطعات--الخلية (الشكل 2E). وهذه الملاحظة تشير إلى مشاركة حاسمة WNT الإشارات خلال التمايز PSM و epithelialization SM، ولذلك لدينا بروتوكول قد الخص أفضل مما يشير إلى البيئة المحلية. ومع ذلك، فإنه يعني أيضا إمكانية أخرى لصقل WNT/بيتا-كاتينين إشارات الطريق خلال التمايز، نظراً لقوة وكفاءة من التمايز قد تتفاوت تفاوتاً كبيرا تبعاً لأنواع الخلايا، وخطوط الخلية، ومختلف المركبات الكيميائية من WNT-المحرضات التي يستخدمها كل باحث.
هذا الأسلوب يسمح لنا أيضا لتوليد كل أربعة SM المشتقات، ميو، د، SCL، واصطناعي، من إيبسكس البشرية. لدينا بروتوكولات التدرجي باستخدام إليه التنمية النظيفة يمكن استخدامها لتحديد متطلبات إرسال الإشارات خلال البشرية سوميتوجينيسيس/سميط الزخرفة، وتقدم أفكاراً هامة في التنمية البشرية SM. على سبيل المثال، يمكن أن يكون لدينا أساليب مفيدة لدراسة آليات تجزئة على مدار الساعة، نظام التذبذب جزيئية التي تنظم تشكيل SM. قد حققت دقة في الفئران والدجاج والزرد، ولكن ليس في البشر بسبب الافتقار إلى الأدوات التجريبية المناسبة.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون لدينا أسلوب تنطبق على المستقبل العلاج السريري يستند إلى الخلية. على سبيل المثال، د البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية أو اصطناعي يمكن زرعها في شدة إصابة الجلد أو تمزق الأوتار للتجدد والعلاج. ومع ذلك، العديد من القيود يلزم حلها قبل هذا الأسلوب يمكن تطبيقها عمليا. على الرغم من أن في هذه الدراسة، كنا SNL تغذية الخلايا للحفاظ على اللجنة التوجيهية وحل إدارة المحتوى في المؤسسة، والذي يستخرج من ساركومه الماوس انجيلبريث-هولم-سرب، كمعطف سطحية على الطبق أثناء التعريفي، وينبغي أن تكون هذه الكواشف المستخلصة من الحيوانات غير البشرية إزالة لتحسين الجودة السريرية. وباﻹضافة إلى ذلك، الخلية الكمية والنوعية، التي تضم النقاء ونضوج الخلايا المطلوب، يجب أيضا تحسين. وعلاوة على ذلك، عدد الخلايا ليس فقط ولكن أيضا قوة الخلية سمة هامة لتجديد وتر/الرباط. بالإضافة إلى ذلك، يتم وضع علامات السطحية لتنقية وطريقة جديدة لإعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد لا غنى عنها من أجل المضي قدما لدينا بروتوكولات للعلاج السريري يستند إلى الخلية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور جونيا توجوتشيدا (بنا) لمساعدته مع إدارة المشروع، وتمويل اقتناء، السيد ميتسواكي شيباتا (بنا) والسيدة مي تيراشيما (بنا) للمساعدة التقنية، والدكتور Yayoi تويوكا (بنا) والدكتور دايسوكي كاميا (بنا) على على تصحيح التجارب المطبعية المخطوط، والسيد ماسايا توداني (بنا) لتوفير مثال (الشكل 1). ونشكر أيضا جميع أعضاء مختبرات إيكييا وتوجوتشيدا (بنا) على دعمهم خلال هذه الدراسة. هذا العمل يدعمها الإقراض "البحث العلمي" من "الجمعية اليابانية" للترويج للعلوم (JSPS) (26670661)، البرنامج لخلايا iPS المستعصية أمراض بحوث الاستفادة من المرض محددة من اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة (JST)، والوكالة اليابانية "الأبحاث الطبية" والتنمية (AMED)، ومركز iPS "أبحاث الخلايا" شبكة مركز البحوث "تحقيق الطب التجديدي" (JST/AMED)، والبرامج المتكاملة "وصندوق أبحاث الخلية" الأساسية (في جزء منه إلى ايكيا ماكوتو و جونيا توجوتشيدا). كما أيده ايكيا ماكوتو معونة للبحوث العلمية (JSPS) (ح 16 05447) و "برنامج تسريع" "بحوث أمراض مستعصية على الحل" استخدام خلايا iPS الخاصة بالمرض (AMED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
| Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
| CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
| Cell streching device | Strex | STB-140 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | |
| COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
| COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
| Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
| DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
| DMEM | Sigma | D6046 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
| DMH1 | Tocris | 4126 | |
| EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
| Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
| FGF2 | Wako | 060-04543 | |
| FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
| Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
| Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
| Insulin | Wako | 090-06474 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
| Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Axon | 1509 | |
| Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
| MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
| MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
| MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
| Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
| MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
| MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
| NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
| Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
| PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
| PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
| PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
| PBS | - | - | |
| PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
| SAG | Calbiochem | 566661 | |
| SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
| SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
| TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
| Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
| TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
| Trypsin | Gibco | 15090046 |
References
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), e61540 (2013).
- Sakurai, H., et al. In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), e47078 (2012).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocl. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
- Umeda, K., et al. Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 2, 455 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Xi, H., et al. In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Reports. 18 (6), 1573-1585 (2017).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Tam, P. P., Beddington, R. S. The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development. 99 (1), 109-126 (1987).
- Aulehla, A., Pourquie, O. Signaling gradients during paraxial mesoderm development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a000869 (2010).
- Christ, B., Scaal, M. Formation and differentiation of avian somite derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 638, 1-41 (2008).
- Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
- Sakurai, H., et al. Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium. Stem Cell Research. 3 (2-3), 157-169 (2009).
- Zhao, J., et al. Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells. Development. 141 (20), 3848-3858 (2014).
- Nakajima, T., et al. Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells. Development. 145 (16), (2018).
- McMahon, A. P., Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell. 62 (6), 1073-1085 (1990).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Suzuki, H., et al. targeting of the transcription factor Mohawk in rats causes heterotopic ossification of Achilles tendon via failed tenogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7840-7845 (2016).
- Marturano, J. E., Arena, J. D., Schiller, Z. A., Georgakoudi, I., Kuo, C. K. Characterization of mechanical and biochemical properties of developing embryonic tendon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6370-6375 (2013).
- Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).
