Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für die Differenzierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in jeder Somiten Derivat (Myotom, Sklerotom Dermatome und Syndetome) in chemisch definierten Bedingungen, die hat Anwendungen in zukünftigen Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien in der orthopädischen Chirurgie.
In Reaktion auf Signale wie WNTs Knochen morphogenetische Proteine (BMPs) und sonic Hedgehog (SHH) abgesondert vom umgebenden Gewebe, Somiten (SMs) geben Anlass zu mehreren Zelltypen, einschließlich der Myotome (MYO), Sklerotom (SCL), Dermatom (D) und Syndetome (SYN) , die wiederum in Skelettmuskel, Achsenskeletts, dorsal Dermis und axiale Sehnen/Bänder, bzw. entwickeln. Daher ist die Erzeugung von SMs und deren Derivate aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) kritisch zu pluripotenten Stammzellen (EAP) für die Anwendung in der regenerativen Medizin und zur Erforschung von Krankheiten im Bereich der orthopädischen Chirurgie. Obwohl die Induktion-Protokolle für MYO und SCL von EAP zuvor von einigen Forschern gemeldet worden sind, hat keine Studie noch die Induktion von SYN und D aus iPSCs bewiesen. Effiziente Induktion voll geschäftsfähig SMS bleibt daher eine große Herausforderung. Rekapitulieren wir hier menschliche SM Musterung mit in-vitro-menschlichen iPSCs durch die Nachahmung der Signalisierung Umwelt während Küken/Maus SM Entwicklungs- und Bericht über die Methoden der systematischen Induktion von SM-Derivate (MYO, SCL, D und SYN) aus menschlichen iPSCs unter chemisch definierten Bedingungen durch die presomitic Mesoderm (PSM) und SM Staaten. Wissen in Bezug auf Küken/Maus SM Entwicklung wurde erfolgreich zur Induktion von SMs mit menschlichen iPSCs eingesetzt. Diese Methode könnte eine neuartige Werkzeug zur Erforschung menschlichen Somitogenesis und ohne den Einsatz von Embryonen und für zellbasierte Therapien und Krankheit Modellierung Musterung.
Entwicklung einer gezielten Differenzierung-Methode für einen gewünschten Zelltyp von EAP ist ein notwendiger Schritt für die Studie der PSC-abgeleitete Zellen in klinische Anwendungen umzusetzen. Erzwungene Ausdruck Schlüsselgene ist eine vielversprechende Strategie für Orgel-Zell-Differenzierung von einheitlichen Ansprechpartner und unser Verständnis der genetischen Regulierung der Zelle Schicksal Entschlossenheit, Orgel Morphogenese und Organisation während der Embryogenese1verbessert. Darüber hinaus Rekapitulation der endogenen Signalisierung Umgebungen, mit der Entwicklung von Maus und Küken Embryonen als eine Roadmap für die gezielte Differenzierung der einheitlichen Ansprechpartner gilt. Jedoch ist angesichts der Anwendung der PSC-abgeleitete Zellen in klinischen Studien wie zellbasierte Therapien, die letzte Strategie besser geeignet da es keine Genmanipulation erfordert.
Mehrere Studien haben berichtet, die Induktion von Mesoderm von Mensch und Maus EAP in chemisch definierten Bedingungen. In der Regel diese Methoden haben sich verlassen auf Activin/Knoten/Umwandlung Wachstumsfaktor β (TGFβ) Signalisierung und Knochen morphogenetische Protein (BMP) Signalisierung, geglaubt, um führen Sie Meso-Entoderm und Mesoderm Differenzierung, was zu einem niedrigen Induktion-Wirkungsgrad von die achsnahen Mesoderm (ca. 20 %)2. Das heißt, war das PSC abgeleitet Mesoderm induziert durch diese Signalwege hauptsächlich seitliches Platte Mesoderm und nicht achsparallel Mesoderm. Vor kurzem, haben einige Studien die effiziente Produktion von PSC abgeleitet achsparallel Mesoderm basierend auf unterschiedliche Strategien3,4,5,6,7,8 gezeigt. . In diesen Studien wurden mit relativ hohen Konzentrationen von Glykogen-Synthase Kinase 3 (GSK3) EAP kultiviert-Inhibitoren (WNT signalisieren Aktivatoren), folglich die Induktion Effizienz der achsnahen Mesoderm erreicht 70 – 95 %6,7 .
In Somitogenesis das achsparallel Mesoderm zuerst bildet das presomitic Mesoderm (PSM) nach hinten, und dann bildet Somiten (SMs) im vorderen Teil durch Mesenchym-epithelialen Übergang9,10. Notch-Liganden Delta-Like 1 (DLL1) ist bekannt, eine zentrale Rolle während der Somitogenesis, haben als oszillierende Kontrolle der DLL1 Ausdruck, beide in mRNA und Protein-Ebene, SM Segmentierung regelt. SMs schließlich unterteilen in zwei Teile, wodurch sich die Dermomyotome (DM) dorsal und Sklerotom (SCL) ventral11. Danach unterscheidet die DM in das Dermatom (D), ein Vorläufer der Dermis und Myotome (MYO), ein Vorläufer des skelettartigen Muskels; Darüber hinaus bildet ein ventraler Teil des SCL Syndetome (SYN), ein Vorläufer der Sehnen und Bänder12 (Abbildung 1). Einige Forscher haben die Induktion von PSC abgeleitet SM-Derivaten wie MYO4,13 und SCL-14berichtet; Es gibt jedoch einige Einschränkungen in diesen Studien. Vor allem, da unser Wissen über die Signalisierung Umgebungen von D und SYN fragmentarisch ist, Induktion Protokolle für D und SYN nicht noch systematisch entstanden. Um die volle Kompetenz der SMs induziert von EAP zu demonstrieren, es ist wichtig, die Multi-Differenzierung zu zeigen Kapazität der induzierten SMs in alle vier Derivate (D, MYO, SCL und SYN), während frühere Studien nur auf bestimmte SM Derivate konzentriert haben. Hier berichten wir über alle vier SM-Derivate, einschließlich D und SYN, durch PSM und SM Schicksale von menschlichen iPSCs15Generierung. Wir glauben, dass zur Gründung einer in-vitro-schrittweisen Methode, dass Modelle, die zur Erforschung der menschlichen SM SM-Entwicklungsprozess beitragen könnten in der Embryogenese, ohne Verwendung von Embryonen entwickelt.
Eine bekannte Methode zur Einarbeitung von PSC abgeleitet SM durch PSM ist die Kombination von CHIR99021 + A83-01 (TGFβ-Hemmer) bei PSM Induktion von PSC, aber nicht während der PSM Reifung Prozess6. In der vorliegenden Studie war WNT/Beta-Catenin-Signalisierung gehemmt mit C59 induzieren SM von PSM. Allerdings haben wir den Einsatz von CHIR99021, der WNT-Signalweg bei SM Differenzierung zu aktivieren. Diese Entscheidung wurde auf der Erkenntnis basiert, dass mehrere WNTs in das umliegende Gewebe von SM ausgedrückt und angesichts der Tatsache, dass WNT Reporter im SM20aktiv sind. Infolgedessen haben wir beobachtet Epithelisierung, ein Merkmal der SM in vivo nur unter der Bedingung mit CHIR99021, basierend auf die Ansammlung von CDH11 in Zell-Zell Verbindungen (Abb. 2E). Diese Beobachtung zeigt die kritische Auseinandersetzung der WNT signalisieren während PSM Differenzierung und SM Epithelisierung, daher, dass unser Protokoll die endogene Signalisierung Umwelt besser rekapitulieren kann. Es bedeutet jedoch auch eine weitere Möglichkeit der Feinabstimmung der WNT/Beta-Catenin Signalweg während der Differenzierung, weil Robustheit und Effizienz der Differenzierung je nach die Zelltypen, Zell-Linien und verschiedene erheblich variieren kann chemische Verbindungen des WNT-Induktoren von jedem Forscher verwendet.
Diese Methode ermöglicht auch alle vier SM Derivate, MYO, D, SCL und SYN, aus menschlichen iPSCs zu generieren. Unsere schrittweise Protokolle mit CDM können verwendet werden, um die Signalisierung Anforderungen während der menschlichen Somitogenesis/Somiten Musterung zu identifizieren und liefern wichtige Erkenntnisse der Bildungsforschung SM. Beispielsweise könnte unsere Methoden für das Studium Segmentierung Uhr Mechanismen, eine molekulare Schwingung-System, das regelt die Bildung von SM nützlich sein. Es wurde bei Mäusen, Küken und Zebrafisch, aber nicht beim Menschen aufgrund des Fehlens entsprechender experimentellen Tools gründlich untersucht.
Darüber hinaus kann unsere Methode auf künftige klinische zellbasierte Therapien anwendbar. Zum Beispiel menschlichen iPSC abgeleitet D SYN in schwer verletzter Haut transplantiert werden kann oder geplatzten Sehnen für Regeneration und Behandlung. Einige Einschränkungen müssen jedoch gelöst werden, bevor diese Methode praktisch angewendet werden kann. Obwohl in der vorliegenden Studie verwendet wir SNL-Feeder-Zellen für iPSC Wartung und ECM-Lösung, die aus der Engelbreth-Holm-Schwarm Maus Sarkom, als Oberfläche Mantel auf dem Teller während der Induktion, extrahiert wird sollte diese nichtmenschlichen tierische Reagenzien entfernt, um klinische Qualität zu verbessern. Darüber hinaus müssen die Zelle Quantität und Qualität, die die Reinheit und die Reifung der gewünschten Zellen umfasst, auch verbessert werden. Darüber hinaus ist nicht nur die Anzahl von Zellen, sondern auch die Stärke der Zelle ein wichtiges Merkmal für die Regeneration von Sehnen/Bänder. Darüber hinaus die Entwicklung der Oberflächenmarker für Reinigung und eine neuartige Methode zur 3D Rekonstruktion sind unerlässlich, um unsere Protokolle, zellbasierte Therapien voraus.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Dr. Junya Toguchida (CiRA) danken für seine Hilfe mit Projektverwaltung und Finanzierung der Akquisition, Herr Mitsuaki Shibata (CiRA) und Frau Mei Terashima (CiRA) für ihre technische Unterstützung, Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) und Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) Ihre Korrektur des Manuskripts und Herr Masaya Todani (CiRA) für die Bereitstellung einer Illustration (Abbildung 1). Wir danken auch allen Mitgliedern des Ikeya und Toguchida Labors (CiRA) für ihre Unterstützung während der Studie. Diese Arbeit wurde von Grants-in-aid für die wissenschaftliche Forschung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) (26670661), das Programm für die hartnäckigen Krankheiten Forschung unter Verwendung krankheitsspezifische iPS-Zellen aus der Japan Science and Technology unterstützt Agentur (JST) und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED), dem Kern-Zentrum für iPS Cell Research Center Forschungsnetzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin (JST/AMED) und die iPS Cell Research Fund (teilweise zu Makoto Ikeya und Junya Toguchida). Makoto Ikeya wurde auch von Grants-in-aid für wissenschaftliche Forschung (JSPS) (16 H 05447) und das Acceleration Programm für hartnäckigen Krankheit-Forschung unter Verwendung krankheitsspezifische iPS-Zellen (AMED) unterstützt.
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |