Summary
Мы представляем здесь протокол для дифференциации человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в каждом Сомит производная (Миотом, Склеротом, дерматом и syndetome) в химически определенных условий, который имеет применения в будущих болезней моделирования и на основе клеток терапии в ортопедической хирургии.
Abstract
В ответ на сигналы, такие как WNTs костных морфогенетических белков (БМП) и Еж Соник (ТСС) выделяется из окружающих тканей, сегменты (SMs) порождают несколько типов клеток, в том числе Миотом (Миопатии), Склеротом (SCL), дерматом (D) и syndetome (SYN) , который, в свою очередь, развиться в скелетных мышц, Осевой скелет, спинной дермы и осевой сухожилия/связки, соответственно. Таким образом поколение SMs и их производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеет решающее значение для получения плюрипотентных стволовых клеток (Чок) для применения в регенеративной медицине и для исследований болезней в области ортопедической хирургии. Хотя протоколов индукции Миопатии и нежелательной почты от Чок ранее сообщали несколько исследователей, не исследование еще не продемонстрировал индукции SYN и D от iPSCs. Таким образом эффективное всасывание полностью компетентным SMs остается серьезной проблемой. Здесь мы пилки человека патронирования SM с человеческой iPSCs в пробирке путем передразнивать сигнальную среду во время разработки SM куриных/мыши и доклад о методах систематического индукции SM производных (Миопатии, SCL, D и SYN) от человека iPSCs под химически определенных условиях через presomitic мезодермы (PSM) и SM государств. Знания о куриных/мыши SM развития был успешно применен к индукции SMs с человеческой iPSCs. Этот метод может быть Роман инструментом для изучения человеческого somitogenesis и кучность без использования эмбрионов и для терапии на основе ячеек и моделирование болезней.
Introduction
Разработка метода направленного дифференцирования для нужной ячейки типа от Чок является необходимым шагом для перевода исследование PSC-производные клеток на клинических приложений. Принудительного выражение ключевых генов является перспективной стратегией для органа клеточная дифференцировка от ЦОНов и улучшилось понимание генетического регулирования определение судьбы клетки, органа морфогенеза и Организации во время эмбриогенеза1. Кроме того изложив эндогенного сигнальных средах, используя развитие зародышей мыши и куриных как дорожную карту, считается необходимым для направленного дифференцирования Чок. Однако учитывая применение СМБ производные клеток в клинических исследованиях, например на основе ячеек терапии, последняя стратегия больше подходит потому, что она не требует генные манипуляции.
Несколько исследований сообщили индукции мезодермы от человека и мыши ЦОНов в химически определенных условий. Как правило эти методы полагаются на activin/узловой/преобразование сигнализации фактор роста β (TGFβ) и костный морфогенетический белок (BMP) сигнализации, предполагается выполнить мезо энтодермы и мезодермы дифференциации, что приводит к низкой индукции эффективности параксиальная мезодерма (около 20%)2. Иными словами PSC-производные мезодермы, вызванных этими сигнальные пути был главным образом боковой пластине мезодермы, а не параксиальная мезодерма. Недавно несколько исследований продемонстрировали эффективное производство PSC-производные параксиальная мезодерма, основанных на различных стратегий3,4,5,6,7,8 . В этих исследованиях были культивированный ЦОНов с относительно высокой концентрации гликогена синтазы киназа 3 (GSK3) ингибиторы (WNT сигнализации активаторы), поэтому эффективность индукции параксиальная мезодерма достиг 70%-95%6,7 .
В somitogenesis параксиальная мезодерма сначала образует presomitic мезодермы (PSM) кзади, а затем сегменты (SMs) в передней части через мезенхимы эпителиальных перехода9,10. Вырезка лигандом Дельта как 1 (DLL1) как известно ключевую роль во время somitogenesis, как колебательная управления DLL1 выражения, оба уровня мРНК и белка, регулирует SM сегментации. СМС в конечном итоге вентрально подразделяют на две части, что привело к dermomyotome (DM) дорсально и Склеротом (SCL)11. Впоследствии DM отличает в дерматом (D), предшественник дермы, и Миотом (Миопатии), предшественник скелетных мышц; Кроме того брюшной части SCL образует syndetome (SYN), предшественник сухожилий и связок в12 (рис. 1). Некоторые исследователи сообщили индукции PSC-производные SM производных такие Миопатии4,13 и14нежелательной почты; Однако существует несколько ограничений в этих исследованиях. Примечательно так как наши знания о сигнальных средах D и SYN фрагментарны, протоколов индукции D и SYN не еще были созданы систематически. Чтобы продемонстрировать полный компетенция SMs индуцированной из УИК, важно показать мульти дифференциация емкость индуцированных SMs во всех четырех производные (D, Миопатии, SCL и SYN), в то время как предыдущие исследования были сосредоточены только на конкретные производные SM. Здесь мы сообщаем о том, как генерировать все четыре SM производные, включая D и SYN, через PSM и SM судьбы человека iPSCs15. Мы считаем, что создание в пробирке поэтапный метод этой модели SM процесс развития может способствовать изучение как человеческие SM развивается во время эмбриогенеза, без использования эмбрионов.
Protocol
Все экспериментальные протоколы с участием человека iPSCs были утверждены Комитетом по этике Департамента медицины и высшая школа медицины, Университет Киото.
1. человека iPSCs подготовка перед индукции
Примечание: Культура человека iPSCs (201B7-PAX3-GFP) на SNL фидер клетки16 с Предстоятелем ES клеток средних дополнена 4 нг/мл рекомбинантного человеческого основные фибробластический фактор роста (FGF2) и 0,5% пенициллина и стрептомицина (именуемым далее как Госкомсанэпиднадзором среды, см. Таблица 1). Когда коэффициент слияния достигает 70%-80%, проход клетки как описано17.
-
Пассированый из человека iPSCs на SNL фидер клетки17
- Для пассированый, добавить PBS в блюдо культивирования клеток и промойте клетки. Затем удалите PBS (далее, этот процесс будет называться мыть с PBS).
- Добавить 1 мл раствора CTK (см. таблицу 1) при комнатной температуре (RT) и подождите, пока клетки фидера SNL начать отсоединение от нижней части блюдо.
- Удаление решения CTK и затем смывают дважды с PBS.
- Добавьте 1 mL Госкомсанэпиднадзором среды (см. таблицу 1) в блюдо, затем очистите клетки с помощью скребка и собирать в коническую пробирку 15 мл.
- Аккуратно Пипетка содержимого пять раз с помощью кончика 1000 мкл и затем передать новое блюдо, заполнены с Госкомсанэпиднадзором среднего. Использование Сплит соотношение 1:4 до 1:10, в зависимости от соотношения слияния перед пассированый. Кроме того изменять объем Госкомсанэпиднадзором среды в зависимости от масштаба блюдо (например, 3 мл на 6 см блюдо, 8 мл на 10 см блюдо).
- Инкубируйте человека iPSCs при 37 ° C и 5% CO2.
- Изменение средних ежедневно (за исключением на следующий день после пассированый) и культура клетки до следующей процедуре passaging.
-
Фидер бесплатно культивирование человека iPSCs до PSM индукции
Примечание: свести к минимуму влияние факторов роста, выделяется из клеток фидер SNL, культура человека iPSCs условиях свободной подачи с питательной среды фидер свободных клеток (см. таблицу 1) на решения внеклеточного матрикса (ECM) (см. таблицу 1) покрытые блюдо за 3 дня до PSM индукции.- День -4 (4 дня до начала индукции PSM)
- Чтобы приготовить блюдо с покрытием решения ECM, добавьте 4 мл раствора ECM на 10 см блюдо на 4 ° C на ночь.
Примечание: Место решение ECM на льду во время подготовки.
- Чтобы приготовить блюдо с покрытием решения ECM, добавьте 4 мл раствора ECM на 10 см блюдо на 4 ° C на ночь.
- День -3
- Во-первых удалите решение ECM от блюдо и добавьте 8 мл фидер свободных клеток питательной среды.
- Чтобы начать фидер бесплатно культивирования, мыть раз с PBS для полоскания культивируемых клеток.
- Добавьте 1 мл раствора CTK на RT, пока клетки фидера SNL начать отсоединение от нижней части блюдо.
Примечание: Использование микроскопии для подтверждения всех клетки фидера отсоединяются от дна. - Удаление решения CTK и мыть с PBS дважды, таким образом, чтобы полностью удаляются все клетки фидера SNL.
- Добавьте 1 mL фидер свободных клеток питательной среды в блюдо, а затем скрести клетки с помощью скребка и собирать их в коническую пробирку 15 мл.
- Осторожно Пипетка содержимое, три раза с помощью кончика 1000 мкл, а затем передать новое блюдо 10 см, покрытые решения ECM (подготовлен во время шага 1.2.1). Использование Сплит соотношении примерно 1:2 до 1:4, в зависимости от слияния соотношение до свободной подачи культивирования.
- Инкубируйте человека iPSCs при 37 ° C и 5% CO2 на 3 дня, изменив носитель на день -1.
- День -4 (4 дня до начала индукции PSM)
2. PSM дифференциации и изоляции путем активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS)
-
PSM дифференциации (день 0 – день 4)
- Аспирационная фидер свободных клеток питательной среды и добавить 8 мл PSM индукции среды (базальный среднего МЧР с 10 мкм SB431542, 10 мкм CHIR99021, 2 мкм DMH1 и 20 нг/мл FGF2, см. таблицу 1).
Примечание: Слияние клеток в начале PSM дифференциация имеет решающее значение для эффективности индукции. Использование микроскопии для подтверждения вырожденная соотношение составляет примерно 30%. - Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO2, 4 дней, изменения среды на 3 день.
- Урожай клетки для СУИМ в день 4 (раздел 2.2, ниже).
- Аспирационная фидер свободных клеток питательной среды и добавить 8 мл PSM индукции среды (базальный среднего МЧР с 10 мкм SB431542, 10 мкм CHIR99021, 2 мкм DMH1 и 20 нг/мл FGF2, см. таблицу 1).
-
Изоляция DLL1 позитивные PSM клеток путем активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS)
Примечание: ниже приводится процедура подготовки клетки до СУИМ сортировки DLL1 позитивных клеток. Выполняют СУИМ сортировки с помощью проточный цитометр, по словам производителя протокол.- Аспирационная носитель, а затем вымыть с PBS. Впоследствии добавьте 1 mL реагента диссоциации клеток и оставить на 3 мин на RT.
- Добавить 4 мл МЧР базальной среды, очистите клетки с помощью скребка и собирать их в коническую пробирку 15 мл.
- Подсчитать количество ячеек с помощью счетчика автоматизированные ячейки, а затем центрифуги на 280 x g на 3 мин.
- Тщательно удалить супернатант стремлением и Ресуспензируйте ячейки в буфер СУИМ (см. таблицу 1) в концентрации 1,0 x 10-7 кл/мл. Для образца отрицательный контроль (изотипа управления, или в Конвенции без антитела), передача 50 мкл в 15 мл Конические трубки, а затем приостановить с 450 мкл буфера СУИМ.
- Добавить DLL1 антитела (см. Таблицу материалы) в соотношении 1/200. Защитить трубы от света и держать на льду за 30 мин.
- Центрифуга на 280 x g на 3 мин.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте СУИМ буфера (1,0 x 10-7 кл/мл) с 1 мг/мл DAPI.
- Передача в коллекции трубку, объединена с 35 мкм нейлоновая сетка в крышке для фильтрации, затем поместите трубку на льду до завершения сортировки. Выполните ту же процедуру с отрицательного контроля образца (шаг 2.2.4).
- Выполните сортировку с помощью проточный цитометр согласно протоколу производителя.
- Соберите отсортированный DLL1 позитивных клеток в 15 мл Конические трубки, содержащий 4 мл МЧР базальной среды с 10 мкм Y27632. Для всего РНК добыча центрифуги на 280 x g 3 мин затем Ресуспензируйте РНК литического буфера и хранить при температуре от-30 ° C. Смотрите извлечение RNA, обратной транскрипции и RT-ПЦР процедур (статья 5.1) для более подробной информации.
- Выполнять SM дифференциации, с использованием сортировки клеток согласно ниже протокол (раздел 3).
3. SM дифференциации от PSM
-
SM дифференциации от отсортированных DLL1 PSM клеток (4-день 8-й день)
Примечание: подготовить пластины с покрытием решения 12-ну ECM за день до сортировки СУИМ. Подготовить ECM с покрытием решения 12-ну плиты, добавить 1 мл раствора ECM в каждой скважине на 4 ° C и оставить на ночь. Держите решение ECM на льду во время подготовки.- Следующий шаг 2.2.10, центрифуги на 280 x g на 3 мин.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл среды индукции SM (базальный среднего МЧР с 10 мкм SB431542 и 5 мкм CHIR99021, см. таблицу 1).
- Подсчитать количество ячеек с использованием автоматизированных ячейки счетчика.
- Семя 1.0 x 105 клеток на каждой скважине ECM плит по 12-ну решение покрытием, содержащие 1 мл SM индукции среды с 10 мкм Y27632.
- Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2 за 4 дня до 8 день. Изменения среды, не содержащие Y27632 на 5 день (день после сортировки FACS) и 7 дней.
- Выполняйте SM производные дифференциации с использованием искусственных клеток SM согласно протоколам ниже. Для всего извлечение RNA от индуцированного SM клеток собирать клетки в 15 мл конические и центрифуги на 280 x g на 3 мин, затем Ресуспензируйте РНК литического буфера и хранить при температуре от-30 ° C.
4. SM производные (DM, Миопатии, D, SCL, SYN) дифференциации от SM
Примечание: Чтобы продемонстрировать полный компетенция SM ячеек, сначала выполните DM (dermomyotome) и индукции SCL (Склеротом), соответственно с использованием iPSC производные SM клеток. Впоследствии выполняют Миопатии (Миотом) и D (дерматом) индукции, используя DM клетки и проводить индукции SYN (syndetome), с использованием клеток SCL. Ниже приведены протоколы для индукции каждого производного (DM, Миопатии, D, SCL и SYN) от индуцированного SM клеток в пробирке.
-
Дифференциация DM от SM клеток (8-день 11 день)
- Аспирационная носитель, а затем добавить 1 мл ДМ индукции среды (базальный среднего МЧР дополнена 5 мкм CHIR99021 и 10 нг/мл BMP4, см. таблицу 1).
- Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO2, за 3 дня до 11 день. Измените среду на 10 день (день 2 DM индукции).
- Выполните Миопатии и D дифференциация с помощью искусственного DM клетки согласно протоколам ниже.
-
MYO дифференциации от DM клеток (день 11 – день 41)
- Аспирационная носитель, а затем добавить 1 мл среды индукции Миопатии (базальный среднего МЧР дополнена 5 мкм CHIR99021, см. таблицу 1).
- Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO2, за 30 дней до 41 день. Измените носитель каждые 3 дня.
-
D дифференциация от DM клеток (11 – день 20-й день)
- Аспирационная носитель, а затем добавить 1 мл среды индукции D (базальный среднего МЧР дополнена 5 мкм CHIR99021 и 10 нг/мл BMP4, см. таблицу 1).
- Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO2, за 9 дней до 20 дней. Измените носитель каждые 3 дня.
-
SCL дифференциации от SM клеток (8-день 11 день)
- Аспирационная носитель, а затем добавьте 1 mL Вероятности индукции среды (МЧР базальной среднего дополняется 100 Нм SAG и 0,6 мкм LDN193189, см. таблицу 1)14.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO2, на 3 дня. Измените среду на 10 день (день 2 Вероятности индукции).
- Выполняйте SYN дифференциации, с использованием искусственных клеток SCL согласно протоколу ниже.
-
SYN дифференциации от SCL клеток (32 11 – день в день)
Примечание: подготовить за день до начала индукции SYN пластины с покрытием решения 24-ну ECM. Подготовить ECM с покрытием решение 24-ну плиты, добавить 0,5 мл раствора ECM в каждой скважине на 4 ° C и оставить на ночь. Держите решение ECM на льду во время подготовки.- Аспирационная среды затем вымыть с PBS, затем добавить 0,2 мл реагента диссоциации клеток в каждой скважине и оставить на 3 мин на RT.
- Добавьте 0,8 мл МЧР базальной среднего для каждой скважины, то скрип и собрать все клетки в коническую пробирку 15 мл.
- Центрифуга на 280 x g на 3 мин.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл SYN индукции средне-1 (базальный среднего МЧР дополнены 20 нг/мл FGF8, см. таблицу 1), затем подсчитать количество ячеек с использованием автоматизированных ячейки счетчика.
- Семя 5.0 x 104 клеток в каждой скважине ECM с покрытием решение 24-ну пластин содержащие 1 мл SYN индукции средне-1.
- Инкубируйте при 37 ° C, с 5% CO2, на 3 дня.
- На 14 день (день 3 SYN индукции), заменить средний SYN индукции средне-2 (базальный среднего МЧР дополнена 10 нг/мл BMP7 и 10 нг/мл TGFβ3, см. таблицу 1).
- Инкубируйте при 37 ° C, с 5% CO2, 18 дней до 32 дней. Измените носитель каждые 3 дня.
5. характеристика iPSC производные продукты
Примечание: После дифференциации характеризуют человека iPSCs производных с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР), immunocytochemistry (ICC), энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) и механического растяжения стимуляции анализов, соответственно.
-
Ячейка урожай, общее извлечение RNA, обратной транскрипции и количественный анализ ПЦР (RT-ПЦР) в реальном времени
- Собирать образцы клетки (процедуры 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) в 1,5 мл трубку, а затем центрифуги на 280 x g на 3 мин.
- Удалить супернатант затем Ресуспензируйте в 350 мкл буфера lysis РНК, предоставляемый соответствующей общей РНК добыча комплект.
- Экстракт всего РНК с помощью комплекта согласно протоколу производителя.
- Реверс транскрибировать изолированных 1 мкг всего РНК в cDNA, по словам производителя протокол.
- Выполните с помощью подходящих ферментов, реагентов и грунты по данным производителя протокол RT-ПЦР. Последовательностей праймера, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 2.
-
Immunocytochemistry (ICC)
- Перед выполнением immunocytochemistry с антителами, исправить клетки с 2% параформальдегида на 4 ° C на 10 мин и мыть дважды с PBS.
- Для permeabilization инкубации с 0,2% метанола или 0,2% Полисорбат 20/PBS (именуемой в дальнейшем PBS-T) на 4 ° C на 15 мин.
- Удалите permeabilization реагенты и лечить клетки с соответствующей блокировки буфера или 1% бычьего сывороточного альбумина/PBS на 4 ° C для 60 мин.
- Добавьте первым антителом, разбавленным с 10% блокирующий буфер в PBS-T и место на покачивая машину на 4 ° C на ночь.
- Вымойте три раза с PBS-T (добавить PBS-T и место на покачивая машину на RT для 10 мин).
- Добавьте второй антитела, разбавленным с 10% блокирующий буфер в PBS-T и место на покачивая машину на RT 60 мин. Первый и второй антитела для МУС, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 3.
Примечание: От этого шага защите плиты/блюдо от света, завернув его в фольгу. - Мыть дважды с PBS-T.
- Для счетчика пятнать, добавьте 1/5000 DAPI разбавляют PBS и место на покачивая машину на RT на 5 мин.
- Удаление решения DAPI и добавить PBS в каждой скважине.
- Наблюдать, окрашивание клеток под микроскопом флуоресценции. Кроме того Храните пластины/блюдо на 4 ° C до 1 месяца.
-
Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для функционального анализа iPSC производные D
Примечание: клетки человека фибробластов дермы (ХДФ) являются коммерчески доступными. Культура ХДФ в DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10% (см. таблицу 1).- Семя 1.0 x 105 клеток iPSC производные D и HDF на 24-ну пластин, содержащие 1 мл каждого питательной среды (D: D индукции средний, ХДФ: DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10%).
- После 3 дней культивирования клеток, собирать 100 мкл каждого носителя, место в 1,5 мл трубку и хранить при 4 ° C.
- Выполните серию процедур, таких как добавление обнаружения антител и вторичные антитела, согласно инструкции производителя и подсчитать количество целей путем создания стандартной кривой против концентрации элемента управления исследуемое вещество образцов.
-
Assay механического растяжения стимуляции для функционального анализа iPSC производные SYN
Примечание: взрослого человека tenocytes являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы). Культура человека iPSC производные SYN и взрослого человека tenocytes на ячейку растяжения устройство для assay механического растяжения стимуляции, как описано ниже18,19. Использование SYN индукции средне-2 и tenocytes среднего роста (см. Таблицу материалы) как средство культивирования для каждого производного iPSC SYN и взрослого человека tenocytes, соответственно.- В 24 ч до растяжения, плита 1.0 x 105 клетки iPSC производные SYN и человека tenocytes на ECM с покрытием решения multi хорошо тип силиконовой резины камеры, каждый с поверхностью культуры 1,5 х 1,5 см (см. Таблицу материалы).
- Установка камеры на устройстве для клеток растяжения и силу одноосных циклических штамм (0,5 Гц, 5%) 12 ч.
- Для всего РНК добыча 350 мкл буфера lysis РНК, а затем очистите и собирать клетки в 1,5 мл трубку для всего РНК добыча и последующего RT-ПЦР анализа (см. процедуру 5.1).
Representative Results
С iPSCs 201B7-PAX3-GFP, в котором EGFP заменяет один аллель PAX3 кодирующая последовательность в экзона 1 были получены все данные в настоящем докладе. Создание 201B7-PAX3-GFP iPSCs будет описано в других разделах (H. Sakurai, личное сообщение). Статистическая значимость была оценена с помощью статистического программного обеспечения. P-значения ниже, чем 0,05 были значительными.
Характеристика iPSC производные PSM и SM клеток человека
Для оценки дифференциации человека iPSCs к SM через состояние PSM (рисунок 2A), анализ СУИМ, МТП и RT-ПЦР анализ были исполнены. Как показано на рисунке 2B, свыше 85% клеток были положительными для DLL1, маркер ПМБ, но негативные для PAX3, маркер см, после 4 дней PSM индукции с человеческой iPSCs. Впоследствии эта группа населения стал PAX3 SM клеток после 4 дней SM индукции. PSM-SM переход был также подтвержден ICC (рис. 2 c) и RT-ПЦР (Рисунок 2D). TBX6, MSGN1 и WNT3A, PSM маркеров были выражена в состояние PSM (4 день), но не выражены в состояние SM (8 день). PARAXIS, MEOX1 и PAX3, SM маркеры, выражена в SM, но не выражены в ПМБ. Кроме того, только окрашивание CDH11, маркером грануломах SM, накопленных на стыке ячейке, после добавления SB431542 с CHIR99021 (рис. 2е).
Характеристика SM производных, индуцированной из клеток человека iPSC производные SM
Для оценки дифференциации потенции человека iPSC производные SM, дифференциация к DM, Миопатии, D, SCL и SYN (рис. 3A) был оценен анализ в ICC и PAX3 (ГПУП)-флуоресценции. Как показано на рисунке 3B, дифференциация DM было подтверждено ALX4 и EN1 окрашивание и PAX3 (ГПУП)-флуоресценции; MYO дифференциация была подтверждена мёд, MYOG и миозина тяжелой цепи (MHC) пятная; D дифференциация была подтверждена EN1 и PDGFRa пятнать; SCL дифференциация была подтверждена PAX1, PAX9 и NKX3.2 окрашивание; и дифференциация SYN был подтвержден SCX, MKX, COL1A1 и COL1A2 окрашивание.
Характеристика D и SYN
1. энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для функционального анализа iPSC производные D
В человеческом теле одной из основных функций фибробластов дермы является выделяют белков внеклеточного матрикса (ECM), таких как коллаген и гиалуроновая кислота, которые увлажняют кожу и помочь сохранить структуру кожи. Чтобы продемонстрировать, что сопоставимые количество белков коллагена типа 1 и гиалуроновой кислоты были выделяется в среде культуры iPSC производные D и ХДФ, Элиза была выполнена, как показано на рисунке 4A.
2. механические растянуть assay стимуляции для функционального анализа iPSC производные SYN
Как уже сообщалось в ряде исследований, механической стимуляции влияет на развитие сухожилие до и после рождения и способствует дифференциации tenocytes из прекурсоров клетки18,19. Таким образом это хорошо известно, что реактивность к механическим воздействиям является одной из характеристик tenocytes. Чтобы продемонстрировать сопоставимые реактивности человека iPSC производные SYN и человека взрослых tenocytes, механического растяжения стимуляции пробирного была выполнена как показано на рисунке 4В.
Рисунок 1: Схема иерархической дифференциации параксиальная мезодерма. Presomitic Мезодерма это популяции клеток, что временно выходит в начале эмбриогенеза и подвергается сегментации в форме сегменты. Сегменты являются переходные стволовых клеток населения, что приводит к несколько типов клеток, таких как Склеротом, dermomyotome, syndetome, дерматом и Миотом клетки, которые в конечном итоге дифференцироваться в сухожилие/связки, кости/хряща, скелетных мышц и дермы клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: анализ СУИМ, RT-ПЦР и ICC человека iPSC производные PSM и сантиметр (A) схема протокола для SM дифференциации через PSM. (B) представитель точка участок DLL1 окрашивание и PAX3 (ГПУП)-день 4 PSM индукции и день 4 (8 день от iPSC) SM индукции флуоресценции. (C) представитель иммуноцитохимическое изображения и PAX3 (ГПУП)-день 4 PSM индукции и день 4 (8 день от iPSC) SM индукции флуоресценции. Клетки окрашивали с анти TBX6, PARAXIS и MEOX1 антител (красный) и совместно окрашивали DAPI (синий) или обнаружены с PAX3 (ГПУП)-флуоресценции (зеленый). (D) анализ RT-ПЦР маркеров для PSM и SM в iPSC, PSM и SM. Показаны средства ± стандартная ошибка (ФБ) из трех наборов экспериментов. (E) представитель иммуноцитохимическое изображений на день 4 (8 день от iPSC) см, культивируемых в S10I10 (сочетание SB431542 и IWR1, ингибитор WNT сигнализации), S10 (SB431542) и S10C5 условия (сочетание SB431542 и CHIR99021). Клетки были окрашенных с анти CDH11 антитела (красный) и совместно окрашивали DAPI (синий). iPS, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток; PSM, presomitic мезодермы; SM, Сомит; S10, SB431542 10 МКМ; C5, CHIR99021 5 МКМ; I10, IWR1 10 МКМ; Масштаб баров = 50 мкм. Эта цифра была изменена Накадзима et al. (2018)15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ICC анализ DM, Миопатии, D, SCL и SYN продифференцировано от человека сантиметр iPSC производные (A) схема протоколов для SM производные дифференциации. (B) представитель иммуноцитохимическое изображения и PAX3 (ГПУП)-флуоресценции на день 3 (11 день от iPSC) DM индукции, день 30 (день 41 от iPSC) MYO индукции, день 9 (20-й день от iPSC) D индукции, день 3 (11 день от iPSC) Вероятности индукции и день 21 (день 32 от iPSC) SYN индукции. ДМ, клетки были окрашенных с анти ALX4 и EN1 антител (красный) и совместно окрашивали DAPI (синий) или обнаружены с PAX3 (ГПУП)-флуоресценции (зеленый); Миопатии, клетки окрашивали анти мёд, MYOG (красный) и антитела MHC (голубой), также совместно витражи с DAPI (синий); D, клетки были окрашенных с анти EN1 (красный) и PDGFRa (голубой) антител и совместно окрашивали DAPI (синий); SCL, клетки были окрашенных с анти PAX1, PAX9 и NKX3.2 (красный) антител и совместно окрашивали DAPI (синий); SYN, клетки были окрашенных с анти SCX, MKX, COL1A1 и COL1A2 (красный) антител и совместно окрашивали DAPI (синий). DM, dermomyotome; Миопатии, Миотом; D, дерматом; SCL, Склеротом; SYN, syndetome; Масштаб баров = 50 мкм. Эта цифра была изменена Накадзима et al. (2018)15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: функциональная проба индуцированных D и SYN. (A) количество коллагена типа 1 и гиалуроновой кислоты, что белки в среде культуры были проанализированы ELISA. (B) эффект механическое растяжение стимуляции на индуцированный SYN и человека взрослых tenocytes оценивали по RT-ПЦР. Показаны средства ± стандартная ошибка (ФБ) из трех наборов экспериментов. * p < 0,05; ** p < 0.01; p < 0,001 Дуннетт несколько сравнений t-тест по сравнению с растянуть (-); н.с, не значительные, ХДФ, человека взрослых дермального фибробластов. Эта цифра была изменена Накадзима et al. (2018)15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Решение средних | Reagant | Концентрация |
| МЧР базальной средний | Iscove на изменение Дульбекко среднего/ветчина F12 | 1:1 |
| Пенициллин/стрептомицина | 0,5% | |
| Химически определены концентрат липидов | 1% | |
| АПО трансферрина | 15 мг/мл | |
| Monothioglycerol | 450 мм | |
| Альбумина bovine сыворотки | 5 мг/мл | |
| Инсулин | 7 мг/мл | |
| CTK решение | Воды | - |
| Трипсин | 0,25% | |
| Коллагеназы IV | 0,1 мг/мл | |
| Хлорид кальция | 1 мм | |
| Нокаут SR | 20% | |
| D средний индукции | МЧР базальной средний | - |
| CHIR99021 | 5 МКМ | |
| BMP4 | 10 нг/мл | |
| DM индукции среднего | МЧР базальной средний | - |
| CHIR99021 | 5 МКМ | |
| BMP4 | 10 нг/мл | |
| Решение ECM | Искусственные внеклеточная матрица | 0.3 мг/мл |
| DMEM/F12 | - | |
| СУИМ буфер | PBS | - |
| Альбумина bovine сыворотки | 0,1% | |
| Фидер свободных клеток культуры среднего | mTeSR1 | - |
| Пенициллин/стрептомицина | 0,5% | |
| Волокнистые культуры среднего | DMEM | - |
| Плода бычьим сывороточным | 10% | |
| Госкомсанэпиднадзором среднего | Предводитель ES клеток среднего | - |
| Пенициллин/стрептомицина | 0,5% | |
| FGF2 | 4 нг/мл | |
| MYO индукции среднего | МЧР базальной средний | - |
| CHIR99021 | 5 МКМ | |
| PSM индукции среднего | МЧР базальной средний | - |
| SB431542 | 10 МКМ | |
| CHIR99021 | 10 МКМ | |
| DMH1 | 2 МКМ | |
| FGF2 | 20 нг/мл | |
| SCL индукции среднего | МЧР базальной средний | - |
| SAG | 100 Нм | |
| LDN193189 | 0,6 МКМ | |
| SM индукции среднего | МЧР базальной средний | - |
| SB431542 | 10 МКМ | |
| CHIR99021 | 5 МКМ | |
| SYN индукции средне-1 | МЧР базальной средний | - |
| FGF8 | 20 нг/мл | |
| SYN индукции средне-2 | МЧР базальной средний | - |
| BMP7 | 10 нг/мл | |
| TGFΒ3 | 10 нг/мл |
Таблица 1: Средства массовой информации и решения рецепты.
| ИМЯ | Вперед | Реверс |
| ACTB | CACCATTGGCAATGAGCGGTTC | AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT |
| COL1A1 | GGACACAGAGGTTTCAGTGGT | GCACCATCATTTCCACGAGC |
| MEOX1 | GAGATTGCGGTAAACCTGGA | GAACTTGGAGAGGCTGTGGA |
| MSGN1 | GGAGAAGCTCAGGATGAGGA | GTCTGTGAGTTCCCCGATGT |
| PARAXIS | TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT | CACACCCTGTCACCAACAGT |
| PAX3 | AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG | CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG |
| SCX | CCCAAACAGATCTGCACCTTC | GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC |
| TBX6 | AGCCTGTGTCTTTCCATCGT | AGGCTGTCACGGAGATGAAT |
| TNMD | CCCTTCATGCTGAAGCCACTT | CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG |
| WNT3A | CAAGATTGGCATCCAGGAGT | ATGAGCGTGTCACTGCAAAG |
Таблица 2: Грунтовка последовательности для RT-ПЦР анализа.
| Концентрация | ||
| 1-й Антитела |
ALX4_Goat | 1/50 |
| CDH11_Mouse | 1/1000 | |
| COL1A1_Rabbit | 1/100 | |
| COL2A1_Mouse | 1-2 мкг/мл | |
| EN1_Rabbit | 1/50 | |
| MEOX1_Rabbit | 1/50 | |
| MHC_Rabbit | 1/200 | |
| MKX_Rabbit | 1/50 | |
| MYOD_Rabbit | 1/500 | |
| MYOG_Mouse | 1/400 | |
| NKX3.2_Rabbit | 1/50 | |
| PARAXIS_Rabbit | 1/50 | |
| PAX1_Rabbit | 1/50 | |
| PAX9_Rabbit | 1/50 | |
| PDGFRa_Goat | 1/100 | |
| SCX_Rabbit | 1/50 | |
| TBX6_Goat | 1/50 | |
| 2 Антитела |
Осел анти козье IgG(H+L) среднего antibody555 | 1/500 |
| Осел анти козье IgG(H+L) среднего antibody647 | 1/500 | |
| Коза анти мыши IgG(H+L) среднего antibody555 | 1/500 | |
| Коза анти кролик IgG(H+L) среднего antibody555 | 1/500 | |
| Коза анти кролик IgG(H+L) среднего antibody647 | 1/500 |
Таблица 3: Первый и второй антитела для МУС.
Discussion
Хорошо известный метод для индукции PSC-производные SM через ПСМ является сочетание CHIR99021 + A83-01 (ингибитор TGFβ) во время индукции PSM от PSC, но не во время процесса созревания PSM6. В настоящем исследовании WNT/бета катенина сигнализации была тормозится используя C59 побудить см от PSM. Однако мы ввели использование CHIR99021 для того чтобы активировать путь WNT во время SM дифференциации. Данное решение принято на основании вывод, что несколько WNTs выражена в окружающих тканях SM и учитывая тот факт, что репортеры WNT активны в SM20. В результате мы наблюдали, что эпителизации, характеристика SM в естественных условиях, только при условии, с CHIR99021, основанный на накопление CDH11 в ячейке узлов (рис. 2е). Это наблюдение указывает критическое участие WNT сигнализации во время PSM дифференциации и эпителизации SM, поэтому, что наш протокол может лучше пилки эндогенного сигнальную среду. Однако это также предполагает дополнительную возможность тонкой настройки WNT/бета катенина сигнальный путь во время дифференциация, потому, что надежность и эффективность дифференциации могут значительно отличаться в зависимости от типов клеток, клеточных линий и различные химические соединения WNT-индукторов, используемые каждый исследователь.
Этот метод также позволяет нам создавать все четыре SM производные, Миопатии, D, SCL и SYN, от человеческого iPSCs. Наша пошаговая протоколы, используя МЧР может использоваться для идентификации сигналов требований во время человека somitogenesis/Сомит кучность и обеспечивают важное понимание человеческого развития см. Например наши методы могут быть полезны для изучения сегментации часовые механизмы, молекулярных колебаний системы, которая регулирует формирование SM. Он тщательно исследовано в мышей, цыплят и данио рерио, но не в людей из-за отсутствия соответствующих экспериментальных средств.
Кроме того наш метод могут быть применимы к будущим клинической терапии на основе ячеек. Например человека iPSC производные D или SYN могут быть пересажены в сильно поврежденную кожу или разрыв сухожилия для регенерации и лечения. Однако некоторые ограничения должны быть решены до того, как этот метод может применяться практически. Хотя в настоящем исследовании, мы использовали клетки фидера SNL для iPSC обслуживание и решение ECM, которая добывается из Engelbreth-холм-Рой мыши саркомы, как поверхностный слой на блюдо во время индукции, эти не человеческого животного производные реагенты должны быть удалено для улучшения качества. Кроме того необходимо также совершенствовать клеток количество и качество, которое включает чистоты и созревания клеток желаемого. Кроме того не только количества клеток, но и прочность клеток является важной характеристикой для регенерации сухожилия/связки. Кроме того развитие поверхностных маркеров для очищения и новый метод для 3D воссоздание необходимы для того, чтобы наши протоколы по клинической терапии на основе ячеек.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дзюнъя Toguchida (CiRA) за помощь с администрацией проекта и финансирования приобретения, г-Mitsuaki Шибата (CiRA) и г-жа Мэй Terashima (CiRA) для их технической помощи, д-р Yayoi Toyooka (CiRA) и доктор Дайсукэ Камия (Сира) для их редактирование рукопись и г-н Масая Todani (CiRA) для предоставления иллюстрации (рис. 1). Мы также благодарим всех членов Икея и Toguchida лабораторий (CiRA) за их поддержку в ходе этого исследования. Эта работа была поддержана дотаций для научных исследований от японского общества для поощрения от науки (JSP) (26670661), программа для сложных заболеваний исследования использования конкретных заболеваний ИПК клетки от Японии науки и технологии Агентства (JST) и Японского агентства для медицинских исследований и развития (AMED), основной центр iPS исследования клеток исследовательский центр сети для реализации регенеративной медицины (JST/AMED) и Фонд исследований клеток iPS (частично с Макото Икея и Дзюнъя Toguchida). Макото Икея было также поддержано дотаций для научных исследований (JSP) (16H 05447) и программы ускорения сложных заболеваний исследований, использования конкретных заболеваний ИПК клетки (AMED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
| Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
| CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
| Cell streching device | Strex | STB-140 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | |
| COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
| COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
| Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
| DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
| DMEM | Sigma | D6046 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
| DMH1 | Tocris | 4126 | |
| EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
| Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
| FGF2 | Wako | 060-04543 | |
| FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
| Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
| Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
| Insulin | Wako | 090-06474 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
| Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Axon | 1509 | |
| Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
| MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
| MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
| MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
| Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
| MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
| MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
| NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
| Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
| PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
| PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
| PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
| PBS | - | - | |
| PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
| SAG | Calbiochem | 566661 | |
| SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
| SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
| TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
| Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
| TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
| Trypsin | Gibco | 15090046 |
References
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), e61540 (2013).
- Sakurai, H., et al. In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), e47078 (2012).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocl. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
- Umeda, K., et al. Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 2, 455 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Xi, H., et al. In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Reports. 18 (6), 1573-1585 (2017).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Tam, P. P., Beddington, R. S. The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development. 99 (1), 109-126 (1987).
- Aulehla, A., Pourquie, O. Signaling gradients during paraxial mesoderm development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a000869 (2010).
- Christ, B., Scaal, M. Formation and differentiation of avian somite derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 638, 1-41 (2008).
- Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
- Sakurai, H., et al. Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium. Stem Cell Research. 3 (2-3), 157-169 (2009).
- Zhao, J., et al. Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells. Development. 141 (20), 3848-3858 (2014).
- Nakajima, T., et al. Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells. Development. 145 (16), (2018).
- McMahon, A. P., Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell. 62 (6), 1073-1085 (1990).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Suzuki, H., et al. targeting of the transcription factor Mohawk in rats causes heterotopic ossification of Achilles tendon via failed tenogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7840-7845 (2016).
- Marturano, J. E., Arena, J. D., Schiller, Z. A., Georgakoudi, I., Kuo, C. K. Characterization of mechanical and biochemical properties of developing embryonic tendon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6370-6375 (2013).
- Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).
