Summary
プロトコルを提案ここで各体節の誘導体 (筋節、椎板、皮膚分節、syndetome) にひと誘導多能性幹細胞の分化の化学的に定義された条件で将来の疾患モデリングのアプリケーションを持つと整形外科で細胞ベースの治療。
Abstract
WNTs などの信号を受けて、骨形成タンパク質 (Bmp) とソニック ・ ヘッジホッグ (SHH) 周囲の組織から分泌され、筋節 (墓)、心 (SCL)、皮膚分節 (D)、syndetome (SYN) を含む種類の細胞を生じさせる体節 (SMs)、順番に軸腱/靭帯、背側の真皮、軸骨格筋それぞれに成長します。したがって、SMs およびその誘導体ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) の生成は、多能性幹細胞 (Psc) 整形外科分野の疾患研究、再生医療用を取得する重要です。墓と Psc から SCL の誘導のプロトコルは、以前いくつかの研究で報告されている、研究はまだ証明されてない SYN と D の誘導 Ips から。したがって、完全に有能な SMs の効率的な誘導は大きな課題です。ここでは、我々 はひよこ/マウス SM 開発および SM 誘導体 (墓、SCL、D、および SYN) の下でヒトの Ips からの体系的な誘導の方法のレポート中に化学信号の環境を模倣して人間 Ips の in vitro での人間の SM パターン形成を要約します。presomitic 中胚葉 (PSM) と SM 状態を介して定義された条件。ひよこ/マウス SM 開発に関する知識は人間の Ips と SMs の誘導に正常に適用されました。このメソッドは、人間形成を調査し、種子胚および細胞ベースの治療と疾患モデル作製のため使用せずパターニングのための新規ツール可能性があります。
Introduction
Psc からのセル型分化法の開発は、PSC 由来細胞の研究を臨床応用に翻訳のための必要なステップです。キー遺伝子の強制発現は Psc から器官細胞分化のための有望な戦略は、胚1中に組織、器官形成、細胞の運命決定の遺伝的制御の私達の理解を改善しました。また、ロードマップとしてマウスとひよこの胚の開発を使用する内因性の信号環境の概説は Psc の分化に不可欠なでと見なされます。細胞を用いた治療などの臨床試験で PSC 由来細胞への応用を考えると、後者の戦略より適切な遺伝子操作を必要としないので。
いくつかの研究は、人間からの中胚葉誘導を報告しているし、マウス Psc では化学的に条件を定義します。通常、これらのメソッドは、成長因子 β (TGFβ) シグナルのアクチビン/節/変換に依存しているし、骨形成タンパク質 (BMP) がシグナル伝達の低誘導効率の結果、メソ内胚葉と中胚葉の分化を行うと考えられています。近軸中胚葉 (約 20%)2。つまり、これらのシグナル伝達経路による PSC 派生中胚葉は主に側板中胚葉とない沿軸中胚葉。最近では、いくつかの研究が異なる戦略3,4,5,6,7,8 に基づく PSC 派生沿軸中胚葉の効率的な生産を示しています。.これらの研究で Psc グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3 (GSK3) の比較的高濃度培養した阻害剤 (WNT シグナルの活性剤)、したがって沿軸中胚葉の誘導効率に達した 70-956,7.
形成で沿軸中胚葉は最初後方、presomitic 中胚葉 (PSM) を形成し、充-上皮移行9,10を前部に体節 (SMs) を形成します。ノッチ リガンド デルタのような 1 (DLL1) は、DLL1 式 mRNA および蛋白質レベルの両方の振動制御を調節する SM セグメンテーション通称形成、時に極めて重要な役割を持っています。SMs を最終的に腹側に 2 つの部品、背側 dermomyotome (DM) に上昇を与えると椎板 (SCL) 分割11。その後、DM を皮膚分節 (D)、真皮と筋節 (墓); 骨格筋の前駆体の前駆体に区別します。また、SCL の腹側部分は、syndetome (SYN)、腱や靭帯12 (図 1) の前駆体を形成します。一部の研究者は墓4,13と SCL14; など SM の PSC 由来誘導体の誘導を報告しています。ただし、これらの研究のいくつかの制限があります。特に、D と SYN の信号環境の私達の知識は断片的なため、D と SYN 誘導プロトコルがまだ確立されていない体系的に。Psc から誘導された SMs の全能力を示すため、それは多分化を示す重要な先行研究は特定の SM 誘導体を当てているだけ、すべての 4 つの誘導体 (D、墓、SCL と SYN) に誘導される SMs の容量。ここでは、D と SYN、人間 Ips15から PSM と SM の運命など、4 つのすべての SM デリバティブを生成する方法について報告する.胚を使わず胚発生に伴う開発 SM 開発プロセスがどのように人間の SM の研究に貢献できるモデルを in vitro ステップワイズ法を確立することと考えています。
Protocol
人間の Ips を含むすべての実験のプロトコルは、医学部と大学院医学部、京都大学の倫理委員会によって承認されました。
1. ヒト Ips 作製前に誘導
注:SNL フィーダーの文化人間 Ips (201B7-PAX3-GFP) 細胞16 4 ng/mL 組換えひと塩基性繊維芽細胞成長因子 (FGF2) と 0.5% ペニシリン ストレプトマイシンと補われる霊長類 ES 細胞用培地 (いう hESC 媒体として参照してください。表 1)。合流比 70%-80% に達すると上記17としてセルを通路します。
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SNL フィーダー細胞17人間 Ips の継
- 通過、細胞培養皿に PBS を追加し、セルをすすいでください。その後、PBS を削除 (以下、このプロセスは PBS で洗浄剤としてとする)。
- CTK 溶液 1 mL を追加 (表 1参照) 常温 (RT)、SNL フィーダー細胞は、皿の底からデタッチが開始されるまで待ちます。
- CTK ソリューションを削除し、その後、PBS で 2 回洗います。
- HESC 培地 1 mL を追加し、皿に、スクレーパーを使用して細胞をこすり、15 mL の円錐管に収集 (表 1参照)。
- 軽く 5 回 1,000 μ L チップを使用してコンテンツをピペット、悪名高く媒体でいっぱい新しい料理に譲渡。分割比率 1:4、1:10、通過前に合流比に応じてするを使用します。また、皿 (6 cm 皿、8 mL の 10 cm の皿のための例えば、3 mL) の規模によって悪名高く培地量が変わる。
- 37 ° C、5% CO2で人間の Ips を孵化させなさい。
- (継翌日) を除く中毎日を変更し、次の passaging の手順まで、細胞の培養します。
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PSM 誘導前に人間 Ips のフィーダー フリー培養
注: 、SNL フィーダー細胞から分泌された成長因子の影響を最小限に抑える文化人間の Ips 細胞フィーダー フリー培養液とフィーダー無料条件の下で (表 1参照) (表 1参照) の細胞外マトリックス (ECM) ソリューションPSM 誘導前 3 日間被覆料理。- 日-4 (PSM 誘導を開始する前に 4 日間)
- ECM ソリューション コーティング料理を準備には、一晩 4 ° C で 10 cm 皿に ECM ソリューションの 4 つの mL を追加します。
注:氷の上を準備中の ECM ソリューションを配置します。
- ECM ソリューション コーティング料理を準備には、一晩 4 ° C で 10 cm 皿に ECM ソリューションの 4 つの mL を追加します。
- 日-3
- まず、お皿から ECM ソリューションを削除し、フィーダー フリー細胞培養液 8 mL を加えます。
- フィーダー フリー培養を開始するには、リンスの培養細胞を PBS で 1 回洗浄します。
- SNL フィーダー細胞は、皿の底からデタッチを開始するまで RT に CTK 溶液 1 mL を追加します。
注:顕微鏡を使用して、すべてのフィーダー細胞は下から切り離されますを確認します。 - CTK ソリューションを削除し、すべての SNL フィーダー細胞が完全に削除されますので、2 回、PBS で洗浄します。
- 料理に無料のフィーダー細胞培養液の 1 mL を追加し、スクレーパーを使用して細胞をこすり、15 mL の円錐管にまとめること。
- ゆっくり 3 回 1,000 μ L チップを使用してコンテンツをピペット、(準備段階 1.2.1) 新しい ECM ソリューション コーティング 10 cm 皿に転送。1:4、フィーダー フリー培養前に合流比に応じて約 1:2 の分割比を使用します。
- 3 日間、日-1 に媒体を変更する 37 ° C、5% CO2で人間の Ips を孵化させなさい。
- 日-4 (PSM 誘導を開始する前に 4 日間)
2. PSM 分化と蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えによる分離
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PSM 分化 (日 0-4 日目)
- フィーダー フリー培養液を吸引し、PSM 誘導培地の 8 mL を追加 (10 μ M を添加した CDM 基礎培地 SB431542、10 μ M CHIR99021、2 μ M DMH1、および 20 ng/mL FGF2、表 1を参照してください)。
注:PSM の分化の開始のセル合流地点誘導効率にとって重要です。顕微鏡を使用して、合流率は約 30% を確認します。 - 37 ° c、5% CO2セルを 4 日間、3 日目の媒体の変更にインキュベートします。
- FACS のため 4 日 (セクション 2.2, の下) に細胞を収穫します。
- フィーダー フリー培養液を吸引し、PSM 誘導培地の 8 mL を追加 (10 μ M を添加した CDM 基礎培地 SB431542、10 μ M CHIR99021、2 μ M DMH1、および 20 ng/mL FGF2、表 1を参照してください)。
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蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、DLL1 正 PSM 細胞の分離
注: DLL1 陽性細胞の FACS を並べ替える前にセル準備のプロシージャを以下です。製造元のプロトコルに従って FACS は流れの cytometer を使用して並べ替えを実行します。- 媒体を吸引し、PBS で洗浄します。その後、細胞解離試薬の 1 つの mL を追加し、右 3 分のまま
- CDM 基礎培地 4 mL を加えて、スクレーパーを使用して細胞をこすり 15 mL の円錐管にまとめること。
- 自動化された細胞カウンターを使用してセルの数をカウントし、3 分間 280 × gで遠心分離します。
- 慎重に吸引により上澄みを除去し、FACS バッファーに細胞を再懸濁します (表 1参照) 1.0 x 107セル/mL の濃度で。否定的な制御サンプル (アイソタイプ コントロールまたは抗体なしコンベンション)、15 mL の円錐管に 50 μ L を転送、FACS バッファーの 450 μ L で、停止します。
- DLL1 抗体を追加 (材料の表を参照) 1/200 の割合で。光からチューブを守るし、氷上で 30 分間保持します。
- 280 x gで 3 分間遠心します。
- 慎重に、上清を吸引、FACS バッファー (1.0 x 107セル/mL) 1 mg/ml の DAPI 補完で再懸濁します。
- チューブは氷の場所、並べ替えが完了するまでコレクションの管、フィルター、キャップの 35 μ m ナイロン メッシュを組み込んだに転送。否定的な制御サンプル (ステップ 2.2.4) と同じ手順を実行します。
- 製造元のプロトコルに従って流れの cytometer を使用して並べ替えを実行します。
- Y27632 の 10 μ M を添加した CDM 基礎培地 4 mL を含む 15 mL の円錐管に並べ替えられた DLL1 陽性細胞を収集します。総 RNA の抽出、3 分 280 × gで遠心分離し、RNA の換散バッファーで再懸濁し、-30 ° C で保存RNA の抽出、逆のトランスクリプションおよび RT qPCR 手順 (セクション 5.1) より詳細な情報を参照してください。
- 並べ替えセルを用いた SM 分化を実行、以下のプロトコル (セクション 3)。
3. SM PSM から分化
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並べ替えられた DLL1 正 PSM 細胞 (4 日 8 日目) から SM 分化
注: ECM ソリューション コーティング 12 ウェル プレートに FACS を並べ替える前に一日を準備します。ECM ソリューション コーティング 12 ウェル プレートの準備 4 ° c を各ウェルに ECM ソリューションの 1 つの mL を追加し、一晩おきます。準備している間氷の上の ECM ソリューションを保持します。- 次の 3 分間ステップ 2.2.10、280 × gで遠心します。
- 慎重に、上清を吸引し、SM 誘導培地 1 mL で再懸濁します (10 μ m CDM 基底培 SB431542 と 5 μ M CHIR99021、表 1を参照)。
- 自動化された細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。
- SM 誘導培 Y27632 の 10 μ m の 1 mL を含む ECM ソリューション コーティング 12 ウェル プレートの各ウェルに種子 1.0 x 105セル。
- 5% CO2と 37 ° C で 8 日までの 4 日間インキュベートします。日 5 (FACS を並べ替えた後の日) と一日 7 Y27632 を含まない培地を変更します。
- SM 誘導体分化細胞以下のプロトコルによると SM を使用してを実行します。SM この細胞からの総 RNA の抽出、15 mL の円錐管 280 x gで 3 分間遠心し、細胞を収集し、RNA の換散バッファーで再懸濁し、-30 ° C で保存
4 SM から SM (DM、墓、D、SCL、SYN) 誘導体分化
注:SM 細胞の全能力を示すためには、まず DM (dermomyotome) と SM の iPSC 由来細胞を使用してそれに応じて SCL (心) の誘導を実行します。その後、墓 (筋節) を行い、DM 細胞を用いた D (dermatome) 誘導と SCL 細胞を用いた SYN (syndetome) の誘導を行います。In vitro における各誘導体 (DM、墓、D、SCL、および SYN) SM この細胞からの誘導のためのプロトコルのとおりです。
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SM 細胞 (8-日 11 日目) から DM 分化
- 媒体を吸引し、DM 誘導培地 1 mL を追加 (5 μ m CDM 基底培 CHIR99021 と 10 ng/mL BMP4、表 1を参照)。
- 11 日まで 3 日間の 37 ° c、5% の CO2とセルを孵化させなさい。10 日目 (日 DM 2 誘導) のメディアを変更します。
- 墓を実行し、以下のプロトコルによると DM 細胞を誘導 D による。
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DM 細胞 (日 11 日 41) から墓の分化
- 、培地を吸引し、墓誘導培地 1 mL を追加 (5 μ M を添加した CDM 基礎培地 CHIR99021、表 1を参照)。
- 41 日まで 30 日間で 37 ° C、5% CO2セルを孵化させなさい。3 日ごとに媒体を変更します。
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DM 細胞 (11 日 20 日目) から D 分化
- 媒体を吸引し、D 誘導培地 1 mL を追加 (5 μ m CDM 基底培 CHIR99021 と 10 ng/mL BMP4、表 1を参照)。
- 20 日まで 9 日間の 37 ° c、5% の CO2とセルを孵化させなさい。3 日ごとに媒体を変更します。
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SM 細胞 (8-日 11 日目) からの SCL 分化
- 媒体を吸引し、SCL 誘導培地 1 mL を追加 (CDM 基底培 100 nM サグと 0.6 μ M LDN193189、表 1を参照)14。
- 3 日間の 37 ° c、5% の CO2とセルを孵化させなさい。10 日目 (日 SCL 2 誘導) のメディアを変更します。
- SYN 分化細胞以下のプロトコルに従って SCL を使用してを実行します。
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SCL 細胞 (日 11 日 32) から SYN 分化
注: ECM ソリューション コーティング 24 ウェル プレートに SYN 誘導を開始する前に一日を準備します。ECM ソリューション コーティング 24 ウェル プレートを準備、4 ° c を各ウェルに ECM 溶液 0.5 mL を追加し、一晩おきます。準備している間氷の上の ECM ソリューションを保持します。- 培地を吸引し、PBS で洗浄し、各ウェルに細胞解離試薬 0.2 mL を追加し、ルート 3 分のまま
- 各ウェルに CDM 基礎培地の 0.8 mL を追加し、こすりし、15 mL の円錐管にすべての電池を収集します。
- 280 x gで 3 分間遠心します。
- 慎重に、上清を吸引し、SYN 誘導媒体 1 の 1 mL で再懸濁します (20 ng/ml、FGF8 CDM 基底培は、表 1を参照)、その後、自動化された細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。
- 1 SYN 誘導培地 1 mL を含む ECM ソリューション コーティング 24 ウェル プレートの各ウェルに種 5.0 × 104セルです。
- 37 ° c、5% の CO2と 3 日間インキュベートします。
- SYN 誘導中 2 に置き換えます日 14 (日 SYN 3 誘導)、媒体 (10 ng/mL BMP7 と 10 ng/mL TGFβ3、CDM 基底培は、表 1を参照)。
- 37 ° c、5% CO232 日まで 18 日間インキュベートします。3 日ごとに媒体を変更します。
5. iPSC 由来物のキャラクタリゼーション
注:分化に量的なリアルタイム PCR (RT qPCR)、免疫細胞化学 (ICC)、酵素抗体法 (ELISA)、機械的ストレッチ刺激試金をそれに応じて使用人間 Ips の誘導体を特徴付けます。
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セル収穫、総 RNA の抽出、逆のトランスクリプション、定量的リアルタイム PCR (RT qPCR)
- 1.5 mL チューブに細胞サンプル (5.4.3 3.1.6、2.2.10、(プロシージャ) を収集し、3 分間 280 × gで遠心分離機します。
- 、上清を除去し、適切なトータル RNA の抽出キットによって提供される RNA 換散バッファーの 350 μ L で再懸濁します。
- 製造元のプロトコルに従ってキットを使用して総 RNA を抽出します。
- 逆は、製造元のプロトコルに従って cDNA への総 RNA の隔離の 1 μ g を書き写します。
- RT qPCR 適切な酵素、試薬、製造元のプロトコルに従ってプライマーを使用してを実行します。表2 本研究で使用されるプライマー シーケンスのとおりです。
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免疫細胞化学 (ICC)
- 抗体を用いた免疫細胞化学を実行する、前に 10 分、4 ° C で 2% パラホルムアルデヒドとセルを修復する、PBS で 2 回洗ってください。
- 透過性、4 ° C 15 分で 0.2% メタノールまたは 0.2% ポリソルベート 20/PBS (PBS T という) 孵化させなさい。
- 透過試薬を削除し、適切なブロック バッファーまたは 1% ウシ血清アルブミン/PBS で 4 ° C, 60 分で細胞を治療します。
- 一晩 PBS T と 4 ° C で振動マシン上の場所のブロック バッファーを 10% に希釈した最初の抗体を追加します。
- PBS T と 3 回洗浄 (PBS T を追加し、10 分間振動マシン RT 時に配置)。
- PBS T と 60 分間常温振動マシン上の場所のブロック バッファーを 10% に希釈した 2 番目の抗体を追加します。本研究で使用される ICC の最初と 2 番目の抗体は、表 3のとおりです。
注:このステップからホイルで包むことによってライトからプレート/皿を保護します。 - PBS"T"で 2 回洗う
- カウンターは染色、PBS と 5 分間常温振動マシン上の場所で希釈 1/5000 DAPI を追加します。
- DAPI のソリューションを削除し、各ウェルに PBS を追加します。
- 蛍光顕微鏡を用いた細胞染色を観察します。また、1 ヶ月の 4 ° C でプレート/皿を格納します。
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D の iPSC 由来の機能解析のための酵素免疫測定法 (ELISA)
注:ひと真皮線維芽細胞 (HDF) 市販されています。10% 牛胎児血清を DMEM で HDF を文化 (表 1参照)。- 各培養液 1 mL を含む 24 ウェル プレートに iPSC 由来 D と HDF の種子 1.0 x 105セル (:d 誘導培地、HDF: 10% 牛胎児血清を DMEM)。
- 1.5 mL チューブに配置し、4 ° C で保存後, 培養細胞の 3 日間は、各媒体の 100 μ L を収集
- 製造元の指示に従って一連のプロシージャ、検出抗体、二次抗体の追加などを実行し、コントロールの濃度に対して標準的な曲線を生成することでターゲットの数を定量化します。検体サンプル。
-
SYN の iPSC 由来の機能解析のための機械的ストレッチ刺激アッセイ
注:大人の人間の線が市販 (材料の表を参照してください)。文化人間 iPSC 由来 SYN と18,19以下のとおりストレッチ機械的ストレッチ刺激測定装置のセルに大人の人間線。SYN 誘導の中 2 と線成長媒体の使用 (材料表参照) 各 iPSC 由来 SYN と大人の人間の線の培養培地としてそれぞれ。- ストレッチ前に 24 h で、iPSC 由来 SYN の ECM ソリューション コーティング マルチ井戸型シリコン ラバーに人間線板 1.0 x 105セル室、それぞれ 1.5 cm × 1.5 cm の文化面 (材料の表を参照してください)。
- セルの伸張のためのデバイスのチャンバーを設定し、強制的に一軸ひずみ (0.5 Hz、5%)12 時間。
- 総 RNA の抽出、RNA 換散バッファーの 350 μ L を追加し、こすりし、総 RNA の抽出とその後の RT qPCR 分析 (手順 5.1 参照) を 1.5 mL チューブに細胞を収集します。
Representative Results
本報告ではすべての数字は、EGFP がエクソン 1 の PAX3 コーディング シーケンスの 1 つの対立遺伝子を置き換えられます 201B7 PAX3 GFP Ips が得られました。201B7 PAX3 GFP Ips の確立になります (個人的なコミュニケーション、櫻井弘久) は別記します。統計ソフトウェアを使用して統計的有意性が評価されました。P 値は 0.05 が重要と考えられていたよりも下げます。
ひと PSM と SM、iPSC 由来細胞のキャラクタリゼーション
PSM 状態 (図 2 a)、FACS 解析を通じて SM に向かって人間 Ips の分化を評価するには、ICC 解析と Rt-qpcr 解析を行った。図 2 bに示すように、以上 85% の細胞陽性 DLL1 PAX3、sm、マーカー陰性、PSM のマーカー人間 Ips の PSM 誘導の 4 日後。その後、この人口 SM 誘導の 4 日後 PAX3 SM 陽性になった。PSM SM 遷移も ICC (図 2) と Rt-qpcr (図 2 D) 確認されました。TBX6、MSGN1、WNT3A、PSM のマーカーは PSM 状態 (4 日目) で表されるが、SM 状態 (8 日目) で表現できません。実践、MEOX1、および PAX3、SM のマーカー、SM で発現しますが、PSM で表現できません。さらに、CDH11、epithelialized SM のマーカーの染色細胞ジャンクション、CHIR99021 と SB431542 の添加で蓄積されただけ (図 2 e)。
SM 人間 iPSC 細胞から誘導された SM 誘導体のキャラクタリゼーション
PAX3 (GFP) と ICC 解析による評価された DM や墓、D、SCL、SYN (図 3 a) へ分化人間 iPSC 由来 SM の分化能を評価する-蛍光。図 3Bに示すとおり、DM の分化が確認された ALX4、EN1 染色と PAX3 (GFP)-蛍光;墓の分化が確認された MYOD と MYOG、ミオシン重鎖) の汚損;EN1 と PDGFRa 汚損; D 分化が確認されました。SCL の分化が確認された PAX1、PAX9、および NKX3.2 の汚損;SYN の分化は、SCX、MKX、COL1A1、COL1A2 によって確認した染色します。
誘導の D と SYN のキャラクタリゼーション
1. 酵素抗体法 (ELISA) の D の iPSC 由来の機能解析
人間の体内では、コラーゲンとヒアルロン酸が肌に潤いし、皮膚構造を維持するためなどの細胞外マトリックス (ECM) タンパク質を分泌する真皮線維芽細胞の主な機能の 1 つです。コラーゲン タイプ 1 とヒアルロン酸蛋白質の対等な量は iPSC 由来 D と HDF の培養液中に分泌された示すために、図 4 aに示すように、ELISA 実行されました。
2. 機械ストレッチ刺激アッセイの SYN の iPSC 由来の機能解析
としていくつかの研究は既に報告している、機械的刺激が腱開発前に、と出産後に影響し、前駆体細胞18,19から線の分化を促進します。したがって、よく知られている線の特徴の一つである機械的ストレスに対する反応性です。人間 iPSC 由来 SYN と人間の大人線の同等の反応性を示すためには、機械的ストレッチ刺激法を図 4 bに示すように、行った。
図 1: 沿軸中胚葉の階層分化のスケマティック ビュー 。Presomitic 中胚葉は一過性初期胚発生の間に現れるとフォームの体節への分割を経る細胞集団です。体節は複数の細胞の種類、腱/靭帯、骨・軟骨、骨格筋、真皮に最終的に区別するため椎板、dermomyotome、syndetome、皮膚分節、筋節の細胞などを生じさせる一時的な茎セル人口セルです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ICC、Rt-qpcr、FACS 解析人間 iPSC 由来 PSM と SM.(A) PSM による SM の差別化のためのプロトコルの模式図。(B) DLL1 染色と PAX3 (GFP) の代表的なドット プロット-PSM 誘導の 4 日目と日 4 (iPSC から 8 日) SM 誘導蛍光。(C) 代表免疫細胞化学的イメージと PAX3 (GFP)-PSM 誘導の 4 日目と日 4 (iPSC から 8 日) SM 誘導蛍光。染色された反 TBX6、実践、MEOX1 と、抗体 (赤) と共同染色 DAPI (青) または PAX3 (GFP) とを検出-蛍光 (緑)。(D) RT qPCR、iPSC に PSM と SM PSM と SM のマーカーの解析。実験の 3 つのセットから平均 ± 標準誤差 (東南) が表示されます。(E) 代表免疫細胞化学的画像、SM の日 4 (iPSC から 8 日目) に S10I10 の培養 (SB431542 と IWR1、WNT シグナル伝達阻害剤の組み合わせ)、S10 (SB431542)、S10C5 (SB431542 と CHIR99021 の組み合わせ) 条件。細胞 (赤) 抗 CDH11 抗体で染色, 共同染色 DAPI (ブルー).iPS、誘導多能性幹細胞。PSM、presomitic 中胚葉。SM, 体節;S10、SB431542 10 Μ M;C5、CHIR99021 5 Μ M;I10、IWR1 10 Μ M;スケール バー = 50 μ m。この図は、中島ら (2018)15から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 人間の iPSC 由来 SM. から区別される DM や墓、D、SCL、SYN の ICC 解析(A) SM 誘導体分化の模式図。(B) 代表免疫細胞化学的イメージと PAX3 (GFP)-DM 誘導の日 3 (iPSC から 11 日目)、墓誘導の日 30 (iPSC から 41 日目)、D 誘導の日 9 (iPSC から 20 日)、SCL 誘導の日 3 (iPSC から 11 日目)、21 (日 32 日目の蛍光iPSC) から SYN 誘導。DM は、細胞が抗 ALX4 抗体 EN1 (赤) とステンド グラスし共同染色 DAPI (青) または PAX3 (GFP) とを検出-蛍光 (緑);墓、アンチ MYOD、MYOG (赤)、また共同染色 DAPI (ブルー); MHC (シアン) 抗体と細胞染色D 細胞反 EN1 (赤) と PDGFRa (シアン) 抗体で染色, 共同染色 DAPI (青);SCL、細胞であった (赤) 抗体、抗 PAX1、PAX9、NKX3.2 とステンド グラスし、共同染色 DAPI (青);SYN、細胞であった (赤) 抗体、抗 SCX、MKX、COL1A1、COL1A2 とステンド グラスし、共同染色 DAPI (青)。DM、dermomyotome;墓、筋節;D, 皮膚分節。SCL、椎板;SYN、syndetome;スケール バー = 50 μ m。この図は、中島ら (2018)15から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 誘導の D とちゃかさ機能試金(A) elisa 法による培養液中のタンパク質を分析したコラーゲン タイプ 1 とヒアルロン酸の量。メカニカル ストレッチの効果 (B) 刺激誘導 SYN と人間の大人の線は、RT qPCR によって評価されました。実験の 3 つのセットから平均 ± 標準誤差 (東南) が表示されます。* p < 0.05;* * p < 0.01;Dunnett の複数比較 t-テストによってストレッチ (-) と比較してp < 0.001宮川、重要でない、HDF、ひと成人皮膚線維芽。この図は、中島ら (2018)15から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 媒体/ソリューション | Reagant | 濃度 |
| CDM 基礎培地 | Iscove の変更ダルベッコ媒体/ハム F12 | 1:1 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 0.5% | |
| 脂質濃縮物を化学的に定義 | 1% | |
| Apo トランスフェリン | 15 mg/mL | |
| Monothioglycerol | 450 mM | |
| ウシ血清アルブミン | 5 mg/mL | |
| インスリン | 7 mg/mL | |
| CTK ソリューション | 水 | - |
| トリプシン | 0.25% | |
| コラゲナーゼ IV | 0.1 mg/mL | |
| 塩化カルシウム | 1 mM | |
| ノックアウト SR | 20% | |
| D 誘導培地 | CDM 基礎培地 | - |
| CHIR99021 | 5 Μ M | |
| BMP4 | 10 ng/mL | |
| DM 誘導培地 | CDM 基礎培地 | - |
| CHIR99021 | 5 Μ M | |
| BMP4 | 10 ng/mL | |
| ECM ソリューション | 人工細胞外マトリクス | 0.3 mg/mL |
| DMEM/F12 | - | |
| FACS バッファー | PBS | - |
| ウシ血清アルブミン | 0.1% | |
| 無料のフィーダー細胞培養培地 | mTeSR1 | - |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 0.5% | |
| HDF 培 | DMEM | - |
| ウシ胎児血清 | 10% | |
| hESC 媒体 | 霊長類 ES 細胞用培地 | - |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 0.5% | |
| FGF2 | 4 ng/mL | |
| 墓誘導培地 | CDM 基礎培地 | - |
| CHIR99021 | 5 Μ M | |
| PSM 誘導培地 | CDM 基礎培地 | - |
| SB431542 | 10 Μ M | |
| CHIR99021 | 10 Μ M | |
| DMH1 | 2 Μ M | |
| FGF2 | 20 ng/mL | |
| SCL 誘導培地 | CDM 基礎培地 | - |
| サグ | 100 nM | |
| LDN193189 | 0.6 Μ M | |
| SM 誘導培地 | CDM 基礎培地 | - |
| SB431542 | 10 Μ M | |
| CHIR99021 | 5 Μ M | |
| SYN 誘導培地 1 | CDM 基礎培地 | - |
| FGF8 | 20 ng/mL | |
| SYN 誘導媒体-2 | CDM 基礎培地 | - |
| BMP7 | 10 ng/mL | |
| TGFΒ3 | 10 ng/mL |
表 1: メディア ・ ソリューションのレシピ。
| 名 | フォワード | 逆 |
| ACTB | CACCATTGGCAATGAGCGGTTC | AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT |
| COL1A1 | GGACACAGAGGTTTCAGTGGT | GCACCATCATTTCCACGAGC |
| MEOX1 | GAGATTGCGGTAAACCTGGA | GAACTTGGAGAGGCTGTGGA |
| MSGN1 | GGAGAAGCTCAGGATGAGGA | GTCTGTGAGTTCCCCGATGT |
| 実践 | TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT | CACACCCTGTCACCAACAGT |
| PAX3 | AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG | CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG |
| SCX | CCCAAACAGATCTGCACCTTC | GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC |
| TBX6 | AGCCTGTGTCTTTCCATCGT | AGGCTGTCACGGAGATGAAT |
| TNMD | CCCTTCATGCTGAAGCCACTT | CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG |
| WNT3A | CAAGATTGGCATCCAGGAGT | ATGAGCGTGTCACTGCAAAG |
表 2: プライマー シーケンス RT qPCR 分析のため。
| 濃度 | ||
| 第 1 回 抗体 |
ALX4_Goat | 1/50 |
| CDH11_Mouse | 1/1000 | |
| COL1A1_Rabbit | 1/100 | |
| COL2A1_Mouse | 1-2 μ g/mL | |
| EN1_Rabbit | 1/50 | |
| MEOX1_Rabbit | 1/50 | |
| MHC_Rabbit | 1/200 | |
| MKX_Rabbit | 1/50 | |
| MYOD_Rabbit | 1/500 | |
| MYOG_Mouse | 1/400 | |
| NKX3.2_Rabbit | 1/50 | |
| PARAXIS_Rabbit | 1/50 | |
| PAX1_Rabbit | 1/50 | |
| PAX9_Rabbit | 1/50 | |
| PDGFRa_Goat | 1/100 | |
| SCX_Rabbit | 1/50 | |
| TBX6_Goat | 1/50 | |
| 第 2 回 抗体 |
ヤギ IgG(H+L) セカンダリ antibody555 アンチ ロバ | 1/500 |
| ヤギ IgG(H+L) セカンダリ antibody647 アンチ ロバ | 1/500 | |
| ヤギ抗マウス IgG(H+L) セカンダリ antibody555 | 1/500 | |
| ヤギ抗うさぎ IgG(H+L) セカンダリ antibody555 | 1/500 | |
| ヤギ抗うさぎ IgG(H+L) セカンダリ antibody647 | 1/500 |
表 3: 最初 ICC の抗体を 2 番目。
Discussion
PSM を PSC から派生した SM の誘導のためのよく知られているメソッドは、PSC から PSM の誘導中に、PSM 成熟プロセス6時ではなく CHIR99021 + A83 01 (TGFβ 阻害剤) の組み合わせです。本研究では WNT/β-カテニン シグナル伝達抑制された C59 を使用して PSM から SM を誘導します。ただし、紹介した SM 分化における wnt シグナル経路をアクティブにする CHIR99021 を使用。この決定はだったいくつか WNTs が SM の周囲のティッシュに表現される、WNT 記者は SM20でアクティブであるという事実を与えられて見つけることに基づいて行われます。その結果、細胞の接合 (図 2 e) の CDH11 の蓄積による上皮形成、SM CHIR99021 との条件の下でのみ、生体内での特性を観測しました。この観測は、WNT シグナル伝達 PSM 分化と SM 上皮形成中にしたがって我々 のプロトコル可能性がありますより内因性信号環境を要約の重要な関与を示します。但し、それはまた堅牢性と分化の効率は、細胞の種類、細胞株、様々 なによって大きく異なります可能性がありますので、WNT/β-カテニン シグナル伝達経路の分化の微調整のそれ以上の可能性を意味します。WNT の誘導剤である各研究者によって使用される化学化合物。
このメソッドでは、ヒトの Ips からすべて 4 SM 誘導体、墓、D、SCL、SYN を生成することもできます。CDM を使用して私達の段階的なプロトコル人間形成/体節形成、中に信号の要件を識別するために使用することができ、SM の発達に重要な洞察を提供します。たとえば、私たちの方法は、分割クロック メカニズム、SM の形成を調節する分子振動システムを勉強するため役に立つかもしれない。適切な実験ツールの不足のための人間ではなく、マウス、雛、ゼブラフィッシュ、徹底的に調査されています。
また、本手法は、将来臨床細胞ベースの治療に適用できます。たとえば、人間の iPSC 由来 D または SYN 重傷を負った皮膚に移植することができます。 または再生と治療のための腱を破裂します。ただし、いくつかの制限は、このメソッドを実際に適用する前に解決する必要があります。これらヒト以外の動物から派生した試薬がする必要がありますが、本研究では iPSC メンテナンスおよび誘導中、皿に表面コート Engelbreth ・ ホルム群れのマウス肉腫から抽出し, ECM ソリューションのため SNL フィーダー細胞を使用医療の質を改善するために削除されます。また、細胞量と純度と必要な細胞の成熟を含み、品質は改善もする必要があります。さらに、細胞の数だけでなく、細胞の強度は、腱/靭帯再生の重要な特徴です。また、精製の表面マーカーおよび 3 D 再構成法の開発が臨床細胞ベースの治療に私達のプロトコルを進めるために不可欠であるありません。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
博士戸口田淳 (CiRA) プロジェクト管理と資金獲得、柴田光明 (CiRA) さんメイ寺島 (CiRA) その技術支援のため、博士弥生豊岡 (CiRA) と博士大輔神谷 (CiRA) 彼の助けを感謝したいと思います自分の校正原稿と氏正也戸谷 (CiRA) の図 (図 1) を提供するため。我々 はまたこの調査の間に、池谷、戸口田研究所 (CiRA) 彼らのサポートのためのすべてのメンバーを感謝します。この作業によって支えられた補助金日本社会科学研究のための科学振興) (26670661)、難治性疾患研究を活用した疾患特異 iPS 細胞の科学技術振興のためのプログラム振興機構 (JST)、日本医療研究開発 (アメッド) 局 (科学技術振興機構/アメッド)、再生医療実現のための研究センターのネットワーク iPS 細胞研究、iPS 細胞研究基金の中心 (池谷誠と戸口田淳)。池谷誠はだった (アメッド) 疾患特異的 iPS 細胞を利用した難治性の病気の研究の科学的研究 (JSP) (16 H 05447) とアクセラレータ プログラム費をサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
| Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
| CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
| Cell streching device | Strex | STB-140 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | |
| COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
| COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
| Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
| DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
| DMEM | Sigma | D6046 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
| DMH1 | Tocris | 4126 | |
| EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
| Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
| FGF2 | Wako | 060-04543 | |
| FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
| Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
| Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
| Insulin | Wako | 090-06474 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
| Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Axon | 1509 | |
| Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
| MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
| MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
| MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
| Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
| MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
| MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
| NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
| Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
| PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
| PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
| PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
| PBS | - | - | |
| PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
| SAG | Calbiochem | 566661 | |
| SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
| SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
| TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
| Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
| TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
| Trypsin | Gibco | 15090046 |
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