Wij presenteren hier een protocol voor de differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen in elke Somiet derivaat (myotome, sclerotome, dermatoom en syndetome) in chemisch gedefinieerde voorwaarden, die toepassingen heeft in de toekomst ziekte modellering en cel-gebaseerde therapieën in orthopedische chirurgie.
In reactie op signalen zoals WNTs, bone morfogenetische eiwitten (BMP’s) en sonic hedgehog (SHH) uitgescheiden door de omringende weefsels, somieten (SMs) aanleiding geven tot meerdere celtypen, met inbegrip van de myotome (MYO), sclerotome (SCL) dermatoom (D) en syndetome (SYN) , die op zijn beurt uitgroeien tot skeletspieren, axiaal skelet, dorsal dermis en axiale pees/ligament, respectievelijk. Dus, de generatie van SMs en hun derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) is cruciaal voor het verkrijgen van pluripotente stamcellen (PSC) voor toepassing in de regeneratieve geneeskunde en voor onderzoek van de ziekte op het gebied van orthopedie. Hoewel de inductie protocollen voor MYO en SCL van PSC’s zijn eerder gemeld door diverse onderzoekers heeft geen studie nog aangetoond de inductie van SYN en D van iPSCs. Daarom, efficiënte inductie van volledig bevoegde SMs blijft een belangrijke uitdaging. Hier, recapituleren we menselijke SM patronen met menselijke iPSCs in vitro door het nabootsen van de signalering milieu tijdens het kuiken/muis SM ontwikkelen, en verslag over methoden van systematische inductie van SM derivaten (MYO, SCL D en SYN) van menselijke iPSCs onder chemisch via de presomitic mesoderm (PSM) en SM-Staten ervan vastgestelde voorwaarden. Kennis over kuiken/muis SM ontwikkeling werd met succes toegepast op de inductie van SMs met menselijke iPSCs. Deze methode zou een nieuwe tool voor het bestuderen van de menselijke somitogenesis en patronen zonder het gebruik van embryo’s voor cel-gebaseerde therapie en modellering van de ziekte.
Ontwikkeling van een methode gerichte differentiatie voor een gewenste celtype van PSC is een noodzakelijke stap voor de studie van de PSC-afgeleide cellen omzetten in klinische toepassingen. Gedwongen expressie van genen die sleutel is een veelbelovende strategie voor orgel-celdifferentiatie van PSC’s en ons begrip van de genetische regulatie van cel lot bepaling, orgel morfogenese, en organisatie tijdens de embryogenese1is verbeterd. Daarnaast Recapitulerend het endogene signalering omgevingen, met behulp van de ontwikkeling van muis en chick embryo’s als een routekaart, wordt als essentieel beschouwd voor de gestuurde differentiatie van de PSC. Echter, gezien de toepassing van PVC-afgeleide cellen in klinische studies zoals cel-gebaseerde therapieën, de laatste strategie is geschikter omdat het vereist geen genetische manipulatie.
Verschillende studies hebben melding gemaakt van de inductie van mesoderm van menselijke en muis PSC’s in chemisch welbepaalde voorwaarden. Doorgaans worden deze methoden hebben vertrouwd op activin/knooppunten/transformeren groeifactor β (TGFβ) signalering en bot morfogenetische eiwit (BMP) signalering, geloofde te voeren meso-endoderm en mesoderm differentiatie, wat resulteert in een lage inductie efficiëntie van de Paraxiale mesoderm (ongeveer 20%)2. Met andere woorden, was de PSC-afgeleide mesoderm geïnduceerd door deze signaalroutes voornamelijk laterale plaat mesoderm en niet Paraxiale mesoderm. Onlangs, een paar studies hebben aangetoond dat de efficiënte productie van PSC-afgeleide Paraxiale mesoderm gebaseerd op verschillende strategieën3,4,5,6,7,8 . In deze studies, PSC’s werden gekweekt met relatief hoge concentraties van glycogeen synthase kinase 3 (GSK3) remmers (WNT signalering activators), dus de efficiëntie van de inductie van Paraxiale mesoderm bereikte 70%-95%6,7 .
In somitogenesis, de Paraxiale mesoderm eerst vormt de presomitic mesoderm (PSM) posteriorly en vormt dan somieten (SMs) in het voorste deel t/m mesenchym-naar-epitheliale overgang9,10. Inkeping ligand Delta-achtige 1 (DLL1) wordt genoemd dat een centrale rol tijdens somitogenesis, oscillerende controle van DLL1 expressie, zowel in mRNA en eiwit niveau, regelt de segmentering van de SM. SMs uiteindelijk onderverdelen in twee delen, die aanleiding geven tot de dermomyotome (DM) dorsally en sclerotome (SCL) ventrally11. Vervolgens onderscheidt de DM in de dermatoom (D), een voorloper van de dermis, en myotome (MYO), een voorloper van de skeletspieren; Bovendien, vormt een ventrale gedeelte van SCL de syndetome (SYN), een voorloper van pezen en ligamenten12 (Figuur 1). Sommige onderzoekers hebben gemeld de inductie van PSC-afgeleide SM derivaten zoals MYO4,13 en SCL14; Er zijn echter verschillende beperkingen in deze studies. Met name, aangezien onze kennis van de signalering omgevingen van D en SYN fragmentarisch is, hebben inductie protocollen voor D en SYN nog niet systematisch vastgesteld. Om aan te tonen de volledig-bevoegdheid van SMs geïnduceerde van PSC’s, is het essentieel om te laten zien van de multi differentiatie capaciteit van geïnduceerde SMs in alle vier derivaten (D, MYO SCL en SYN), terwijl eerdere studies alleen op specifieke SM derivaten gericht hebben. Wij rapporteren hier over hoe te genereren van alle vier SM-derivaten, met inbegrip van D en SYN, via PSM en SM lot van menselijke iPSCs15. Wij zijn van mening dat tot oprichting van een in vitro stapsgewijze methode die modellen het SM-ontwikkelingsproces kan bijdragen tot de studie van hoe menselijke SM tijdens de embryogenese, ontwikkelt zonder het gebruik van embryo’s.
Een bekende methode voor de inductie van PSC-afgeleide SM via PSM is de combinatie van CHIR99021 + A83-01 (TGFβ remmer) tijdens PSM inductie van PVC, maar niet tijdens de PSM rijping proces6. In de huidige studie, was WNT/bèta-catenine signalering geremd met behulp van C59 voor het opwekken van de SM uit PSM. Echter introduceerde we het gebruik van CHIR99021 om te activeren van de Wnt tijdens SM differentiatie. Dit besluit werd gemaakt gebaseerd op de bevinding dat verscheidene WNTs worden uitgedrukt in de omliggende weefsels van SM en het feit gezien dat de WNT verslaggevers actief in de SM20 zijn. Daardoor zien we epithelialization, een kenmerk van SM in vivo, alleen onder de voorwaarde met CHIR99021, gebaseerd op de accumulatie van CDH11 in cel kruispunten (figuur 2E). Deze constatering geeft aan de kritische betrokkenheid van WNT signalering tijdens PSM differentiatie en de SM epithelialization, daarom dat ons protocol kan beter het endogene signalering milieu recapituleren. Echter, het impliceert ook een verdere mogelijkheid van “fine-tuning”-de WNT/bèta-catenine signalering traject tijdens de differentiatie, omdat de robuustheid en de efficiëntie van differentiatie aanzienlijk afhankelijk van de celtypes, cellijnen en diverse variëren kunnen chemische verbindingen van WNT-inductoren gebruikt door elke onderzoeker.
Deze methode ook stelt ons in staat om te genereren van alle vier SM derivaten, MYO D, SCL en SYN, uit menselijke iPSCs. Onze stapsgewijze protocollen met behulp van CDM kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de signalering eisen tijdens menselijke somitogenesis/Somiet patronen, en belangrijk inzicht verwerven in de ontwikkeling van menselijk SM. Bijvoorbeeld, kunnen onze methoden nuttig voor het bestuderen van de segmentatie klok mechanismen, een moleculaire oscillatie systeem dat de vorming van SM regelt zijn. Het is grondig onderzocht in muizen, kuikens en zebrafish, maar niet bij de mens als gevolg van het gebrek aan adequate experimentele instrumenten.
Bovendien kunnen onze methode die van toepassing zijn om toekomstige klinische cel-gebaseerde therapieën. Bijvoorbeeld menselijke iPSC afkomstige D SYN in ernstig gewonde huid kan worden getransplanteerd of gescheurde pezen voor regeneratie en behandeling. Echter verschillende beperkingen moeten worden opgelost alvorens deze methode praktisch kan worden toegepast. Hoewel in de huidige studie, gebruikten we SNL feeder cellen voor iPSC onderhoud en ECM-oplossing, die wordt gewonnen uit de Engelbreth-Holm-Swarm muis Sarcoom, als een oppervlak vacht op de schotel tijdens inductie, moeten deze niet-menselijke dieren afkomstige reagentia zijn verwijderd om klinische kwaliteit te verbeteren. Daarnaast moeten cel kwantiteit en kwaliteit, waaronder de zuiverheid en de rijping van de gewenste cellen, ook worden verbeterd. Bovendien, niet alleen het nummer van de cel, maar ook de sterkte van de cel is een belangrijk kenmerk voor regeneratie van de pees/ligament. Daarnaast is de ontwikkeling van oppervlakte markers voor reiniging en een nieuwe methode voor 3D reconstructie zijn onontbeerlijk om onze protocollen vooraf aan klinische cel-gebaseerde therapieën.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen bedanken, Dr. Junya Toguchida (CiRA) voor zijn hulp met de projectadministratie en financiering van de overname, Mr. Mitsuaki Shibata (CiRA) en Ms. Mei Terashima (CiRA) voor hun technische bijstand, Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) en Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) hun proeflezen van het manuscript en Mr. Masaya Todani (CiRA) voor het verstrekken van een illustratie (Figuur 1). Wij danken alle leden van de Ikeya en Toguchida labo (CiRA) voor hun steun tijdens deze studie. Dit werk werd gesteund door de Grants-in-aid voor wetenschappelijkonderzoek van de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) (26670661), het programma voor hardnekkige ziekten onderzoek met behulp van ziekte-specifieke iPS cellen uit het Japan wetenschap en technologie Agentschap (BJS) en het Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED), het Core Center for iPS celonderzoek van het onderzoeksnetwerk centrum voor de realisatie van regeneratieve geneeskunde (JST/AMED), en het iPS-cel onderzoeksfonds (voor een deel aan Makoto Ikeya en Junya Toguchida). Makoto Ikeya werd ook ondersteund door Grants-in-aid voor wetenschappelijk onderzoek (JSPS) (16H 05447) en het programma van de versnelling voor hardnekkige onderzoek van ziekten met behulp van ziekte-specifieke iPS cellen (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |