Presentamos aquí un protocolo para la diferenciación de células madre humanas pluripotentes inducidas en cada derivado del somite (miotoma sclerotome, dermatoma y syndetome) en condiciones químicamente definidas, que tiene aplicaciones en modelos futuros de la enfermedad y terapias basadas en células en cirugía ortopédica.
En respuesta a señales como WNTs, ósea las proteínas morfogenéticas (BMPs) y sonic hedgehog (SHH), secretado de los tejidos circundantes, somitas (SMs) dan lugar a múltiples tipos de células, incluyendo el miotoma (MYO) sclerotome (SCL), dermatoma (D) y syndetome (SYN) , que a su vez se convierten en músculo esquelético, esqueleto axial, dermis dorsal y tendón/ligamento axial, respectivamente. Por lo tanto, la generación de SMs y sus derivados de las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) es fundamental para obtener células pluripotentes (PSC) para su aplicación en medicina regenerativa y la investigación de enfermedades en el campo de la cirugía ortopédica. Aunque los protocolos de inducción para MYO y SCL de PSCs se han divulgado previamente por varios investigadores, ningún estudio todavía ha demostrado la inducción de la síntesis y la D de iPSCs. Por lo tanto, inducción eficiente de SMs completamente competentes sigue siendo un desafío importante. Aquí, nos recapitular patrones humanos de SM con iPSCs humano in vitro imitando el entorno señalización durante el desarrollo de SM de pollo y ratón e Informe sobre métodos de inducción sistemática de SM derivados (MYO, SCL, D y SYN) iPSCs humano bajo químicamente condiciones definidas a través de los Estados de SM y mesoderm presomitic (PSM). Conocimiento sobre el desarrollo de SM de chick y el ratón fue aplicado con éxito a la inducción de SMs con iPSCs humana. Este método podría ser una herramienta novedosa para estudiar somitogenesis humana y patrones sin el uso de embriones y para terapia basada en células y modelos de enfermedad.
Desarrollo de un método de diferenciación dirigida para un tipo de célula deseada del PSC es un paso necesario para convertir el estudio de las células derivadas de PSC en aplicaciones clínicas. Forzada expresión de genes clave es una estrategia prometedora para la diferenciación de células del órgano del PSC y ha mejorado nuestra comprensión de la regulación genética de la determinación de destino celular, morfogénesis órgano y organización durante la embriogénesis1. Además, recapitulando los ambientes señalización endógenos, mediante el desarrollo de embriones de ratón y pollo como hoja de ruta, se considera esencial para la diferenciación dirigida de PSCs. Sin embargo, dada la aplicación de las células derivadas de PSC en estudios clínicos como terapias celulares, la última estrategia es más conveniente porque no requiere la manipulación de genes.
Varios estudios han reportado la inducción del mesodermo de humano y ratón PSCs en químicamente definición condiciones. Por lo general, estos métodos han dependido de activina/nodal/transformación de factor de crecimiento β (TGFβ) señalización y hueso proteínas morfogenéticas (BMP) de señalización, se cree para llevar a cabo la diferenciación meso-endodermo y mesodermo, dando por resultado una eficacia baja inducción de el paraxial mesodermo (aproximadamente 20%)2. En otras palabras, el mesodermo derivado PSC inducido por estas vías de señalización fue principalmente mesoderm lateral de la placa y no paraxial mesodermo. Recientemente, algunos estudios han demostrado la producción eficiente de mesodermo paraxial PSC derivados basado en diferentes estrategias3,4,5,6,7,8 . En estos estudios, PSC fueron cultivada con concentraciones relativamente altas de cinasa de glicógeno sintasa 3 (GSK3) inhibidores (activadores de señalización de WNT), por lo tanto la eficacia de la inducción del mesodermo paraxial alcanzó el 70%-95%6,7 .
En somitogenesis, el mesodermo paraxial primero forma el mesoderm presomitic (PSM) posteriorly y luego somitas (SMs) en la parte anterior a través de mesénquima en epitelio de transición9,10. Ligando de Notch 1 Delta-like (DLL1) se sabe que tienen un papel fundamental durante la somitogenesis, como control oscilatorio de DLL1 expresión, tanto en nivel de mRNA y proteína, regula segmentación de SM. SMs tiempo subdividen en dos partes, dando lugar al dermomyotome (DM) dorsalmente y sclerotome (SCL) ventralmente11. Posteriormente, la DM se distingue en el dermatome (D), un precursor de la dermis y miotoma (MYO), un precursor del músculo esquelético; Además, una porción ventral del SCL forma syndetome (SYN), un precursor de los tendones y los ligamentos12 (figura 1). Algunos investigadores han reportado la inducción de derivados derivados del PSC SM como MYO4,13 y14de la SCL; sin embargo, existen varias limitaciones en estos estudios. En particular, puesto que nuestro conocimiento de los entornos de señalización de D y SYN es fragmentario, protocolos de inducción para D y SYN no todavía se han sistemáticamente establecidos. Para demostrar la competencia completa de SMs inducida del PSC, es esencial para demostrar la diferenciación múltiple capacidad de SMs inducidos en todos los cuatro derivados (D, MYO, SCL y SYN), mientras que estudios previos se han centrado sólo en específicos derivados de SM. Aquí, Divulgamos sobre cómo generar todos los cuatro derivados SM, incluyendo D y SYN, a través de PSM y SM sinos de iPSCs humana15. Creemos que establecer un método progresivo in vitro modelos el proceso de desarrollo de SM podría contribuir al estudio de SM como humano se desarrolla durante la embriogénesis, sin usar embriones.
Un método bien conocido para la inducción de SM derivados del CPS a través de PSM es la combinación de CHIR99021 + A83-01 (inhibidor de TGFβ) durante la inducción del PSM de PSC, pero no durante el PSM maduración proceso6. En el presente estudio, señalización WNT/beta-catenina se inhibió con C59 para inducir SM de PSM. Sin embargo, introdujo el uso de CHIR99021 para activar la vía de WNT durante la diferenciación de SM. Esta decisión fue hecha basada en el hallazgo que WNTs varios son expresados en los tejidos circundantes de SM y dados el hecho de que reporteros WNT son activos en SM20. Como resultado, observamos epitelización, una característica del SM en vivo, sólo bajo la condición de CHIR99021, basado en la acumulación de CDH11 en ensambladuras de la célula (Figura 2E). Esta observación indica que la implicación crítica de WNT de señalización durante la diferenciación de PSM y epitelización del SM, por lo tanto que nuestro protocolo mejor puede recapitular el ambiente señalización endógeno. Sin embargo, también implica otra posibilidad de ajuste fino de la WNT/beta-catenina vía de señalización durante la diferenciación, debido a robustez y eficiencia de la diferenciación pueden variar significativamente dependiendo de los tipos de células, líneas celulares y varios compuestos químicos de la WNT-inductores utilizados por cada investigador.
Este método también nos permite generar los cuatro SM derivados, MYO, D, SCL y SYN, de iPSCs humana. Nuestros protocolos paso a paso utilizando el MDL pueden ser utilizados para identificar los requisitos de señalización durante el somitogenesis humano/somite patrones y proporcionan penetraciones importantes en desarrollo humano de la SM. Por ejemplo, nuestros métodos podrían ser útiles para el estudio de mecanismos de reloj de segmentación, un sistema de oscilación molecular que regula la formación de SM. Ha sido bien investigado en ratones, pollos y peces cebra, pero no en seres humanos debido a la falta de herramientas experimentales apropiadas.
Además, nuestro método puede ser aplicable a futuro clínicas terapias basadas en células. Por ejemplo, humano D derivados de iPSC o SYN puede trasplantarse en piel severamente dañada o roto los tendones para la regeneración y tratamiento. Sin embargo, varias limitaciones deben ser resueltos antes de que este método puede ser aplicado prácticamente. Aunque en el presente estudio, se utilizaron células de alimentador SNL para iPSC mantenimiento y solución de ECM, que se extrae de lo sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm, como una capa superficial sobre el plato durante la inducción, estos reactivos derivados de animales no humanos deben ser eliminado para mejorar la calidad clínica. Además, celular cantidad y calidad, que incluye la pureza y la maduración de las células deseadas, deben también ser mejorados. Además, no sólo el número de células, sino también la fuerza de la célula es una característica importante para la regeneración del tendón/ligamento. Además, el desarrollo de marcadores de superficie para la purificación y un nuevo método para la reconstitución 3D son indispensables para avanzar en nuestros protocolos clínicos terapias basadas en células.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer Dr. Junya Toguchida (CiRA) por su ayuda con la administración de proyectos y financiación de la adquisición, Sr. Mitsuaki Shibata (CiRA) y Sra. Mei Terashima (CiRA) para la asistencia técnica, el Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) y el Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) su revisión del manuscrito y el Sr. Masaya Todani (CiRA) para proporcionar una ilustración (figura 1). También agradecemos a todos los miembros de los laboratorios de Ikeya y Toguchida (CiRA) por su apoyo durante este estudio. Este trabajo fue financiado por subvenciones para la investigación científica de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) (26670661), el programa de células iPS de insuperable enfermedades investigación utilizando enfermedades específicas de la japonesa de ciencia y tecnología Agencia (JST) y la Agencia de Japón para investigación médica y desarrollo (AMED), el centro de la base para la investigación de células iPS de la red de centros de investigación para la realización de la medicina regenerativa (JST/AMED) y las iPS del fondo de investigación de la célula (en parte a Makoto Ikeya y Junya Toguchida). Makoto Ikeya también fue apoyado por subvenciones para la investigación científica (JSP) (16H 05447) y el programa de aceleración para la investigación de enfermedades utilizando células iPS de enfermedades específicas (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |