Summary
이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.
Abstract
미토파지는 필수 미토콘드리아 품질 관리 경로로, 췌도 베타 세포 바이오에너지가 포도당 자극 인슐린 방출에 연료를 공급하는 데 매우 중요합니다. mitophagy의 평가는 도전적이고 수시로 1 차적인 인간 췌장 섬과 같은 조직 견본에서 쉽게 이용되지 않는 유전 기자 또는 다중 상보적인 기술을 요구합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 인간 적인 췌도에 있는 중요한 내인성 mitophagy 복합물의 대형을 구상하고 정량화하는 강력한 접근을 보여줍니다. 미토파지 조절제 NRDP1 및 USP8의 상호작용을 검출하기 위해 민감한 근접 결찰 분석 기술을 활용하여, 우리는 특히 그(것)들에서 필수적인 미토파지 복합체의 형성을 정량화할 수 있습니다. 전사 인자 PDX1에 대한 역착에 대한 이 접근법을 결합함으로써, 우리는 미토파지 복합체, 특히 베타 세포 내에서 미토파지를 손상시킬 수 있는 요인을 정량화할 수 있다. 우리가 설명하는 방법론은 면역 침전 (IP) 또는 질량 분광법과 같은 다른 단백질 상호 작용 연구에 필요한 다량의 세포 추출물의 필요성을 극복하고 일반적으로 귀중한 인간 췌도 샘플에 이상적입니다. 이러한 접근 방식에 충분한 수량으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법론은 다운스트림 단백질 응용을 위한 이기종 아일렛 집단으로부터 베타 세포를 정화하는 유동 선별 기술의 필요성을 제거합니다. 따라서, 우리는 이기종 및 제한된 세포 집단에서 사용하기 위해 매우 호환되는 미토파기의 시각화를 위한 귀중한 프로토콜을 기술한다.
Introduction
췌장 베타 세포는 정상적인 포도당 항상성을 유지하는 데 필요한 인슐린을 생성하고, 그들의 실패는 모든 형태의 당뇨병의 발달을 초래한다. 베타 세포는 인슐린 방출과 포도당 대사를 결합하는 데 필요한 에너지를 생성하는 강력한 미토콘드리아 용량을 유지합니다. 최근에는 기능성 미토콘드리아 질량의 유지가 최적의 베타 세포 기능1,2,3에중추적인 중요성이 있음이 명백해지고 있다. 기능성 미토콘드리아 질량을 유지하기 위해 베타 세포는 기능 장애, 손상 또는 노화 미토콘드리아4를제거하기 위해 품질 관리 메커니즘에 의존합니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 베타 세포가 설치류와 인간 섬 모두에서 미토콘드리아 품질 관리를 유지하기 위해 미토콘드리아 자가 포식 (또는 미토파지)이라고 불리는 미토콘드리아 회전율의 특수 한 형태에 의존한다는 것을 입증했습니다1. 2,5. 불행하게도, 그러나, 인간 췌장 베타 세포에서, mitophagy, 또는 내인성 발현 된 미토파지 성분을 검출하는 간단한 방법이 없었다.
우리는 최근 베타 세포에서 미토파지의 상류 조절이 E3 리가제 CLEC16A 및 NRDP1 및 듀비퀴티나아제 USP81을 포함하는 단백질 복합체의 형성에 의존한다는 것을 보여주었다. NRDP1과 USP8은 키 미토파지 이니시에이터 PARKIN6,7에대한 조치를 통해 미토파지에 영향을 미치는 것으로 독립적으로 나타났다. NRDP1은 미토파지 6을 끄기 위해 유비퀴틴화및 분해를 위한 PARKIN을 목표로 하고, USP8은 특히 K6-연결된 PARKIN을 미토콘드리아7로전좌화하기 위해 타겟팅합니다. 근접 결찰 분석(PLA) 기술은 단백질 상호작용 생물학분야에서최근 진보되어 왔으며, 단일 세포에서 현장내 내인성 단백질 상호작용의 시각화를 가능하게 하고, 부족한 샘플 물질에 의해 제한되지 않는다. 이 방법론은 특히 인간 췌도/베타 세포 생물학에 대해 특히 유혹적이며, 표본 가용성의 희소성으로 인해 이기종 세포 유형 내에서 생리학적으로 관련된 단백질 복합체를 이해해야 할 필요성과 결합됩니다.
PLA 접근법을 활용하여, 우리는 1차 인간 췌장 베타 세포 및 뉴런 세포주에서 주요 내인성 미토파지 복합체를 관찰할 수 있으며, 미토파지 경로1에대한 당뇨병 환경의 효과를 입증할 수 있다. 요약하자면, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 풍부한 물질이 부족한 조직또는 기존의 단백질 상호작용 연구가 불가능한 조직에서 특정 미토파지 단백질 복합체를 분석하는 것입니다.
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Protocol
비식별 기증자 인간 췌도의 사용은 기관 검토 위원회 (IRB) 면제를 통해 미시간 대학 IRB 정책을 준수합니다. 인간 췌도는 NIH/NIDDK가 후원하는 통합 섬 분배 프로그램(IIDP)에 의해 제공되었습니다.
1. 인간 아일렛 샘플 준비
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단세포 해리
- 배양 인간 아일렛 샘플(4000-6000 췌도 등가물/10 mL 배지)은 췌도 에서 37°C에서 적어도 1일 동안 1mMM글루타민(PIM(G)) 및 100 단위/mL 항미내 항생제, 1 mM나트륨 피바테 및 1mM나트륨 피바테로 보충된 배지(PIM(S))에서 혈청 (FBS) 또는 인간 AB 세럼.
- 배양된 개별 적인 인간 섬을 계산하기 위하여 3배 배율에 해부 광 현미경을 이용하십시오. 아일렛 매체의 1.5 mL 튜브에 관심 치료 /관심 상태 당 40 개의 섬을 선택하십시오.
- 400 x g의 원심분리기 는 10 °C에서 퇴적물까지 1 분 동안.
- 50 μM PR619 (듀비퀴티나아제 억제제; 유비퀴틴 의존단백질 상호 작용을 보존하기 위해)를 함유한 1mL 인산완충식염수(PBS)로 2회, 실온에서 튜브를 간략하게 반전시킴으로써, 각 세척시 400에서 원심분리를 사용하여 시료를 세척합니다. 10 °C에서 1 분 동안 x g.
- 50 μM PR619를 함유하는 트립신 을 함유하는 125 μL의 125 μL로 단일 세포로 디스콘을 해리하여 미리 온난화된 트립신(37°C)을 3분 동안 아일레 펠릿으로 배양하였다. 200 μL 파이펫을 사용하여 주기적인 부드러운 파이펫팅으로 이 시간 동안 섬을 부드럽게 분산시소.
- 트립신을 1 mL 로 데운(37°C) PIM(S) 50 μM PR619를 함유한 다음, 퇴적세포를 400 x g에서 1분 동안 원심분리하여 담금질한다.
- PBS + 50 μM PR619로 1 분, 두 번 400 x g에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.
- 마지막으로, 50 μM PR619를 함유하는 150 μL PBS에서 세포를 재중단한다.
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단세포 부착 및 고정
- 재서스펜션 후, 세포 용액을 10 분 동안 28 x g의 세포 중심 리퓨지를 사용하여 서리가 내린, 충전 된 현미경 슬라이드에 돌십시오.
- 세포원각화 후, 필요한 항체/PLA 용액 부피를 최소화하기 위해 소수성 펜으로 세포 영역을 윤곽을 잡아보세요(재료 표참조). 실온에서 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오.
주의: PFA는 위험하며 주의해서 취급해야 합니다. - 최상의 결과를 얻으려면 즉시 염색/PLA를 사용하거나 24시간 이내에 수행하십시오. 필요한 경우 샘플을 4°C에서 PBS에 보관하여 48시간 이상 염색하지 않습니다.
2. 면역화학
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차단
- 실온에서 5분 동안 1x PBS로 세포를 두 번 세척하십시오.
- 블록 셀 용액은, 배경 염색을 제거하기 위해, 실온에서 1 시간 동안 0.3 % 세제를 함유한 PBS에서 10 % 당나귀 혈청 (재료 표참조).
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얼룩
- USP8 (1:250) 및 NRDP1 (1:250)에 대하여 1 차 마우스 또는 토끼 항체를 가진 배양 세포는 각각 (재료의 표참조) 세제로 인산완충 식염수에 희석 (PBT, 재료표참조), 4 °C에서 하룻밤, PLA를 통해 미토파지 복합 신호를 감지합니다.
- PLA 신호를 방해하지 않도록 마우스 또는 토끼에서 제기되지 않은 베타 세포 식별을 위한 마커를 가진 공동 배양 세포. 이 경우 PBT에서 항 염소 PDX1 (1:500)으로 세포를 배양합니다. 증발을 방지하기 위해 용액 위에 플라스틱 필름을 사용하여 4 °C에서 밤새 모든 1 차 항체를 배양하십시오.
3. 근접 결찰 분석
- PLA 프로브 및 카운터스테인
- 제조업체의 지침에 따라 PLA 프로브 솔루션을 준비합니다( 즉, PBT에서 마우스 및 항토끼 프로브 용액의 최종 농도 1:5 솔루션을 준비하고 실내에서 20분 동안 배양하여 샘플당 20 μL의 프로브 솔루션을 만듭니다.) 온도.
- 하룻밤 배양 후, 로커에 각각 5 분 동안 1 x PBS로 세포를 두 번 씻으하십시오.
- 프로브 용액으로 배양하기 직전에, 프로브 용액에 1:600의 최종 농도에서 항 염소 Cy5 보조를 추가하십시오 (내인성 PDX1 검출용). 각 세포 상태에 20 μL 프로브 용액을 추가하고 플라스틱 필름으로 부드럽게 덮고 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 결찰
- 로커에서 각각 5분 동안 버퍼 A(레시피용 재료 표 참조)로 실온에서 세포를 두 번 세척합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 결찰 용액(검출 시약의 일부, 재료 표참조)을 준비합니다. 이를 위해, 희석 국윤 (5x) 1:5 디에틸 파이로 카보네이트 (DEPC) 처리 된 물. 배양 직전에 0.025 U/mL 리가즈를 추가합니다. 세포에 20 μL 결찰 액을 추가하십시오. 플라스틱 필름으로 덮고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 증폭
- 실온에서 2회 버퍼 A로 셀을 2분 동안 세척합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 증폭 솔루션(검출 시약의 일부, 재료 표 참조)을 확인하십시오. 증폭 완충제(5x)를 DEPC 처리된 물에 1:5로 희석하고 사용할 때까지 어둠 속에서 보관하십시오. 셀에 용액을 추가하기 직전에 용액에 폴리머라제 1:80 희석(검출 시약의 일부, 재료 표 참조)을 추가합니다.
- 세포에 20 μL의 증폭 용액을 추가하십시오. 최대 신호를 위해 플라스틱 필름으로 덮고 37 °C에서 1 시간 40 분에서 2 시간 사이에 어둠 속에서 놓습니다.
- 이미징 준비
- 로커에서 실온에서 10분 동안 버퍼 B로 셀을 두 번 세척합니다(레시피용 재료 표 참조).
- 마지막으로, 로커의 실온에서 2분 동안 0.01x 버퍼 B에 한 번 세척합니다.
- 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 장착 매체의 방울을 추가하고 조심스럽게 형성 된 거품을 눌러 메스 블레이드를 사용하여 샘플 위에 커버 슬립을 배치하여 샘플을 마운트합니다. 가장자리 주위에 명확한 매니큐어를 사용하여 씰 커버립.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경, 또는 디콘볼루션 기능을 갖춘 반전형광 현미경과 같은 여러 초점 평면을 캡처할 수 있는 현미경의 이미지 샘플은 최소 9개의 서로 다른 초점 평면 이미지를 촬영합니다.
- 약 0.45mm z 스택 높이로 100배 배율로 이미지를 캡처합니다. 550 nm 여기, 570 nm 방출에서 PLA를 캡처; 650 nm 여기, 670 nm 방출에서 카운터 얼룩; 및 DAPI에서 405 nm 여기, 450 nm 방출.
- PLA 이벤트(특히 광시야 현미경)의 하류 분석을 위해 형광 이미지 배경 신호및 미광을 최소화하기 위해 2차원 데콘볼루션(가장 가까운 이웃) 알고리즘을 활용하는 프로세스 이미지 선택의 표준 이미지 처리 소프트웨어.
참고 : 올림푸스 는 셀센스를 사용, 니콘은 NIS-Elements를 사용, 라이카는 LAS X를 사용, 자이스 – 젠, 변신, MATLAB, 휴이겐스 소프트웨어, 뿐만 아니라 이미지 J를 통해 사용할 수있는 여러 플러그인. 분석을 위해 모든 z-stacks에 대한 총 상호 작용 수를 Image-J 소프트웨어를 사용하여 분석해야 하며 Pdx-1 양성 세포만 분석되어야 합니다(섹션 3.5).
- PLA 상호 작용정량화
- 무료 Image-J 소프트웨어 응용 프로그램을 열고 PLA 이미지를 엽니다. 첫 번째 선명하게 초점을 맞춘 PLA 이미지부터 시작합니다.
- 이미지 탭을 클릭하고 조정을 선택한 다음 임계값(그림1A)을선택합니다. 임계값을 조정하여 비특이적 PLA 신호를 모두 제거하고, 임계값 조정을 기록하고, 분석 전반에 걸쳐 일관성을 유지하려고 합니다.
- 프로세스 탭을 클릭하고 바이너리를선택한 다음 바이너리(그림 1B)를만듭니다. 이진 이미지를 사용하여 "분석" 탭을클릭하고 입자 분석(그림1C)을눌러 파티클을 측정합니다.
- 분석의 경우 크기 = 0-무한대, 원형 = 0-1.0, 표시 = 윤곽선, 표시 결과에대한 확인란 및 결과 지우기(그림 1D)와같이 설정이 있는지 확인합니다. 확인을클릭합니다. 샘플을 나타내는 스프레드시트에서 분석된 파티클 수와 z 스택 위치를 기록합니다.
- 3.5.2-3.5.4 단계를 반복하여 샘플에 대한 모든 포커스 z 스택을 분석할 때까지 반복합니다. 스프레드시트의 샘플에 대한 총 파티클 수를 합산하여 총 상호 작용 수를 정량화합니다.
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Representative Results
우리는 MIN6 췌장 베타 세포주 및 SH-SY5Y 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 초기 실험을 수행하여 항체의 특이성과 가시화된 단백질 상호작용을 모두 최적화하고 확인하였다. MIN6 세포는 30,000 세포/mL에서 커버슬립에 도금하고 48시간 동안 부착하도록 방치하였고, SH-SY5Y 세포는 15,000 세포/mL에서 커버슬립 상에 도금되고 24시간 동안 부착하도록 방치하였다. PLA 프로토콜은 1.2.3 단계에서 시작하여 위와 같이 수행되었습니다. PLA 신호의 특이성을 보장하기 위해, 우리는 먼저 (i) 1 차 항체가 없는 (그림2A, 그림 3A),(ii) NRDP1 항체 단독 (그림2B, 그림 3B),(iii) USP8 항체 단독 () 없음의 존재에서 이 접근법을 수행하였다. 도 2C, 도 3C,및 (iv) NRDP1 및 USP8 항체 둘 다 (그림2D, 그림 3D). 샘플 설정의 용이성을 위해 표 1은 실험 컨트롤을 올바르게 레이아웃하는 방법을 나타냅니다. 특히, 우리는 단일 1 차 항체또는 1 차적인 항체 통제 조건에서 반점 PLA 신호를 관찰하지 않으며, 따라서 중간 상호 작용이 MIN6 와 둘 다 에 있는 둘 다 1 차적인 항체의 존재에서 NRDP1와 USP8 사이에서 특히 관찰된다는 것을 확인합니다 SH-SY5Y 세포.
우리는 다음 1 차적인 인간 적인 beta 세포 내의 mitophagy 복잡한 상호 작용을 분석하기 위하여 인간 적인 섬과 사용을 위해 이 접근을 적응했습니다. 인간 섬은 알파, 베타, 델타 및 PP 세포를 포함하는 기능적으로 구별되는 세포의 이종 집단으로 구성된다9. 베타 세포가 아일렛 질량의 ~80%를 차지하는 마우스 섬과 달리, 베타 세포는 인간 섬 내에서 비례적으로 더 작은 범위를 포함한다(28-75%)10,11,12. 따라서, 우리는 우리가 베타 세포 내에서 특히 NRDP1-USP8 mitophagy 복합체의 존재를 관찰하고 우리가 다른 아일렛 세포 유형에서 혼란 관찰을 관찰하지 않았음을 보장하기 위해 PLA 기술을 사용하기 위해 노력 (에서 발생할 수있는 아일렛 용해의 공동 면역 침전 연구). 따라서, 단일 세포가 용이하게 구별되고 추가로 분석될 수 있는 수준으로 적절하고 균일한 아일레 분산을 보장하는 것이 중요하다. 도4에서 볼 수 있듯이, 분산 프로토콜(섹션 1)은 다운스트림 분석을 위한 현미경 시야에서 단일 세포를 보장하는 데 매우 효율적입니다. 베타 세포를 확인하기 위해, 우리는 PLA 과정 동안 PDX1 특이적 항 혈청과 공동 염색을 수행했습니다. PDX1은 핵13내의 성숙한 인슐린 생성 베타 세포에서 주로 발견되는 중요한 베타 세포 특이적 전사 인자이다. PDX1 염색은 1차 인간 아일렛에서 NRDP1:USP8 PLA에 이어 유지되었다(그림 4). 중요한 것은, 우리는 PLA (토끼 반대로 NRDP1 및 마우스 반대로 USP8, 각각)를 위해 이용된 1 차적인 항체를 가진 교차 반응성을 피하기 위하여 염소 PDX1 항-세라를 이용했습니다. 따라서, PDX1 카운터스테인의 첨가는 일차 인간 베타 세포 내 내 내인성 미토파지 복합체의 특이적 평가를 허용한다.
이러한 접근법을 활용하여 NRDP1:USP8 미토파지 복합체의 보존에 대한 스냅샷을 컴파일하여 베타 세포 내의 미토파지 경로의 역량을 추론할 수 있습니다. 타입-2 당뇨병14의그들을 모방하는 환경 조건 내의 사용을 위해 이 접근을 확장하기 위하여는, 우리는 glucolipotoxicity를 유도하기 위하여 palmitate와 높은 포도당으로 beta 세포주 및 1 차적인 인간 적인 섬을 취급했습니다. 실제로, 우리는 NRDP1과 USP8의 상호 작용이 PLA에 의한 베타 세포주뿐만 아니라 1 차인간 베타 세포모두에서 팔미테와 높은 포도당에 48시간 노출된 후 감소되었다는 것을 발견하였다(도5 및 참조 1). 이 결과는 당뇨병 자극다음의 주요 내인성 미토파지 요인을 평가하기 위해 이 분석법의 타당성을 강조한다.
그림 1: PLA 상호 작용의 정량화를 위한 이미지 J 분석 워크플로우. 분석의 중요한 단계는 여기에서 강조 표시됩니다. (A) 특정 PLA 신호 분석을 보장하기 위해 이미지 임계값을 조정합니다. (B) 이미지를 이진 데이터로 변환하여 쉽게 정량화할 수 있습니다. (C-D) ImageJ 소프트웨어에서 인식한 입자를 분석하여 분석을 완료하는 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: NRDP1 및 USP8은 췌장 베타 세포에서 특이적 상호작용한다. 마우스 췌장 세포주, MIN6의 고배율(100x) 이미지가 도시된다. (A-D) NRDP1:USP8 상호작용에 대한 PLA 신호는 빨간색으로 표시되고 핵은 DAPI에 의해 파란색으로 묘사됩니다. (A-C) NRDP1:USP8 상호작용에 대한 특이적인 반점신호는 PLA 공정 동안 1차 단백질 항체의 둘 다(A) 또는 둘 다(B, C)가 생략된 경우 볼 수 없다. 그러나, 두 단백질의 상호작용은 두 항체가 모두포함될 때 췌장 베타 세포(D)에서 PLA에 의해 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NRDP1 및 USP8은 특히 신경 아세포종 세포에서 상호작용합니다. 인간 신경아세포종 세포주, SH-SY5Y의 고배율(100x) 이미지가 도시된다. (A-D) NRDP1:USP8 상호작용에 대한 PLA 신호는 빨간색으로 표시되고 핵은 DAPI에 의해 파란색으로 묘사됩니다. (A-C) NRDP1:USP8 상호작용에 대한 특이적인 반점신호는 PLA 공정 동안 1차 단백질 항체의 둘 다(A) 또는 둘 다(B, C)가 생략된 경우 볼 수 없다. 그러나, 두 단백질의 상호작용은두 항체가 모두 포함될 때 PLA(D)에 의해 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 베타 세포 미토파지 복합체는 PLA에 의해 그 자리내의 1차 인간 췌도에서 확인될 수 있다. 분산된 인간 섬의 고배율(100x) 이미지가 표시됩니다. 단일 세포는 DAPI(청색)로 핵 염색에 의해 묘사되고, 베타 세포는 PDX1 염색(magenta)으로 관찰되며, 미토파지 복합체는 베타 세포 및 비베타 세포(적색)에서 모두 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: NRDP1:USP8 미토파지 복합체는 글루콜리포독성에 의해 베타 세포에서 불안정하다.
대조군(25 mM 포도당 + 0.82% BSA) 또는 고당 + 팔미테(25 mM 포도당 + 0.4 mM 팔미테/0.82% BSA)로 48시간 동안 처리된 MIN6 세포의 고배율(100x) 이미지가 도시된다. (A-B) PLA(NRDP1:USP8) 신호는 두 치료 군 모두에서 볼 수 있다. PLA 신호는 대조군(A)과 비교했을 때 글루콜리포독성(B) 후 MIN6 베타 세포에서 감소한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플 | 항체 1 (마우스 안티 NRDP1) | 항체 2 (토끼 항 USP8) | 항체 3 (염소 안티 PDX1) (옵션 카운터스테인) |
| 제어 1: 원발성 항체 없음(40개 섬) | - | - | + |
| 제어 2: NRDP1 단독 (40 아일렛) | + | - | + |
| 제어 3: USP8 단독 (40 섬) | - | + | + |
| 실험 1-x: 모든 실험 조건(각 40개의 섬) | + | + | + |
표 1: 샘플 실험 설계 설정.
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Discussion
여기에서 우리는 상류 mitophagy 복합물의 대형을 정량화하기 위하여 관심 있는 조직/세포에 NRDP1:USP8 PLA를 사용하는 간단하고 능률적인 접근을 기술합니다. 우리는 이전에 공동 면역 침전 실험, 무세포 상호 작용 연구 및 시험관 내 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 몇몇 방법론에 의해 췌장 베타 세포에 있는 CLEC16A-NRDP1-USP8 미토파지 복합체의 대형을 확인했습니다 유비퀴틴 화 검사, 이 복잡한 드라이브가 미토파기플럭스 1,15를조절하는 방법을 입증했다. 우리가 보고하고 여기에서 기술하는 PLA 연구 결과는 1 차적인 인간 적인 beta 세포에 높게 적응할 수 있는 mitophagy 통로의 급속한, 양적 및 세포 특정 보기를 허용합니다. 추가적으로, 우리는 NRDP1:USP8 PLA가 SH-SY5Y 신경 아세포종 세포에 있는 beta 세포 생물학의 외부 사용을 위해 적응될 수 있다는 것을 보여주었습니다, 신경 시스템에 있는 mitophagy 복합체를 또한 감시하기 위하여 이 기술의 잠재적인 타당성을 강조하.
PLA는 간단한 접근 방식입니다. 그러나 프로토콜 내의 특정 단계는 명확하고 구체적인 결과를 보장하기 위해 가장 중요합니다. 여기에는 (1) 인간 섬에 대한 분산 절차가 이미지를 최적화하기 위해 세포 용해/손상을 방지할 수 있을 정도로 온화하게 보장하고, (2) 듀비퀴티나제 억제제, PR619를 첨가하여, 고정 직전 및 세차 시 PLA에 의한 최대 신호 관찰을 위한 NRDP1-USP8 복합체의 유비퀴틴화 상태(및 이에 따라 구속력) 및 (3) ImageJ에 의한 PLA 이벤트의 객관적인 정량화는 미토파지 복합체의 편견 평가를 보장하고 또한 mitophagy의 변화가 완전하지 않을 수 있지만 여전히 통계적으로 유의 / 생물학적으로 관련이있는 조건.
인간 적인 작은 일 연구 결과 내의 잘 알려진 도전은 베타 세포와 비 베타 세포 둘 다의 이기종 인구에 대 한 관심사. PDX1 카운터스테인의 우리의 사용은 베타 세포 내의 mitophagy 복합체 형성의 평가를 허용합니다 (뿐만 아니라 PDX1 부정적인 비 베타 세포). PDX1을 카운터스테인으로 활용하는 한 가지 잠재적 관심사는 췌장 델타 세포16,17,18에서의발현이며, 베타 세포보다 훨씬 낮은 정도이기는 하지만, 다른 마커(즉, NKX6.1)를 사용할 수 있었다. 대상 베타 세포보다 구체적으로. 세포원각 분리 및 고정 직전에 온전한 섬을 단일 세포로 분산시킴으로써, 우리는 또한 약물 치료 및/ 또는 약물 치료 과정에서 섬 미세 환경의 최소한의 중단으로 단일 세포 미토파지 연구를 수행 할 수 있습니다. 글루콜리포독성 노출. 그러나, 우리는 아일렛 분산이 관련 처리의 독립적으로 세포 내의 mitophagic 복합체를 방해할 수 있는 가능성을 배제할 수 없습니다.
더 전통적인 단백질 단백질 상호 작용 연구 결과는 공동 면역 침전 및/또는 단백질 성 접근법과 같은 인간 췌도에서 채택될 수 있는 동안, 이 절차는 일반적으로 도전을 증명할 수 있는 섬 용해의 다량을 요구합니다 사용 가능한 인간 아일렛 재료의 희소성을 감안할 때. 추가적으로, 이러한 전통적인 기술 도중 세포 형 특이성의 관심사는 더 명백해지거나 순수한 베타 세포 집단을 분류하기 위하여 유세포 분석 방법의 추가 최적화를 요구합니다19,20, 21,22. 따라서, 우리의 PLA 접근법은 인간 베타 세포에서 의 미토파지 통로의 단백질-단백질 상호작용 연구를 위한 매력적이고 실용적인 대안을 제공한다. 특히, 수천 개의 개별 베타 세포에서 미토파지 복합체 형성을 정량화하기 위해 실험당 총 섬/조건을 40개만 사용하는 기능을 통해 섬 연구자들은 다른 평가를 위해 섬 준비를 보존할 수 있습니다. 동일한 기증자.
NRDP1 및 USP8이 유비쿼터스로 발현되기 때문에, 우리는 이 기술이 베타 세포를 넘어 세포 유형에서 미토파기의 평가를 위한 가치를 가질 수 있다고 추측한다. 가능성은 그밖 아일렛 세포 모형 (알파 세포 또는 델타 세포를 위한 관련 카운터스테인으로) 또는 신경과 같은 mitophagy에 무겁게 의존하는 세포 모형을 포함합니다. 이를 위해, SH-SY5Y 신경아세포종 세포(도 2) 또는PDX1 음성 아일렛 세포(도 4)에 대한 이 기술의 전달성에 대한 우리의 관찰은 다른 세포 유형에서 의 미토파지 경로에 대한 당사의 기술의 유용성을 시사할 수 있다.
NRDP1:USP8 PLA 접근법의 용이성과 단순성에도 불구하고 이 분석의 결과를 혼동할 수 있는 과제가 있습니다. PLA는 매우 근접한 (40 nm)에서 단백질 단백질 상호 작용을 확인할 수 있지만, 특정 실험 조건이 NRDP1-USP8 근접성을 유지할 수 있는 가능성을 배제하지 않습니다. PLA 접근법. 또한, NRDP1:USP8 복합체 형성이 췌장 베타 세포에서 정식 CLEC16A/PARKIN-mitophagy 통로에 대한 유효한 판독임을 입증했지만, 최근 연구는 미토콘드리아에서 PARKIN 독립적 인 미토파기의 역할을 관찰했습니다. 품질 관리23,24. 우리는 NRDP1 : USP8 복잡한 형성이 PARKIN 독립적 인 미토파기의 붕괴에 의해 어떻게 변형되는지 아직 알지 못합니다. 따라서, 베타 세포에서 mitophagy를 분석하기 위해 여기에 기술된 것 이상으로 보완적인 접근법을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 마지막으로, 이러한 미토파지 복합체의 안정성은 성분 단백질의 유비퀴틴화에 의존하며, 광범위한 스펙트럼의 듀비퀴타아제 억제제 PR619를 첨가하는 것이 시료 제제 동안 유비퀴틴화를 유지하는 데 중요하다. 다시, NRDP1-USP8 복합체의 성분의 유비쿼터스를 간접적으로 방해할 수 있는 베타 세포의 조작은 NRDP1:USP8을 미토파지 복합체 형성을 위한 판독으로 분석할 때 고려될 필요가 있다.
베타 세포 기능뿐만 아니라 다른 고대사 세포 유형에서도 미토콘드리아 품질 관리의 역할이 점점 더 인정됨에 따라, 미토파지의 엄격한 평가는 더 빠른 것을 원하는 그룹에 도전적이고 시간이 소요된다는 것을 증명할 수 있습니다. 중요한 미토파지 성분의 평가. 우리가 설명하는 PLA 접근법은 소량의 인간 적인 작은 이슬기 견본에 있는 단세포 해결책을 가진 mitophagy 복합체 대형의 정량적인 분석을 제공할 수 있고 광범위하게 적용될 수 있는 상대적으로 저비용, 분자 수준 시각화 기술입니다 다양한 세포 유형, 치료 또는 질병 상태에 영향을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 JDRF (CDA-2016-189 및 SRA-2018-539), 당뇨병 및 소화 및 신장 질환의 국립 연구소, 건강의 국립 연구소 (R01-DK-108921), Brehm 가족, 앤서니 가족의 자금 지원을 인정합니다. JDRF 커리어 개발 어워드는 노보 노디스크 재단이 지원하는 덴마크 당뇨병 아카데미의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
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