Summary
Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur quantitativen Analyse der Mitophagie-Protein-Komplexbildung speziell in Beta-Zellen aus primären menschlichen Ischenproben. Diese Technik ermöglicht somit die Analyse der Mitophagie aus begrenztem biologischem Material, die in wertvollen menschlichen Betazellproben der Bauchspeicheldrüse entscheidend sind.
Abstract
Mitophagie ist ein wesentlicher mitochondrialer Qualitätskontrollweg, der für die Betazell-Bioenergetik der Pankreas-Islet entscheidend ist, um die Glukose-stimulierte Insulinfreisetzung zu fördern. Die Bewertung der Mitophagie ist eine Herausforderung und erfordert oft genetische Reporter oder mehrere komplementäre Techniken, die nicht leicht in Gewebeproben verwendet werden können, wie z. B. primäre menschliche Pankreasinseln. Hier zeigen wir einen robusten Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Bildung von wichtigen endogenen Mitophagiekomplexen in primären menschlichen Pankreasinseln. Mit der empfindlichen Näherungsligations-Assay-Technik zur Erkennung der Wechselwirkung der Mitophagieregler NRDP1 und USP8 sind wir in der Lage, die Bildung wesentlicher Mitophagiekomplexe vor Ort gezielt zu quantifizieren. Durch die Kopplung dieses Ansatzes zur Gegenfärbung des Transkriptionsfaktors PDX1 können wir Mitophagiekomplexe und die Faktoren quantifizieren, die die Mitophagie beeinträchtigen können, insbesondere innerhalb von Betazellen. Die von uns beschriebene Methodik überwindet den Bedarf an großen Mengen zellulärer Extrakte, die für andere Protein-Protein-Interaktionsstudien wie Immunpräzipitation (IP) oder Massenspektrometrie erforderlich sind, und ist ideal für wertvolle menschliche Isletproben, die in der Regel nicht in ausreichenden Mengen für diese Ansätze zur Verfügung. Darüber hinaus entfällt diese Methode die Notwendigkeit von Strömungsssierungstechniken, um Betazellen aus einer heterogenen Isletpopulation für nachgelagerte Proteinanwendungen zu reinigen. So beschreiben wir ein wertvolles Protokoll zur Visualisierung von Mitophagie, die für den Einsatz in heterogenen und begrenzten Zellpopulationen hochkompatibel ist.
Introduction
Pankreas-Betazellen produzieren das Insulin, das erforderlich ist, um eine normale Glukosehomöostase aufrechtzuerhalten, und ihr Versagen führt zur Entwicklung aller Formen von Diabetes. Beta-Zellen behalten eine robuste mitochondriale Fähigkeit, die Energie zu erzeugen, die erforderlich ist, um den Glukosestoffwechsel mit der Insulinfreisetzung zu koppeln. Kürzlich hat sich gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der funktionellen mitochondrialen Masse von zentraler Bedeutung für die optimale Beta-Zellfunktion1,2,3ist. Um die funktionelle mitochondriale Masse aufrechtzuerhalten, verlassen sich Betazellen auf Qualitätskontrollmechanismen, um dysfunktionale, beschädigte oder alternde Mitochondrien zu entfernen4. Wir und andere haben zuvor gezeigt, dass Betazellen auf einer spezialisierten Form des mitochondrialen Umsatzes, genannt mitochondriale Autophagie (oder Mitophagie), beruhen, um die mitochondriale Qualitätskontrolle sowohl bei Nagetieren als auch bei menschlichen Inseln aufrecht zu erhalten1, 2,5. Leider gab es jedoch keine einfache Methode, um Mitophagie oder endogen exprimierte Mitophagiekomponenten in menschlichen Pankreas-Betazellen zu erkennen.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die vorgelagerte Regulierung der Mitophagie in Betazellen auf der Bildung eines Proteinkomplexes beruht, der die E3-Ligase CLEC16A und NRDP1 und die Deubiquitinase USP81umfasst. NRDP1 und USP8 haben unabhängig gezeigt, mitophagie durch Maßnahmen auf den wichtigsten Mitophagie-Initiator PARKIN6,7beeinflussen. NRDP1 zielt auf PARKIN für Ubiquitination und Abbau, um Mitophagie6abzuschalten, und USP8 deubiquitiniert speziell K6-verknüpfte PARKIN, um seine Translokation zu Mitochondrien zu fördern7. Die Proximity Ligation Assay (PLA)-Technologie ist seit kurzem ein Fortschritt auf dem Gebiet der Proteininteraktionsbiologie8, die die Visualisierung endogener Proteininteraktionen in situ in einzelnen Zellen ermöglicht und nicht durch knappes Probenmaterial begrenzt wird. Diese Methode ist besonders verlockend für die menschliche Islet/Beta-Zellbiologie, aufgrund der geringen Verfügbarkeit von Proben, gekoppelt an die Notwendigkeit, physiologisch relevante Proteinkomplexe innerhalb heterogener Zelltypen zu verstehen.
Mit Dem PLA-Ansatz sind wir in der Lage, wichtige endogene Mitophagie-Komplexe in primären menschlichen Pankreas-Beta-Zellen und neuronalen Zelllinien zu beobachten und die Auswirkungen einer diabetogenen Umgebung auf den Mitophagieweg1zu demonstrieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das übergeordnete Ziel dieses Protokolls darin besteht, spezifische Mitophagie-Proteinkomplexe in Geweben zu analysieren, die kein reichlichvorhandenes Material haben oder bei denen herkömmliche Protein-Interaktionsstudien nicht möglich sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Verwendung von nicht identifizierten spenderhumanen Pankreasinseln erfolgt über eine Ausnahmedesweise des Institutional Review Board (IRB) und in Übereinstimmung mit der IRB-Richtlinie der University of Michigan. Menschliche Pankreasinseln wurden vom von NIH/NIDDK gesponserten Integrated Islet Distribution Program (IIDP) bereitgestellt.
1. Humane Insel Probenvorbereitung
-
Einzelzelldissoziation
- Kultur menschliche Islet-Proben (4000–6000 Islet-Äquivalente/10 ml Medien) für mindestens 1 Tag bei 37 °C in Pankreas-Islet-Medien (PIM(S)-Medien, ergänzt mit 1 mM Glutamin (PIM(G)), 100 Einheiten/ml Antimykotiktik-Antibiotikum, 1 mM Natriumpyruvat und 10 % fetalem Rinder Serum (FBS) oder menschliches AB-Serum.
- Verwenden Sie ein Sezierlichtmikroskop bei 3-facher Vergrößerung, um einzelne menschliche Inselchen aus der Kultur zu zählen. Pick 40 Inselchen pro Behandlung/Bedingung von Interesse (wie Glucolipotoxizität) in 1,5 ml Röhren in Inselmedien.
- Zentrifugeninseln bei 400 x g für 1 min bei 10 °C zu Sedimenten.
- Waschen Sie Proben, durch kurze Inversion von Röhrchen bei Raumtemperatur, zweimal mit 1 ml Phosphat gepufferter Saline (PBS) mit 50 M PR619 (ein Deubiquitinase-Inhibitor; zur Erhaltung der Ubiquitin-abhängigen Proteinwechselwirkungen), mit Zentrifugation zwischen jeder Wäsche bei 400 x g für 1 min bei 10 °C.
- Dissoziieren Sie Inselchen in Einzelzellen mit 125 l von 0,25% Trypsin, die 50 'M PR619 enthalten, indem Sie vorgewärmtes Trypsin (37 °C) für 3 min mit Inselpellets inkubieren. In dieser Zeit werden die Inselchen mit einer 200-L-Pipette sanft verteilt.
- Das Trypsin mit 1 ml erwärmtem (37 °C) PIM(S)-Medien, das 50 'M PR619 enthält, dann Sedimentzellen durch Zentrifugieren bei 400 x g für 1 min.
- Waschen Sie Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 1 min, zweimal, mit PBS + 50 m PR619.
- Schließlich können Sie Die Zellen in 150 L PBS, die 50 M PR619 enthalten, wieder aussetzen.
-
Einzelzellige Haftung und Fixierung
- Nach der Resuspension drehen Sie die Zelllösung mit einer Zytozentrifuge bei 28 x g für 10 min auf gefrostete, aufgeladene Mikroskopdias.
- Um die benötigten Antikörper-/PLA-Lösungsvolumina zu minimieren, um nach der Zytozentrifugation den zellulären Bereich mit einem hydrophoben Pen (siehe Materialtabelle)zu skizzieren. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.
VORSICHT: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden. - Um optimale Ergebnisse zu erzielen, führen Sie färbung/PLA sofort oder innerhalb von 24 h durch. Falls erforderlich, Proben in PBS bei 4 °C bis zur Färbung nicht länger als 48 h lagern.
2. Immunhistochemie
-
Blockieren
- Waschen Sie Zellen zweimal mit 1x PBS für 5 min bei Raumtemperatur.
- Blockzelllösung, um Hintergrundfärbung zu beseitigen, mit 10% Eselserum in PBS, das 0,3% Reinigungsmittel enthält (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.
-
Färbung
- Inkubieren Sie Zellen mit primären Maus- oder Kaninchenantikörpern gegen USP8 (1:250) bzw. NRDP1 (1:250) (siehe Materialtabelle), die in Phosphat gepufferter Saline mit Waschmittel (PBT, siehe Materialtabelle)verdünnt sind, bei 4 °C über Nacht Mitophagie-Komplexe Signalisierung über PLA zu erkennen.
- Ko-Inkubationszellen mit einem Marker, der speziell für die Betazellidentifikation spezifisch ist und nicht bei Maus oder Kaninchen angehoben wurde, um das PLA-Signal nicht zu stören. In diesem Fall brüten Zellen mit Anti-Ziegen PDX1 (1:500) in PBT. Inkubieren Sie alle primär Antikörper über Nacht bei 4 °C, mit Kunststofffolie auf der Oberseite der Lösung, um Verdunstung zu verhindern.
3. Proximity Ligation Assay
- PLA-Sonde und Gegenfleck
- Bereiten Sie die PLA-Sondenlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, d. h. stellen Sie 20 L Sondenlösung pro Probe her, indem Sie eine Endkonzentration von 1:5-Lösung der Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Sonde-Lösung in PBT vorbereiten und 20 min im Raum brüten. temperatur.
- Nach der nächtlichen Inkubation zweimal mit 1x PBS für jeweils 5 min auf einer Wippe waschen.
- Kurz vor der Inkubation mit Sondenlösung, fügen Sie Anti-Ziege Cy5 sekundär bei einer Endkonzentration von 1:600 der Sondenlösung hinzu (zum Nachweis von endogenem PDX1). Fügen Sie jeder Zellbedingung eine 20-L-Sondenlösung hinzu, decken Sie sie vorsichtig mit Kunststofffolie ab und brüten bei 37 °C für 1 h.
- Verbindung
- Waschen Sie Zellen zweimal, bei Raumtemperatur, mit Puffer A (siehe Tabelle der Materialien für das Rezept) für jeweils 5 min, auf einer Wippe.
- Bereiten Sie ligation Lösung (Teil der Detektionsreagenzien, siehe Tabelle der Materialien) nach Herstelleranweisungen. Dazu verdünnt Ligationsbestand (5x) 1:5 in diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser. Unmittelbar vor der Inkubation 0,025 U/ml Ligase hinzufügen. Fügen Sie den Zellen eine Ligationslösung von 20 L hinzu. Mit Kunststofffolie abdecken und bei 37 °C 30 min inkubieren.
- erläuterungen
- Waschen Sie Zellen zweimal bei Raumtemperatur mit Puffer A für jeweils 2 min.
- Erstellen Sie eine Amplifikationslösung (Teil der Nachweisreagenzien, siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Amplifikationspuffer (5x) 1:5 in DEPC-behandeltem Wasser verdünnen und bis zur Anwendung im Dunkeln halten. Fügen Sie der Lösung unmittelbar vor dem Hinzufügen der Lösung zu den Zellen eine Verdünnung der Polymerase (Teil der Nachweisreagenzien, siehe Materialtabelle) hinzu.
- Fügen Sie den Zellen eine Ampl-Verstärkungslösung hinzu. Mit Kunststofffolie abdecken und bei 37 °C für 1 h 40 min bis 2 h für maximales Signal in die Dunkelheit stellen.
- Vorbereitung auf die Bildgebung
- Waschen Sie Zellen zweimal mit Puffer B (siehe Tabelle der Materialien für Rezept) für 10 min bei Raumtemperatur, auf einer Wippe.
- Schließlich waschen Zellen einmal in 0.01x Puffer B, für 2 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe.
- Montieren Sie Proben, indem Sie einen Tropfen Montagemedien hinzufügen, die 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) enthalten, und legen Sie sorgfältig einen Coverslip über die Proben, indem Sie eine Skalpellklinge verwenden, um die gebildeten Blasen herauszupressen. Versiegeln Sie Abdeckungen mit klarem Nagellack an den Rändern.
- Bildproben auf einem Mikroskop, das in der Lage ist, mehrere Fokale-Ebenen zu erfassen, wie z. B. ein konfokales Laserscanning-Mikroskop oder ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit Dekonvolution-Fähigkeiten, wobei mindestens 9 verschiedene Fokale-Ebenenbilder aufgenommen werden.
- Erfassen Sie Bilder mit 100-facher Vergrößerung mit ca. 0,45 mm Z-Stack-Höhe. Erfassen Sie PLA bei 550 nm Anregung, 570 nm Emission; Gegenfleck bei 650 nm Anregung, 670 nm Emission; und DAPI bei 405 nm Anregung, 450 nm Emission.
- Um sicherzustellen, dass Fluoreszenzbild-Hintergrundsignale und Streulicht für die nachgelagerte Analyse von PLA-Ereignissen (insbesondere auf Weitfeldmikroskopen) minimiert werden, werden Prozessbilder unter Verwendung eines zweidimensionalen Dekonvolutionalgorithmus (nächster Nachbar) Standard-Bildverarbeitungssoftware der Wahl.
HINWEIS: Für Olympus verwenden CellSens, Nikon verwenden NIS-Elemente, Leica verwenden LAS X, Zeiss – ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, sowie mehrere Plugins über Image-J verfügbar. Für die Analyse sollte die Gesamtzahl der Interaktionen über alle Z-Stacks mit der Image-J-Software analysiert werden, um sicherzustellen, dass nur Pdx-1-positive Zellen analysiert werden (Abschnitt 3.5).
- Quantifizierung von PLA-Interaktionen
- Öffnen Sie die kostenlose Image-J-Softwareanwendung, und öffnen Sie das PLA-Image. Beginnen Sie mit dem ersten stark fokussierten PLA-Bild.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Bild, und wählen Sie anpassenaus , dann den Schwellenwert (Abbildung 1A). Passen Sie den Schwellenwert an, um alle nicht spezifischen PLA-Signale zu entfernen, notieren Sie sich die Schwellenwertanpassung und versuchen Sie, sie während der gesamten Analyse konsistent zu halten.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Prozess, und wählen Sie binäraus, und erstellen Sie dann binäre (Abbildung 1B). Verwenden Sie das binäre Bild, umPartikel zu messen, indem Sie auf die Registerkarte "Analysieren" klicken und analysieren dein Analyseteilchen drücken (Abbildung 1C).
- Stellen Sie für die Analyse sicher, dass die Einstellungen wie folgt lauten: Größe = 0 –Unendlichkeit, Zirkularität = 0–1,0, Anzeigen = Umrisse, Kontrollkästchen für Anzeigeergebnisseund Ergebnisse löschen (Abbildung 1D). Klicken Sie auf OK. Beachten Sie die Anzahl der Partikel, die in einer Kalkulationstabelle analysiert wurden, die die Probe angibt, und die Z-Stack-Position.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5.2–3.5.4, bis alle in Fokus-Z-Stacks für die Probe analysiert wurden. Summiert die Gesamtzahl der Partikel für die Probe in der Kalkulationstabelle, um die Gesamtzahl der Wechselwirkungen zu quantifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir führten erste Experimente in der MIN6-Pankreas-Beta-Zelllinie und der SH-SY5Y-Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y durch, um sowohl die Spezifität der Antikörper als auch die visualisierten Proteinwechselwirkungen zu optimieren und zu bestätigen. MIN6-Zellen wurden mit 30.000 Zellen/ml auf Deckscheiben plattiert und für 48 h, SH-SY5Y-Zellen auf Abdeckungen mit 15.000 Zellen/ml plattiert und für 24 h haften gelassen. Das PLA-Protokoll wurde dann wie oben gefolgt, beginnend mit Schritt 1.2.3. Um die Spezifität der PLA-Signale zu gewährleisten, haben wir diesen Ansatz zunächst in Gegenwart von (i) keinem primären Antikörper durchgeführt (Abbildung 2A, Abbildung 3A), (ii) NRDP1-Antikörper allein (Abbildung 2B, Abbildung 3B), (iii) USP8-Antikörper allein ( Abbildung 2C, Abbildung 3C) und (iv) sowohl NRDP1- als auch USP8-Antikörper (Abbildung 2D, Abbildung 3D). Zur Vereinfachung der Stichprobeneinrichtung gibt Tabelle 1 an, wie experimentelle Steuerelemente ordnungsgemäß gestaltet werden. Insbesondere beobachten wir kein punktiertes PLA-Signal in einzelnen primären Antikörpern oder keine primären Antikörperkontrollbedingungen, wodurch bestätigt wird, dass In-situ-Wechselwirkungen zwischen NRDP1 und USP8 in Gegenwart beider Primärantikörper sowohl in MIN6 als auch SH-SY5Y-Zellen.
Als nächstes haben wir diesen Ansatz für die Verwendung mit menschlichen Inseln angepasst, um komplexe Wechselwirkungen mit ophagie speziell innerhalb primärer menschlicher Betazellen zu analysieren. Menschliche Inselchen bestehen aus einer heterogenen Population von funktional unterschiedlichen Zellen, einschließlich Alpha-, Beta-, Delta- und PP-Zellen9. Im Gegensatz zu Mausinseln, bei denen Betazellen 80 % der Inselmasse ausmachen, bilden Betazellen einen proportional kleineren Bereich innerhalb menschlicher Inselchen (zwischen 28-75%)10,11,12. Daher haben wir versucht, die PLA-Technologie zu verwenden, um das Vorhandensein von MITophagie-Komplexen NRDP1-USP8 speziell in Beta-Zellen zu beobachten und sicherzustellen, dass wir keine verwirrenden Beobachtungen anderer Isletzelltypen beobachteten (die von Co-Immunpräzipitationsstudien von Isletlysaten). Daher ist es wichtig, eine angemessene und gleichmäßige Isletdispersion auf ein solches Niveau zu gewährleisten, dass einzelne Zellen leicht diskriminiert und weiter analysiert werden können. Wie in Abbildung 4dargestellt, ist das Dispersionsprotokoll (Abschnitt 1) hocheffizient, um einzelne Zellen im Mikroskopfeld für die nachgelagerte Analyse sicherzustellen. Um Beta-Zellen zu identifizieren, führten wir während des PLA-Prozesses eine Co-Färbung mit PDX1-spezifischen Anti-Seren durch. PDX1 ist ein lebenswichtiger betazellspezifischer Transkriptionsfaktor, der in reifen Insulin produzierenden Betazellen hauptsächlich innerhalb des Zellkerns gefunden wird13. PDX1 Färbung wurde nach NRDP1:USP8 PLA in primären menschlichen Inselchen beibehalten (Abbildung 4). Wichtig ist, dass wir Ziege PDX1 Anti-Sera verwendet haben, um Kreuzreaktivität mit primären Antikörpern zu vermeiden, die für PLA verwendet werden (Kaninchen anti-NRDP1 bzw. Maus-Anti-USP8). So ermöglicht die Zugabe von PDX1-Gegenfärbung die spezifische Bewertung endogener Mitophagiekomplexe in primären menschlichen Betazellen.
Mit diesen Ansätzen können wir eine Momentaufnahme der Retention des MITophagie-Komplexes NRDP1:USP8 zusammenstellen, um die Kompetenz des Mitophagiewegs innerhalb von Betazellen abzuleiten. Um diesen Ansatz für den Einsatz unter Umweltbedingungen zu erweitern, die denen von Typ-2-Diabetes14emulieren, behandelten wir Beta-Zelllinien und primäre menschliche Inseln mit Palmitat und hoher Glukose, um Glukolipotoxizität zu induzieren. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die Wechselwirkung von NRDP1 und USP8 nach einer 48-h-Exposition gegenüber Palmitat und hoher Glukose in beiden Beta-Zelllinien sowie primären menschlichen Beta-Zellen durch PLA verringert wurde (Abbildung 5 und Referenz1). Dieses Ergebnis unterstreicht die Durchführbarkeit dieses Assays zur Bewertung wichtiger endogener Mitophagiefaktoren nach diabetoogenen Reizen.
Abbildung 1: Workflow der Bild-J-Analyse zur Quantifizierung von PLA-Interaktionen. Die wichtigen Analyseschritte werden hier hervorgehoben. (A) Anpassung des Bildschwellenwerts, um eine spezifische PLA-Signalanalyse zu gewährleisten. (B) Konvertierung von Bild in Binärdaten, um eine einfache Quantifizierung zu ermöglichen. (C-D) Wie man die Analyse durch die Analyse der von der ImageJ-Software erkannten Partikel finalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: NRDP1 und USP8 interagieren gezielt in Betazellen der Bauchspeicheldrüse. Es werden Bilder der Maus-Pankreaszelllinie MIN6 mit hoher Vergrößerung (100x) angezeigt. (A-D) DAS PLA-Signal für die INTERAKTION NRDP1:USP8 ist rot dargestellt, und Die Kerne werden durch DAPI blau abgegrenzt. (A-C) Es wird kein spezifisches Punktatsignal für die NDP1:USP8-Interaktion gesehen, wenn sowohl (A) noch ein (B, C) der primären Proteinantikörper während des PLA-Prozesses weggelassen werden. Die Wechselwirkung beider Proteine ist jedoch durch PLA in Pankreas-Betazellen (D) sichtbar, wenn beide Antikörper enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: NRDP1 und USP8 interagieren gezielt in Neuroblastomzellen. Gezeigt werden Bilder der menschlichen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y. (A-D) DAS PLA-Signal für die INTERAKTION NRDP1:USP8 ist rot dargestellt, und Die Kerne werden durch DAPI blau abgegrenzt. (A-C) Es wird kein spezifisches Punktatsignal für die NDP1:USP8-Interaktion gesehen, wenn sowohl (A) noch ein (B, C) der primären Proteinantikörper während des PLA-Prozesses weggelassen werden. Die Wechselwirkung beider Proteine ist jedoch durch PLA (D) sichtbar, wenn beide Antikörper enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beta-Zell-Mitophagie-Komplexe können in primären menschlichen Pankreasinseln in situ durch PLA identifiziert werden. Es werden Bilder mit hoher Vergrößerung (100x) von zerstreuten menschlichen Inselchen gezeigt. Einzelne Zellen werden durch kernnukleare Färbung mit DAPI (blau) abgegrenzt, Betazellen werden mit PDX1-Färbung (Magenta) beobachtet und Mitophagie-Komplexe können sowohl in Beta-Zellen als auch in Nicht-Beta-Zellen (rot) beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Der MITophagie-Komplex NRDP1:USP8 wird in Betazellen durch Glukolipotoxizität destabilisiert.
Gezeigt werden Aufnahmen mit hoher Vergrößerung (100x) von MIN6-Zellen, die für 48 h behandelt wurden, entweder mit Kontrolle (25 mM Glukose + 0,82% BSA) oder hoher Glukose + Palmitat (25 mM Glukose + 0,4 mM Palmitat/0,82% BSA). (A-B) PLA (NRDP1:USP8) Signal ist in beiden Behandlungsgruppen zu sehen. PLA-Signal nimmt in MIN6 Beta-Zellen nach Glucolipotoxizität (B) im Vergleich zu Kontrollen (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| probe | ANTIBODY 1 (Maus anti-NRDP1) | ANTIBODY 2 (Kaninchen anti-USP8) | ANTIBODY 3 (Ziegenanti-PDX1) (Optionaler Gegenfleck) |
| KONTROLLE 1: Kein Primärantikörper (40 Inselchen) | - | - | + |
| KONTROLLE 2: NRDP1 allein (40 Inseln) | + | - | + |
| KONTROLLE 3: USP8 allein (40 Inseln) | - | + | + |
| EXPERIMENTAL 1-x: alle experimentellen Bedingungen (je 40 Inselchen) | + | + | + |
Tabelle 1: Beispiel für experimentelle Sprossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir einen einfachen und effizienten Ansatz zur Verwendung von NRDP1:USP8 PLA in Geweben/Zellen von Interesse, um die Bildung von vorgelagerten Mitophagie-Komplexen zu quantifizieren. Zuvor haben wir die Bildung des Mitophagiekomplexes CLEC16A-NRDP1-USP8 in pankreatischen Betazellen durch verschiedene Methoden bestätigt, darunter Co-Immunpräzipitationsexperimente, zellfreie Interaktionsstudien und in vitro sowie zellbasierte Ubiquitinationstests und demonstrierte, wie dieser Komplex regulierten mitophagischen Fluss1,15. Die PLA-Studien, über die wir hier berichten und beschreiben, ermöglichen eine schnelle, quantitative und zellspezifische Sicht des Mitophagie-Signalwegs, der stark an primäre menschliche Betazellen angepasst werden kann. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass NRDP1:USP8 PLA für den Einsatz außerhalb der Beta-Zellbiologie in SH-SY5Y Neuroblastom-Zellen angepasst werden kann, was die mögliche Durchführbarkeit dieser Technik zur Überwachung von Mitophagiekomplexen in neuronalen Systemen hervorhebt.
PLA ist ein einfacher Ansatz; bestimmte Schritte innerhalb des Protokolls sind jedoch von größter Bedeutung, um klare und spezifische Ergebnisse zu gewährleisten. Dazu gehören: (1) die Gewährleistung eines milden Dispersionsverfahrens für menschliche Inselchen, um Zelllyse/Schädigung zur Bildoptimierung zu verhindern, (2) Zugabe des Deubiquitinase-Inhibitors PR619 unmittelbar vor der Fixierung und während der Wäbungen zur Erhaltung der Ubiquitinationszustand (und damit verbindlich) des NRDP1-USP8-Komplexes für maximale Signalbeobachtung durch PLA und (3) die objektive Quantifizierung von PLA-Ereignissen durch ImageJ, um eine unvoreingenommene Bewertung von Mitophagiekomplexen zu gewährleisten und auch die Bestimmung Bedingungen, unter denen die Änderungen der Mitophagie möglicherweise nicht vollständig, aber dennoch statistisch signifikant/biologisch relevant sind.
Eine bekannte Herausforderung in den Studien auf menschlichen Isern ist die Sorge um die heterogene Population sowohl von Beta-Zellen als auch von Nicht-Beta-Zellen. Unsere Verwendung des PDX1-Gegenflecks ermöglicht die Beurteilung der mitophagiekomplexen Bildung in Betazellen (sowie PDX1-negativen Nicht-Beta-Zellen). Ein potenzielles Anliegen, PDX1 als Gegenfleck zu verwenden, ist seine Expression in den Pankreasdeltazellen16,17,18, wenn auch in einem viel geringeren Maße als in Beta-Zellen, da solche anderen Marker (d. h. NKX6.1) verwendet werden könnten, um Ziel-Beta-Zellen genauer. Durch die Dispergierung intakter Inselchen in einzelne Zellen unmittelbar vor der Zytozentrifugation und Fixierung sind wir auch in der Lage, einzelzellige Mitophagie-Studien mit nur minimaler Störung der Islet-Mikroumgebung während der Medikamentierung und/oder glucolipotoxische Exposition. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass die Mitophagie-Dispersion unabhängig von relevanten Behandlungen mitophagische Komplexe innerhalb der Zellen stören könnte.
Während traditionellere Protein-Protein-Interaktionsstudien in menschlichen Pankreasinseln eingesetzt werden können, wie z. B. Co-Immunpräzipitation und/oder proteomische Ansätze, erfordern diese Verfahren in der Regel eine große Menge an Insellysat, was sich als herausfordernd erweisen kann. angesichts der Knappheit an menschlichem Isletmaterial zur Verfügung. Darüber hinaus wird die Sorge um die Zelltypspezifität während dieser traditionellen Techniken deutlicher oder erfordert eine zusätzliche Optimierung der Durchflusszytometriemethoden, um reine Betazellpopulationen zu sortieren19,20, 21,22. So bietet unser PLA-Ansatz eine attraktive und praktische Alternative für Protein-Protein-Interaktionsstudien des Mitophagie-Signalwegs in menschlichen Beta-Zellen. Insbesondere die Fähigkeit, nur 40 Gesamtinseln/Bedingung pro Experiment zu verwenden, um die Mitophagie-Komplexbildung in Tausenden von einzelnen Beta-Zellen zu quantifizieren, ermöglicht Inselforschern die Möglichkeit, ihre Inselpräparate für andere Bewertungen aus dem gleichen Spenders.
Da NRDP1 und USP8 allgegenwärtig ausgedrückt werden, spekulieren wir, dass diese Technik einen Wert für die Bewertung der Mitophagie in Zelltypen jenseits von Betazellen haben könnte. Die Möglichkeiten umfassen andere Isletzelltypen (mit relevanten Gegenflecken für Alphazellen oder Deltazellen) oder Zelltypen, die stark auf Mitophagie angewiesen sind, wie z. B. Neuronen. Zu diesem Zweck könnte unsere Beobachtung der Übertragbarkeit dieser Technik auf SH-SY5Y Neuroblastomzellen (Abbildung 2) oder PDX1-negative Isletzellen (Abbildung 4) den Nutzen unserer Technik für den Mitophagieweg in anderen Zelltypen nahelegen.
Trotz der Einfachheit und Einfachheit des NRDP1:USP8 PLA-Ansatzes gibt es Herausforderungen, die die Ergebnisse dieses Assays verwirren könnten. Während PLA in der Lage ist, Protein-Protein-Wechselwirkungen in unmittelbarer Nähe (40 nm) zu ermitteln, schließt es nicht aus, dass bestimmte experimentelle Bedingungen die Nähe von NRDP1-USP8 aufrechterhalten und gleichzeitig die Interaktion stören könnten, was von der PLA-Ansatz. Während wir gezeigt haben, dass die komplexe Bildung von NRDP1:USP8 eine gültige Auslesung des kanonischen CLEC16A/PARKIN-Mitophagie-Signalwegs in Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse ist, haben neuere Studien die Rolle der PARKIN-unabhängigen Mitophagie in mitochondrialen Qualitätskontrolle23,24. Wir wissen noch nicht, wie die komplexe Bildung von NRDP1:USP8 durch die Störung der PARKIN-unabhängigen Mitophagie verändert wird. Daher wäre es ratsam, einen komplementären Ansatz zu verwenden, der über die hier beschriebenen hinausgeht, um die Mitophagie in Betazellen zu assayen. Schließlich hängt die Stabilität dieses Mitophagie-Komplexes von der Ubiquitination der Komponentenproteine ab, so dass die Zugabe eines Breitspektrum-Deubiquitinase-Inhibitors PR619 entscheidend ist, um die Ubiquitination während der Probenvorbereitung aufrechtzuerhalten. Auch hier müssen Manipulationen von Betazellen, die indirekt die Ubiquitination von Komponenten des NRDP1-USP8-Komplexes stören können, bei der Analyse von NRDP1:USP8 als Auslesung für die Mitophagie-Komplexbildung berücksichtigt werden.
Da die Rolle der mitochondrialen Qualitätskontrolle zunehmend nicht nur in der Beta-Zellfunktion, sondern auch in anderen hochmetabolischen Zelltypen geschätzt wird, kann sich die strenge Bewertung der Mitophagie als herausfordernd und zeitaufwändig für Gruppen erweisen, die eine schnellere Bewertung wichtiger Mitophagiekomponenten. Der PLA-Ansatz, den wir beschreiben, ist eine relativ kostengünstige Visualisierungstechnik auf molekularer Ebene, die eine quantitative Analyse der mitophagiekomplexen Bildung mit einzelzelliger Auflösung in kleinen Mengen menschlicher Isletproben ermöglichen kann und breit angewendet werden könnte. einer Vielzahl von Zelltypen, Behandlungen oder Krankheitszuständen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung von JDRF (CDA-2016-189 und SRA-2018-539), dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), der Familie Brehm und der Familie Anthony. Der JDRF Career Development Award an S.A.S. wird teilweise von der Danish Diabetes Academy unterstützt, die von der Novo Nordisk Foundation unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
