Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.
Abstract
La mitophagie est une voie de contrôle de la qualité mitochondriale essentielle, qui est cruciale pour les bioénergétiques de cellules bêta d'écœuras pancréatiques pour alimenter la libération d'insuline glucose-stimulée. L'évaluation de la mitophagie est difficile et nécessite souvent des journalistes génétiques ou de multiples techniques complémentaires pas facilement utilisées dans les échantillons de tissus, tels que les îlots pancréatiques humains primaires. Ici nous démontrons une approche robuste pour visualiser et quantifier la formation des complexes endogènes principaux de mitophagie dans les îlots pancréatiques humains primaires. En utilisant la technique d'analyse de la ligature de proximité sensible pour détecter l'interaction des régulateurs de mitophagie NRDP1 et USP8, nous sommes en mesure de quantifier spécifiquement la formation de complexes essentiels de mitophagie in situ. En couplant cette approche pour contrer le facteur de transcription PDX1, nous pouvons quantifier les complexes de mitophagie, et les facteurs qui peuvent altérer la mitophagie, en particulier dans les cellules bêta. La méthodologie que nous décrivons surmonte le besoin de grandes quantités d'extraits cellulaires nécessaires pour d'autres études d'interaction protéine-protéine, telles que l'immunoprécipitation (IP) ou la spectrométrie de masse, et est idéale pour les échantillons humains précieux d'îc généralement pas disponibles en quantités suffisantes pour ces approches. En outre, cette méthodologie évite la nécessité de techniques de tri de flux pour purifier les cellules bêta d'une population hétérogène d'îlet pour les applications de protéines en aval. Ainsi, nous décrivons un protocole valable pour la visualisation de la mitophagie fortement compatible pour l'usage dans les populations hétérogènes et limitées de cellules.
Introduction
Les cellules bêta pancréatiques produisent l'insuline nécessaire pour maintenir l'homéostasie normale de glucose, et leurs résultats d'échec dans le développement de toutes les formes de diabète. Les cellules bêta conservent une capacité mitochondriale robuste pour générer l'énergie nécessaire pour coupler le métabolisme du glucose avec la libération d'insuline. Récemment, il est devenu évident que le maintien de la masse mitochondriale fonctionnelle est d'une importance essentielle pour la fonction cellulaire bêta optimale1,2,3. Afin de soutenir la masse mitochondriale fonctionnelle, les cellules bêta comptent sur desmécanismes de contrôle de qualité pour enlever les mitochondries dysfonctionnelles, endommagées ou vieillissantes 4. Nous et d'autres avons précédemment démontré que les cellules bêta s'appuient sur une forme spécialisée de rotation mitochondriale, appelée autophagie mitochondriale (ou mitophagie), pour maintenir le contrôle de la qualité mitochondriale dans les îlots de rongeurs et humains1, 2,5. Malheureusement, cependant, il n'y avait aucune méthode simple pour détecter la mitophagie, ou les composants endogènement exprimés de mitophagie, dans les cellules bêta pancréatiques humaines.
Nous avons récemment montré que la régulation en amont de la mitophagie dans les cellules bêta repose sur la formation d'un complexe protéique comprenant les ligases E3 CLEC16A et NRDP1 et les usP81. NRDP1 et USP8 ont été montrés indépendamment pour affecter la mitophagie par l'action sur l'initiateur de mitophagie clé PARKIN6,7. NRDP1 cible PARKIN pour l'ubiquitination et la dégradation pour éteindre la mitophagie6, et USP8 spécifiquement deubiquitinates K6-lié PARKIN pour promouvoir sa translocation aux mitochondries7. La technologie d'essai de ligature de proximité (PLA) a été une avancée récente dans le domaine de la biologie de l'interaction protéique8, permettant la visualisation des interactions protéiques endogènes in situ dans des cellules individuelles, et n'est pas limitée par le matériel d'échantillon rare. Cette méthodologie est particulièrement attrayante pour la biologie des îlettes/bêta humains, en raison de la rareté de la disponibilité de l'échantillon, couplée à la nécessité de comprendre les complexes protéiques physiologiquement pertinents dans les types de cellules hétérogènes.
En utilisant l'approche PLA, nous sommes en mesure d'observer les principaux complexes de mitophagie endogène dans les cellules bêta pancréatiques humaines primaires et les lignées cellulaires neuronales, et de démontrer les effets d'un environnement diabétogénique sur la voie de la mitophagie1. En résumé, l'objectif principal de ce protocole est d'analyser des complexes protéiques mitophatophanes spécifiques dans les tissus dépourvus de matériaux abondants, ou lorsque les études conventionnelles d'interaction des protéines ne sont pas possibles.
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Protocol
L'utilisation d'îlots pancréatiques humains de donneurs déidentifiés se fait par l'entremise d'une exemption de la Commission d'examen institutionnel (CISR) et conformément à la politique de la CISR de l'Université du Michigan. Les îlots pancréatiques humains ont été fournis par le Programme intégré de distribution des îlots (IIDP) parrainé par les NIH/NIDDK.
1. Préparation d'échantillons d'islet s'homme
-
Dissociation à cellule unique
- Échantillons d'îflements humains de culture (4000-6000 équivalents d'ît/10 ml de support) pendant au moins 1 jour à 37 oC dans les médias d'îcles pancréatiques (PIM(S)) par un support de 1 mM de glutamine bovine (PIM(G), 100 unités/mL antimycotiques-antibiotiques, 1 mM de pyruvate fœtal de sodium et 10 % de pyruvate fœtal de sodium et 10 % de pyruvate fœtal sérum (FBS) ou sérum AB humain.
- Utilisez un microscope léger de dissection au grossissement 3x pour compter les îlots humains individuels de la culture. Choisissez 40 îlots par traitement/condition d'intérêt (comme la glucolipotoxicité) dans des tubes de 1,5 ml dans le support des îlots.
- Îlots centrifuges à 400 x g pendant 1 min à 10 oC de sédiments.
- Laver les échantillons, par brève inversion des tubes à température ambiante, deux fois avec 1 ml de phosphate tamponné saline (PBS) contenant 50 M PR619 (un inhibiteur deubiquitinase; pour préserver les interactions protéiques dépendantes de l'ubiquitine), avec centrifugation entre chaque lavage à 400 x g pendant 1 min à 10 oC.
- Dissocier les îlots en cellules individuelles avec 125 l de trypsine de 0,25 % contenant 50 M PR619 en incubant la trypsine préchauffée (37 oC) pendant 3 min avec des granulés d'îlots. Disperser délicatement les îlots pendant cette période à l'aide d'une pipette douce périodique à l'aide d'une pipette de 200 l.
- Désintoxiquer la trypsine avec 1 ml réchauffé (37 oC) PIM(S) média contenant 50 M PR619, puis les cellules sédimentaires en centrifuge à 400 x g pendant 1 min.
- Laver les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 1 min, deux fois, avec pbS 50 M PR619.
- Enfin, resuspend les cellules dans 150 PbS de L contenant 50 M PR619.
-
Adhérence et fixation à cellule unique
- Après la résuspension, faites tourner la solution cellulaire sur des lames de microscope givrées et chargées à l'aide d'une cytocentrifuge à 28 x g pendant 10 min.
- Après la cytocentrifugation, définit la zone cellulaire avec un stylo hydrophobe (voir le tableau des matériaux) pour minimiser les volumes de solutions d'anticorps/APL nécessaires. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 15 min à température ambiante.
CAUTION: PFA est dangereux et doit être manipulé avec soin. - Pour de meilleurs résultats, effectuer la coloration / PLA immédiatement, ou dans les 24 heures. Si nécessaire, conserver les échantillons dans le PBS à 4 oC jusqu'à ce qu'ils ne soient pas tachés pendant plus de 48 h.
2. Immunohistochimie
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Blocage
- Laver les cellules deux fois avec 1x PBS pendant 5 min à température ambiante.
- Solution de cellules de bloc, pour éliminer la coloration de fond, avec 10% sérum d'âne dans PBS contenant le détergent de 0.3% (voir le tableau des matériaux) pour 1 h à la température ambiante.
-
Coloration
- Incuber les cellules avec des anticorps primaires de souris ou de lapin contre USP8 (1:250) et NRDP1 (1:250) respectivement (voir le tableau des matériaux) diluédans de phosphate tamponné saline avec détergent (PBT, voir Tableau des matériaux), à 4 oC pendant la nuit, à détecter la signalisation complexe de mitophagie par l'intermédiaire de PLA.
- Co-incuber les cellules avec un marqueur spécifique pour l'identification des cellules bêta qui n'a pas été soulevée chez la souris ou le lapin afin de ne pas interférer avec le signal PLA. Dans ce cas- incubent des cellules avec l'anti-chèvre PDX1 (1:500) dans PBT. Incuber tous les anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC, en utilisant du film plastique sur le dessus de la solution pour prévenir l'évaporation.
3. L'assay de ligature de proximité
- Sonde et contre-tache de pLA
- Préparer la solution de la sonde PLA selon les instructions du fabricant, c'est-à-dire faire 20 l de solution de sonde par échantillon en préparant une concentration finale de la solution 1:5 de la solution de sonde anti-souris et anti-lapin en PBT, et l'incubation pendant 20 min à la pièce température.
- Après l'incubation de nuit, laver les cellules deux fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun, sur un rocker.
- Juste avant l'incubation avec la solution de sonde, ajouter l'anti-chèvre Cy5 secondaire à une concentration finale de 1:600 à la solution de sonde (pour la détection du PDX1 endogène). Ajouter une solution de sonde de 20 l à chaque condition cellulaire, couvrir délicatement de film plastique et incuber à 37 oC pendant 1 h.
- Ligature
- Laver les cellules deux fois, à température ambiante, avec le tampon A (voir la table des matériaux pour la recette) pendant 5 min chacun, sur un rocker.
- Préparer la solution de ligature (une partie des réactifs de détection, voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Pour cela, diluer le stock de ligature (5x) 1:5 dans l'eau traitée par le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC). Immédiatement avant l'incubation ajouter 0,025 U/mL ligase. Ajouter une solution de ligation de 20 L aux cellules. Couvrir de pellicule plastique et incuber à 37 oC pendant 30 min.
- amplification
- Laver les cellules deux fois à température ambiante avec le tampon A pendant 2 min chacun.
- Faire une solution d'amplification (une partie des réactifs de détection, voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Tampon d'amplification dilué (5x) 1:5 dans de l'eau traitée par DEPC et garder dans l'obscurité jusqu'à utilisation. Ajouter une dilution 1:80 de polymérase (une partie des réactifs de détection, voir Tableau des matériaux) à la solution immédiatement avant d'ajouter la solution aux cellules.
- Ajouter 20 L de solution d'amplification aux cellules. Couvrir de pellicule plastique et placer dans l'obscurité à 37 oC pendant entre 1 h 40 min et 2 h pour un signal maximal.
- Préparation à l'imagerie
- Laver les cellules deux fois avec le tampon B (voir la table des matériaux pour la recette) pendant 10 min à température ambiante, sur un rocker.
- Enfin, laver les cellules une fois dans 0.01x Buffer B, pendant 2 min à température ambiante sur un rocker.
- Montez des échantillons en ajoutant une goutte de support de montage contenant 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et en plaçant soigneusement une feuille de couverture sur les échantillons à l'aide d'une lame de scalpel pour presser toutes les bulles formées. Scellez les couvertures à l'aide de vernis à ongles transparent sur les bords.
- Des échantillons d'images sur un microscope capable de capturer plusieurs plans focaux, tels qu'un microscope confocal à balayage laser, ou un microscope à fluorescence inversée avec des capacités de déconvolution, prenant au moins 9 images différentes de plan focal.
- Capturez des images à 100x grossissement, avec environ 0,45 mm z-pile hauteur. Capturez l'ALP à 550 nm d'excitation, 570 nm d'émission; contre-tache à 650 nm d'excitation, 670 nm d'émission; et DAPI à 405 nm excitation, 450 nm émission.
- Pour s'assurer que les signaux de fond de l'image de fluorescence et la lumière parasite sont réduits au minimum pour l'analyse en aval des événements de pLA (en particulier sur les microscopes à large champ), les images de processus utilisant un algorithme de déconvolution bidimensionnelle (voisin le plus proche) à l'aide d'un logiciel standard de traitement d'image de choix.
REMARQUE : Pour l'utilisation d'Olympus CellSens, Nikon utilise NIS-Elements, Leica utilise LAS X, Zeiss - ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, ainsi que plusieurs Plugins disponibles via Image-J. Pour l'analyse, le nombre total d'interactions sur l'ensemble des z-stacks doit être analysé à l'aide du logiciel Image-J, en veillant à ce que seules les cellules positives Pdx-1 soient analysées (section 3.5).
- Quantification des interactions pLA
- Ouvrez l'application logicielle gratuite Image-J et ouvrez l'image PLA. Commencez à partir de la première image PLA fortement en ligne.
- Cliquez sur l'onglet image, et sélectionnez ajuster, puis seuil (Figure 1A). Ajuster le seuil pour supprimer tout signal PLA non spécifique, prendre note de l'ajustement du seuil et essayer de le garder cohérent tout au long de l'analyse.
- Cliquez sur l'onglet processus, et sélectionnez binaire, puis faire binaire (Figure 1B). Utilisez l'image binaire pour mesurer les particules, en cliquant sur l'onglet «analyser» et en appuyant sur les particules d'analyse (Figure 1C).
- Pour l'analyse assurez-vous que les paramètres sont les suivants: Taille '0'Infinity, Circularité '0'1.0, Afficher 'Outlines, cocher les cases pour les résultats d'affichage, et les résultats clairs (Figure 1D). Cliquez OK. Prenez note du nombre de particules analysées dans une feuille de calcul indiquant l'échantillon, et la position z-stack.
- Répétez les étapes 3.5.2-3.5.4 jusqu'à ce que toutes les z-stacks in-focus pour l'échantillon aient été analysés. Sommez le nombre total de particules pour l'échantillon dans la feuille de calcul pour quantifier le nombre total d'interactions.
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Representative Results
Nous avons mené des expériences initiales dans la lignée de cellules bêta pancréatiques MIN6 et la lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y, afin d'optimiser et de confirmer à la fois la spécificité des anticorps et les interactions protéiques visualisées. Les cellules MIN6 ont été plaquées sur des couvertures à 30 000 cellules/mL et laissées à adhérer pendant 48 h, les cellules SH-SY5Y ont été plaquées sur des plaques de couverture à 15 000 cellules/mL et laissées à adhérer pendant 24 h. Le protocole PLA a ensuite été suivi comme ci-dessus, à partir de l'étape 1.2.3. Pour assurer la spécificité des signaux de l'APL, nous avons d'abord effectué cette approche en présence (i) d'aucun anticorps primaire (Figure 2A, Figure 3A), (ii) anticorps NRDP1 seul (Figure 2B, Figure 3B), (iii) anticorps USP8 seul ( Figure 2C, Figure 3C), et (iv) les anticorps NRDP1 et USP8 (Figure 2D, Figure 3D). Pour faciliter la configuration de l'échantillon, le tableau 1 indique comment bien mettre en page les contrôles expérimentaux. Notamment, nous n'observons aucun signal ponctate d'APL dans l'anticorps primaire simple ou aucune condition primaire de contrôle d'anticorps, confirmant ainsi que les interactions in situ sont spécifiquement observées entre NRDP1 et USP8 en présence des deux anticorps primaires, dans les deux MIN6 et Cellules SH-SY5Y.
Nous avons ensuite adapté cette approche pour une utilisation avec des îlots humains pour analyser les interactions complexes mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta humaines primaires. Les îlots humains sont composés d'une population hétérogène de cellules fonctionnellement distinctes,y compris l'alpha, la bêta, le delta et les cellules PP 9. Contrairement aux îlots de souris où les cellules bêta représentent 80 % de la masse des îlots, les cellules bêta forment une plage proportionnellement plus petite dans les îlots humains (entre 28 et 75 %)10,11,12. Ainsi, nous avons cherché à utiliser la technologie PLA pour nous permettre d'observer la présence de complexes de mitophagie NRDP1-USP8 spécifiquement dans les cellules bêta et de nous assurer que nous n'avons pas observé les observations confondantes d'autres types de cellules d'îtte (qui pourraient se produire à partir de co-immunoprécipitation s'étudie dans les lysates des islets). Ainsi, il est important d'assurer une dispersion adéquate et uniforme des friches à un niveau tel que les cellules individuelles peuvent être facilement discriminées et analysées plus en détail. Comme le voit la figure 4, le protocole de dispersion (section 1) est très efficace pour assurer les cellules individuelles dans le champ de vision du microscope pour l'analyse en aval. Pour identifier les cellules bêta, nous avons effectué la co-coloration avec PDX1 anti-sera spécifique pendant le processus pLA. PDX1 est un facteur de transcription spécifique à une cellule bêta vitale, que l'on trouve dans les cellules bêta productrices d'insuline matures principalement dans le noyau13. La coloration PDX1 a été conservée à la suite de l'APL NRDP1:USP8 dans les îlots humains primaires (figure 4). Fait important, nous avons utilisé la chèvre PDX1 anti-sera pour éviter la réactivité croisée avec des anticorps primaires utilisés pour pLA (lapin anti-NRDP1 et souris anti-USP8, respectivement). Ainsi, l'ajout de PDX1 contre la coloration permet l'évaluation spécifique des complexes mitophatoxiques endogènes dans les cellules bêta humaines primaires.
En utilisant ces approches, nous pouvons compiler un instantané de la rétention du complexe de mitophagie NRDP1:USP8 pour déduire la compétence de la voie de mitophagie dans les cellules bêta. Pour étendre cette approche pour une utilisation dans les conditions environnementales imitant ceux du diabète de type 214,nous avons traité les lignées de cellules bêta et les îlots humains primaires avec le palmitate et le glucose élevé pour induire la glucolipotoxicité. En effet, nous avons constaté que l'interaction de NRDP1 et USP8 a été diminuée après une exposition de 48 h au palmitate et au glucose élevé dans les deux lignées de cellules bêta ainsi que les cellules bêta humaines primaires par PLA (figure5 et référence1). Ce résultat met en évidence la faisabilité de cet effort pour évaluer les principaux facteurs de mitophagie endogènes à la suite de stimuli diabétogènes.
Figure 1 : Flux de travail de l'analyse de l'image J pour la quantification des interactions PLA. Les étapes importantes de l'analyse sont mises en évidence ici. (A) Ajustement du seuil d'image pour assurer une analyse spécifique du signal PLA. (B) Conversion de l'image en données binaires pour faciliter la quantification. (C-D) Comment finaliser l'analyse en analysant les particules reconnues par le logiciel ImageJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : NRDP1 et USP8 interagissent spécifiquement dans les cellules bêta pancréatiques. Des images de grossissement élevé (100x) de la lignée cellulaire pancréatique de la souris, MIN6, sont montrées. (A-D) Le signal PLA pour l'interaction NRDP1:USP8 est indiqué en rouge, et les noyaux sont délimités par DAPI en bleu. (A-C) Aucun signal de ponctate spécifique pour l'interaction NRDP1:USP8 n'est observé si les deux (A) ou l'un ou l'autre (B, C) des anticorps protéiques primaires sont omis pendant le processus pLA. Cependant, l'interaction des deux protéines est visible par PLA dans les cellules bêta pancréatiques (D) lorsque les deux anticorps sont inclus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : NRDP1 et USP8 interagissent spécifiquement dans les cellules de neuroblastome. Des images de grossissement élevé (100x) de la lignée cellulaire du neuroblastome humain, SH-SY5Y, sont montrées. (A-D) Le signal PLA pour l'interaction NRDP1:USP8 est indiqué en rouge, et les noyaux sont délimités par DAPI en bleu. (A-C) Aucun signal de ponctate spécifique pour l'interaction NRDP1:USP8 n'est observé si les deux (A) ou l'un ou l'autre (B, C) des anticorps protéiques primaires sont omis pendant le processus pLA. Cependant, l'interaction des deux protéines est visible par PLA (D) lorsque les deux anticorps sont inclus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Les complexes de mitophagie de cellules bêta peuvent être identifiés dans les îlots pancréatiques humains primaires in situ par PLA. Des images de grossissement élevé (100x) d'îlots humains dispersés sont montrées. Les cellules simples sont délimitées par coloration nucléaire avec DAPI (bleu), les cellules bêta sont observées avec la coloration PDX1 (magenta), et les complexes de mitophagie peuvent être vus dans les cellules bêta et non-bêta (rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Le complexe de mitophagie NRDP1:USP8 est déstabilisé dans les cellules bêta par glucolipotoxicité.
Des images de grossissement élevé (100x) de cellules MIN6 traitées pendant 48 h avec un contrôle (25 mM de glucose à 0,82% de BSA) soit un taux élevé de glucose et de palmitate (25 mM de glucose à 0,4 mM de palmitate/0,82% de BSA) sont présentés. (A-B) Le signal de PLA (NRDP1:USP8) est vu dans les deux groupes de traitement. Le signal PLA diminue dans les cellules bêta MIN6 après glucolipotoxicité (B) par rapport aux contrôles (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| échantillon | ANTIBODY 1 (souris anti-NRDP1) | ANTIBODY 2 (lapin anti-USP8) | ANTIBODY 3 (chèvre anti-PDX1) (contre-tache facultative) |
| CONTROL 1: Aucun anticorps primaire (40 îlots) | - | - | + |
| CONTROL 2: NRDP1 seul (40 îlots) | + | - | + |
| CONTROL 3: USP8 seul (40 îlots) | - | + | + |
| EXPERIMENTAL 1-x: toutes conditions expérimentales (40 îlots chacun) | + | + | + |
Tableau 1 : Configuration de la conception expérimentale de l'échantillon.
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Discussion
Ici nous décrivons une approche simple et efficace pour employer NRDP1:USP8 PLA dans les tissus/cellules d'intérêt pour quantifier la formation des complexes de mitophagie en amont. Nous avons précédemment confirmé la formation du complexe de mitophagie cLEC16A-NRDP1-USP8 dans les cellules bêta pancréatiques par plusieurs méthodologies, y compris des expériences de co-immunoprécipitation, des études d'interaction sans cellules, et in vitro aussi bien que des cellules-basées ubiquitination tests, et a démontré comment ce complexe conduit réglé flux mitophagique1,15. Les études de PLA que nous rapportons et décrivons ici permettent une vue rapide, quantitative, et cellule-spécifique de la voie de mitophagie qui est fortement adaptable aux cellules bêta humaines primaires. En outre, nous avons montré que NRDP1:USP8 PLA peut être adapté pour une utilisation en dehors de la biologie des cellules bêta dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y, soulignant la faisabilité potentielle de cette technique pour surveiller les complexes de mitophagie dans les systèmes neuronaux ainsi.
L'ALP est une approche simple; toutefois, certaines étapes du protocole sont de la plus haute importance pour assurer des résultats clairs et précis. Il s'agit notamment de: (1) assurer la procédure de dispersion des îlots humains est assez doux pour prévenir la lyse cellulaire / dommages pour optimiser les images, (2) l'ajout de l'inhibiteur deubiquitinase, PR619, immédiatement avant la fixation et pendant les lavages pour préserver le l'état d'ubiquitination (et donc contraignant) du complexe NRDP1-USP8 pour l'observation maximale du signal par l'APL, et (3) la quantification objective des événements de l'APL par ImageJ afin d'assurer une évaluation impartiale des complexes de mitophagie et de permettre également la détermination des conditions par lesquelles les changements sur la mitophagie peuvent ne pas être complets mais toujours statistiquement significatifs/biologiquement pertinents.
Un défi bien connu dans les études humaines d'îclet est la préoccupation pour la population hétérogène des cellules bêta et des cellules non-bêta. Notre utilisation de la contre-tache PDX1 permet d'évaluer la formation complexe de mitophagie dans les cellules bêta (ainsi que les cellules non bêta négatives De PDX1). Une préoccupation potentielle utilisant PDX1 comme contre-tache est son expression dans les cellules du delta pancréatique16,17,18, bien que dans un degré beaucoup plus faible que dans les cellules bêta, comme tels autres marqueurs (c.-à-d., NKX6.1) pourrait être utilisé pour cellules bêta cibles plus spécifiquement. En dispersant les îlots intacts dans des cellules simples immédiatement avant la cytocentrifugation et la fixation, nous sommes également en mesure d'effectuer des études de mitophagie à cellule unique avec seulement une perturbation minimale du microenvironnement de l'îlots au cours des traitements médicamenteux et/ou glucolipotoxique. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la dispersion des îîaux puisse interférer avec les complexes mitophagiques dans les cellules indépendamment des traitements pertinents.
Bien que des études plus traditionnelles d'interaction protéine-protéine puissent être employées dans les îlots pancréatiques humains, tels que la co-immunoprécipitation et/ou les approches protéomiques, ces procédures exigent généralement une grande quantité de lysate d'îlots, qui peut s'avérer provocante compte tenu de la rareté du matériel d'înce humain disponible. En outre, le souci de la spécificité du type cellulaire au cours de ces techniques traditionnelles devient plus évident ou nécessite une optimisation supplémentaire des méthodes de cytométrie du débit pour trier les populations de cellules bêta pures19,20, 21,22. Ainsi, notre approche PLA fournit une alternative attrayante et pratique pour les études d'interaction protéine-protéine de la voie mitophagie dans les cellules bêta humaines. Notamment, la capacité d'utiliser aussi peu que 40 îlots/condition totales par expérience pour quantifier la formation complexe de mitophagie dans des milliers de bêta-cellules individuelles permet aux chercheurs d'îlots la capacité de conserver leurs préparations d'îlots pour d'autres évaluations de la même donateur.
Comme NRDP1 et USP8 sont omniprésents exprimés, nous spéculons que cette technique peut avoir une valeur pour l'évaluation de la mitophagie dans les types de cellules au-delà des cellules bêta. Les possibilités incluent d'autres types de cellules d'îtte (avec des contretaches pertinentes pour les cellules alpha ou les cellules de delta) ou des types de cellules qui comptent fortement sur la mitophagie, tels que des neurones. À cette fin, notre observation de la transférabilité de cette technique aux cellules neuroblastoma de SH-SY5Y (figure 2) ou aux cellules d'îtte PDX1-négatives (figure 4) pourrait suggérer l'utilité de notre technique pour la voie de mitophagie dans d'autres types de cellules.
Malgré la facilité et la simplicité de l'approche NRDP1:USP8 PLA, il y a des défis qui pourraient confondre les résultats de cet analyse. Bien que l'APL soit en mesure de déterminer les interactions protéines-protéines à proximité (40 nm), elle n'exclut pas la possibilité que certaines conditions expérimentales puissent maintenir la proximité du NRDP1-USP8 tout en perturbant l'interaction, ce qui serait manqué par le Approche PLA. En outre, alors que nous avons démontré que la formation complexe NRDP1:USP8 est une lecture valide pour la voie canonique CLEC16A/PARKIN-mitophagie dans les cellules bêta pancréatiques, des études récentes ont observé des rôles pour la mitophagie PARKIN-indépendante dans les mitochondries mitochondriales contrôle de la qualité23,24. Nous ne savons pas encore comment la formation complexe NRDP1:USP8 est modifiée par la perturbation de la mitophagie indépendante de PARKIN. Ainsi, l'utilisation d'une approche complémentaire au-delà de ceux décrits ici pour essayer la mitophagie dans les cellules bêta serait souhaitable. Enfin, la stabilité de ce complexe de mitophagie dépend de l'ubiquitination des protéines composant, de sorte que l'ajout d'un inhibiteur de deubiquitinase à large spectre PR619 est essentiel pour maintenir l'ubiquitination pendant la préparation de l'échantillon. Encore une fois, les manipulations des cellules bêta qui peuvent perturber indirectement l'ubiquitination des composants du complexe NRDP1-USP8 doivent être considérées lors de l'analyse de NRDP1:USP8 comme une lecture pour la formation complexe de mitophagie.
Comme le rôle du contrôle de la qualité mitochondriale est de plus en plus apprécié non seulement dans la fonction des cellules bêta, mais aussi d'autres types de cellules hautement métaboliques, l'évaluation rigoureuse de la mitophagie peut s'avérer difficile et longue pour les groupes qui souhaitent une plus rapide l'évaluation des composants cruciaux de mitophagie. L'approche PLA que nous décrivons est une technique de visualisation moléculaire relativement peu coûteuse qui peut fournir une analyse quantitative de la formation complexe de mitophagie avec une résolution de cellules uniques dans des échantillons d'îttes humains en petite quantité et pourrait être largement appliquée à une variété de types de cellules, de traitements ou de maladies.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la FRDJ (CDA-2016-189 et SRA-2018-539), de l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales, des National Institutes of Health (R01-DK-108921), de la famille Brehm et de la famille Anthony. Le Prix de développement de carrière de la FRDJ à S.A.S. est en partie soutenu par l'Académie danoise du diabète, qui est soutenue par la Fondation Novo Nordisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
