Summary
该协议概述了一种定量分析从原人类小岛样本的β细胞中专门形成米托巴细胞蛋白复合体的方法。因此,该技术允许从有限的生物材料分析米托巴,这在珍贵的人类胰腺β细胞样本中至关重要。
Abstract
Mitophagy 是一种重要的线粒体质量控制途径,对于胰腺胰岛β细胞生物能量促进葡萄糖刺激的胰岛素释放至关重要。评估米托巴经具有挑战性,通常需要基因报告员或多种补充技术,这些辅助技术不易用于组织样本,如原发性人类胰腺胰岛。在这里,我们演示了一种强大的方法来可视化和量化主要人类胰腺胰岛中关键内源性米托巴细胞复合物的形成。利用灵敏的接近结扎检测技术来检测米托巴风调节器NRDP1和USP8的相互作用,我们能够具体量化原位基本米托巴结物的形成。通过结合这种方法来对抗转录因子PDX1的染色,我们可以量化米托巴结物复合物,以及可能损害米托巴的因子,特别是在β细胞内。我们描述的方法克服了其他蛋白质-蛋白质相互作用研究(如免疫沉淀 (IP) 或质谱仪)所需的大量细胞提取物的需求,并且通常不适合珍贵的人类胰岛样本,通常不为这些方法提供足够数量的产品。此外,该方法消除了对流分选技术的需求,从异质小岛种群中纯化β细胞,用于下游蛋白质应用。因此,我们描述了一种有价值的方案,用于可视化米托巴细胞,高度兼容,用于异质和受限细胞群。
Introduction
胰腺β细胞产生维持正常葡萄糖平衡所需的胰岛素,其失败导致所有形式的糖尿病的发展。Β细胞保持强大的线粒体能力,以产生将葡萄糖代谢与胰岛素释放耦合所需的能量。最近,很明显,维持功能线粒体质量对于最佳β细胞功能1,2,3至关重要。为了维持功能线粒体质量,β细胞依靠质量控制机制来去除功能失调、受损或老化的线粒体4。我们和其他人以前已经证明,β细胞依靠一种特殊形式的线粒体周转,称为线粒体自噬(或线粒体),以保持线粒体质量控制在啮齿动物和人类胰岛1, 2,5.然而,不幸的是,在人类胰腺β细胞中,没有简单的方法来检测米托巴细胞或内分泌的米托巴细胞成分。
我们最近已经表明,β细胞中米托巴的上游调节依赖于形成一种蛋白质复合物,包括E3利气CLEC16A和NRDP1和二苯基酸酶USP81。NRDP1和USP8已经独立显示,通过行动对关键的米托巴沙第6,7影响米托巴吉。NRDP1的目标是PARKIN的泛化和降解关闭米托巴希6,和USP8专门二苯基丁基丁K6链接的PARKIN,以促进其易位线粒体7。接近结扎测定(PLA)技术是蛋白质相互作用生物学领域的一个最新进展,允许在单个细胞中原位实现内源性蛋白质相互作用的可视化,不受稀缺样品材料的限制。这种方法对人类小岛/β细胞生物学特别诱人,因为样品可用性的稀疏性,加上需要了解异质细胞类型中生理相关的蛋白质复合物。
利用PLA方法,我们能够观察原发性人类胰腺β细胞和神经元细胞系中的关键内源性米托巴细胞复合物,并演示糖尿病环境对米托巴病途径1的影响。总之,该协议的首要目标是分析缺乏丰富物质的组织中的特定米托巴状蛋白复合物,或者无法进行常规蛋白质相互作用研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
使用已识别的捐赠者人类胰腺胰岛是通过机构审查委员会(IRB)豁免,并符合密歇根大学IRB政策。人类胰腺胰岛由NIH/NIDDK赞助的综合胰岛分布方案(IIDP)提供。
1. 人类小岛样品制备
-
单细胞分离
- 培养人类胰岛样品(4000~6000胰岛当量/10 mL介质),在胰腺胰岛介质(PIM(S))介质中至少1天,辅以1 mM谷氨酰胺(PIM(G))、100单位/mL抗霉菌抗生素、1mM丙酸钠和10%胎儿牛血清(FBS)或人AB血清。
- 使用3倍放大倍率的解剖光学显微镜从文化中计算单个人类胰岛。在胰岛介质中,将40个胰岛按治疗/感兴趣的条件(如葡狼疮毒性)挑入1.5 mL管中。
- 在400 x g下将小岛在10°C下向沉淀物旋转1分钟。
- 洗涤样品,在室温下通过管短暂反转,用含有50μM PR619(一种二甲基基辛酶抑制剂;以保留泛性依属蛋白相互作用)的1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)两次,每次洗涤时离心,每次洗涤400次x g在 10 °C 下 1 分钟。
- 将胰岛分离成单个细胞,125 μL的0.25%胰蛋白酶含有50μM PR619,用胰岛颗粒孵育预热胰蛋白酶(37°C)3分钟。在此期间,使用 200 μL 移液器定期温和移液,轻轻分散胰岛。
- 用含有50μM PR619的1mL加热(37°C)PIM(S)介质对胰蛋白酶进行淬火,然后通过400 x g离心1分钟来沉淀细胞。
- 用PBS + 50 μM PR619在400 x g下离心洗涤细胞1分钟,两次。
- 最后,在含有50μM PR619的150μL PBS中重新悬浮细胞。
-
单细胞粘附和固定
- 重新悬浮后,使用28 x g的细胞离心器将细胞溶液旋转到结霜、带电的显微镜幻灯片上10分钟。
- 细胞离心后,用疏水笔(见材料表)勾勒出细胞区域,以尽量减少所需的抗体/PLA溶液体积。在室温下,将4%的甲醛在PBS中固定15分钟。
注意:PFA 是危险的,必须小心处理。 - 为获得最佳效果,立即进行染色/PLA,或在 24 小时内进行染色。如有必要,将样品储存在PBS4°C,直到染色不超过48小时。
2. 免疫性化学
-
阻塞
- 在室温下用1x PBS清洗细胞两次5分钟。
- 块细胞溶液,以消除背景染色,在室温下,在PBS中含有0.3%洗涤剂(见材料表)10%的驴血清。
-
染色
- 用原小鼠或兔子抗体孵育细胞,分别针对USP8(1:250)和NRDP1(1:250)(见材料表),用洗涤剂在磷酸盐缓冲盐水中稀释(PBT,见材料表),在4°C过夜,以通过解放军检测米托巴吉复杂信号。
- 用一种标记共同孵化细胞,该标记专门用于β细胞识别,该标记在小鼠或兔子中未升高,以便不干扰PLA信号。在这种情况下,在PBT中孵育具有抗山羊PDX1(1:500)的细胞。在4°C下孵育所有原抗体过夜,在溶液顶部使用塑料薄膜防止蒸发。
3. 接近结扎测定
- PLA 探头和反印
- 根据制造商的说明准备 PLA 探针溶液,即,通过在 PBT 中制备抗小鼠和防兔子探针溶液的最终浓度为 1:5 溶液,并在室内孵育 20 分钟,使每个样品的探针溶液达到 20 μL温度。
- 过夜孵育后,用1xPBS在摇杆上洗涤细胞两次,每次5分钟。
- 在用探针液孵育之前,在探针溶液中加入最终浓度为1:600的抗山羊Cy5二级(用于检测内源性PDX1)。在每个细胞状况中加入20μL探针溶液,用塑料薄膜轻轻覆盖,并在37°C孵育1小时。
- 结扎
- 在室温下用缓冲器A(参见配方的材料表)在摇杆上洗涤细胞两次,每次5分钟。
- 根据制造商的说明制备结扎溶液(检测试剂的一部分,参见材料表)。为此,稀释结扎库存(5x)1:5在二乙基热盐(DEPC)处理的水。孵育前立即加入0.025 U/mL连带。向细胞添加20μL结扎溶液。用塑料薄膜盖住,在37°C孵育30分钟。
- 放大
- 在室温下用缓冲器A洗涤细胞两次,每次2分钟。
- 根据制造商的说明制作扩增溶液(检测试剂的一部分,参见材料表)。稀释扩增缓冲液(5x)1:5在DEPC处理的水,并保持在黑暗中,直到使用。在将溶液添加到细胞之前,在溶液中加入1:80稀释聚合酶(检测试剂的一部分,见材料表)。
- 向细胞中加入20μL的扩增溶液。用塑料薄膜盖住,在37°C的黑暗中放置1小时40分钟至2小时,以获得最佳信号。
- 成像准备
- 用缓冲器 B(参见配方材料表)在室温下在摇杆上清洗细胞两次(参见配方材料表)。10分钟。
- 最后,在0.01x缓冲液B中洗涤细胞一次,在室温下在摇杆上洗涤2分钟。
- 通过添加含有 4°,6-二甲苯-2-苯胺(DAPI)的安装介质来安装样品,并使用手术刀将任何气泡压出样品上的盖玻片。密封盖玻片,在边缘周围使用透明指甲油。
- 显微镜上能够捕获多个焦平面的图像样本,如激光扫描共聚焦显微镜或具有反卷积功能的倒置荧光显微镜,可拍摄至少 9 种不同的焦平面图像。
- 以 100 倍放大倍率拍摄图像,约 0.45 mm z 堆栈高度。以550纳米激发、570nm发射捕获PLA;650 nm 激发时的反污渍,670 nm 发射;和 DAPI 在 405 nm 激发,450 nm 发射。
- 为了确保荧光图像背景信号和杂散光最小化,以便对 PLA 事件进行下游分析(特别是在宽场显微镜上),使用二维反卷积(最近邻)算法处理图像。标准图像处理软件的选择。
注:对于奥林巴斯使用CellSens,尼康使用NIS元素,莱卡使用LAS X,蔡司+ ZEN,变形,MATLAB,惠更斯软件,以及几个插件可以通过图像-J。为了进行分析,应使用 Image-J 软件分析所有 z 堆栈上的交互总数,确保仅分析 Pdx-1 阳性单元(第 3.5 节)。
- 解放军互动的量化
- 打开免费的Image-J软件应用程序,并打开解放军图像。从第一个尖锐的聚焦的解放军形象开始。
- 单击图像选项卡,然后选择调整,然后选择阈值(图 1A)。调整阈值以删除所有非特定 PLA 信号,记下阈值调整,并尝试在整个分析过程中保持一致。
- 单击进程选项卡,然后选择二进制,然后制作二进制(图 1B)。使用二进制图像测量粒子,通过单击"分析"选项卡并按分析粒子(图1C)。
- 为了进行分析,请确保设置如下:大小= 0=无穷大,循环度= 0=1.0,显示= 轮廓,显示结果复选框,以及清除结果(图 1D)。单击"确定"。记下在表示样本的电子表格中分析的粒子数和 z 堆栈位置。
- 重复步骤 3.5.2~3.5.4,直到分析样品的所有聚焦 z 堆栈。将电子表格中样本的粒子总数相和,以量化交互的总数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们在MIN6胰腺β细胞系和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y进行了初步实验,以优化和确认抗体的特异性和可视化的蛋白质相互作用。MIN6细胞以30,000个细胞/mL镀在盖玻片上,并留下粘附48小时,SH-SY5Y细胞以15,000个细胞/mL镀在盖玻片上,然后留在附着24小时。然后,从步骤 1.2.3 开始,遵循了上述 PLA 协议。为了确保PLA信号的特异性,我们首先在(i)没有原抗体(图2A,图3A),(二)仅NRDP1抗体(图2B,图3B),(三)USP8抗体(图2C,图3C和(iv)NRDP1和USP8抗体(图2D,图3D)。为了便于设置示例,表 1表示如何正确布局实验控件。值得注意的是,我们在单原抗体或无原抗体控制条件下观察无单斑PLA信号,从而确认在MIN6和MIN6和MIN6和MIN6和SH-SY5Y 细胞。
接下来,我们调整了这种方法,以便与人类胰岛一起分析在原代人类β细胞内的米托巴细胞复杂相互作用。人类胰岛由功能不同的细胞组成的异质群体,包括α、β、增量和PP细胞9。与β细胞占胰岛质量+80%的小鼠胰岛相比,β细胞在人类胰岛内(在28-75%之间)中构成比例较小的范围,10、11、12。因此,我们试图利用PLA技术来观察NRDP1-USP8米托巴细胞复合物的存在,特别是贝塔细胞中的存在,并确保我们没有看到来自其他小岛细胞类型的混杂观测物(这可能来自小岛分泌物的共同免疫沉淀研究)。因此,必须确保充分和均匀的岛分散到这样的水平,使单个细胞很容易被区分和进一步分析。如图4所示,分散协议(第1节)在确保显微镜视野中的单个细胞进行下游分析方面非常有效。为了识别β细胞,我们在PLA过程中与PDX1特异性抗血清进行了共染色。PDX1是一种重要的β细胞特异性转录因子,主要存在于成熟的胰岛素生成β细胞中,主要在细胞核13内。PDX1 染色在 NRDP1:USP8 PLA 在主要人类小岛中保留(图 4)。重要的是,我们使用山羊PDX1抗血清,以避免与PLA使用的主要抗体交叉反应(兔子抗NRDP1和小鼠抗USP8,分别)。因此,添加PDX1反染色允许对原生人类β细胞内的内源性核糖核糖核化复合物进行具体评估。
利用这些方法,我们可以编译NRDP1:USP8米托巴结物复合物的保留快照,以推断β细胞内米托巴细胞通路的能力。为了扩大这种方法,在环境条件下使用模仿2型糖尿病14,我们治疗β细胞系和原人胰岛与棕榈状和高葡萄糖诱导葡萄糖毒性。事实上,我们发现,在48小时接触棕榈菌和高葡萄糖后,NRDP1和USP8的相互作用在PLA的β细胞系以及原发性人β细胞中减少(图5和参考1)。这一结果强调了该测定在诊断刺激后评估关键内源性米托巴细胞因子的可行性。
图1:图像J分析的工作流,用于解放军相互作用的量化。此处将突出显示分析的重要步骤。(A) 调整图像阈值,以确保具体的 PLA 信号分析。(B) 将图像转换为二进制数据,以便轻松量化。(C-D)如何通过分析ImageJ软件识别的粒子来完成分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:NRDP1和USP8在胰腺β细胞中专门相互作用。显示小鼠胰腺细胞系(MIN6)的高放大倍率(100倍)图像。(A-D)NRDP1:USP8交互的PLA信号以红色显示,核由DAPI以蓝色描述。(A-C)如果在PLA过程中省略了主要蛋白抗体的两个(A)或一个(B、C)的两个(B、C),则不显示NRDP1:USP8相互作用的特定信号。然而,当两种抗体都包括在内时,PLA在胰腺β细胞(D)中可以看到两种蛋白质的相互作用。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:NRDP1和USP8在神经母细胞中专门相互作用。显示人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的高倍率(100x)图像。(A-D)NRDP1:USP8交互的PLA信号以红色显示,核由DAPI以蓝色描述。(A-C)如果在PLA过程中省略了主要蛋白抗体的两个(A)或一个(B、C)的两个(B、C),则不显示NRDP1:USP8相互作用的特定信号。然而,当两种抗体都包括在内时,PLA (D) 可以看到这两种蛋白质的相互作用.请点击此处查看此图的较大版本。
图4:由解放军在原位原位的主要人类胰腺胰岛中识别β细胞性血小体复合物。显示分散的人类胰岛的高放大倍率(100倍)图像。单细胞通过核染色与DAPI(蓝色)进行划定,β细胞用PDX1染色(品红色)观察到,在β细胞和非β细胞(红色)中都可以看到米托巴结物复合物。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:NRDP1:USP8米毒复合物在β细胞中受到葡血毒性破坏。
显示使用控制(25 mM 葡萄糖 + 0.82% BSA)或高葡萄糖 + 棕榈石 (25 mM 葡萄糖 = 0.4m 棕榈石/0.82% BSA) 处理 48 h 的 MIN6 细胞的高放大倍率 (100x) 图像。(A-B)PLA (NRDP1:USP8) 信号在两个治疗组中可见。与对照组 (A ) 相比,在葡药毒性 (B)后,MIN6 β细胞的 PLA 信号减少。请点击此处查看此图的较大版本。
| 样品 | ANTIBODY 1 (鼠标抗 NRDP1) | ANTIBODY 2 (兔子抗 USP8) | ANTIBODY 3 (山羊抗 PDX1)(可选防污) |
| 控制1:无原抗体(40个小岛) | - | - | + |
| 控制 2: 仅 NRDP1 (40 个小岛) | + | - | + |
| 控制 3: 仅 USP8 (40 个小岛) | - | + | + |
| 实验 1-x:所有实验条件(每个 40 个小岛) | + | + | + |
表1:实验设计设置示例。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里,我们描述了一种简单而有效的方法,用于在感兴趣的组织/细胞中使用NRDP1:USP8 PLA,以量化上游米托巴细胞复合物的形成。我们之前通过多种方法确认在胰腺β细胞中形成CLEC16A-NRDP1-USP8米托巴细胞复合物,包括共免疫沉淀实验、无细胞相互作用研究、体外和基于细胞泛化测定,并演示了这个复杂驱动调节米托巴哈通通1,15。我们在这里报告和描述的PLA研究允许快速、定量和细胞特定地查看对原发性人类β细胞高度适应的米托巴细胞通路。此外,我们还表明,NRDP1:USP8 PLA可以适应SH-SY5Y神经母细胞细胞的β细胞生物学之外,强调了该技术在神经元系统中监测米托巴细胞复合物的潜在可行性。
解放军是一个直截了当的方法;然而,议定书中的某些步骤对于确保取得明确和具体的结果至关重要。这些包括:(1)确保人类胰岛的分散程序足够温和,以防止细胞赖清/损伤以优化图像,(2)在固定前和在哺乳期间添加二苯基辛酶抑制剂PR619,以保存NRDP1-USP8 复合物的泛化状态(并因此具有约束力),用于解放军的最大信号观测,(3) ImageJ 对 PLA 事件进行客观量化,以确保对米托巴结物进行公正评估,并允许确定米托巴食症的变化可能不完整,但仍具有统计学意义/生物学相关。
人类小岛研究中一个众所周知的挑战是β细胞和非β细胞的异质种群。我们使用 PDX1 反染色可以评估β细胞(以及PDX1阴性非β细胞)内的米托巴结复合形成。利用PDX1作为反伤的一个潜在问题是它在胰腺三角洲细胞16、17、18中的表达,尽管其表达程度远低于β细胞,因为其他标记物(即NKX6.1)可用于更具体地瞄准β细胞。通过在细胞离心和固定之前将完整胰岛分散到单个细胞中,我们还能够在药物治疗和/或药物治疗过程中仅对胰岛微环境进行最小干扰的单细胞密细胞性研究葡绿醇毒性暴露。然而,我们不能排除小岛分散可能干扰细胞内的米托巴结物的可能性,而不受相关治疗的影响。
虽然更传统的蛋白质-蛋白质相互作用研究可用于人类胰腺胰岛,如共免疫沉淀和/或蛋白质组学方法,但这些程序通常需要大量的胰岛解液,这可能证明具有挑战性鉴于可用的人类小岛材料的稀缺性。此外,在这些传统技术中,细胞类型特异性问题变得更加明显,或者需要进一步优化流式细胞测定方法,以对纯β细胞群进行分类19、20, 21,22.因此,我们的PLA方法为人类β细胞中米托巴细胞通路的蛋白质-蛋白质相互作用研究提供了一个有吸引力的和实用的替代方法。值得注意的是,每个实验使用多达40个总胰岛/条件来量化数千个单个β细胞中的米托巴细胞复杂形成的能力,使胰岛研究人员能够保存其胰岛制剂,用于来自同一个捐赠者。
由于NRDP1和USP8被普遍表达,我们推测这种技术可能具有评估β细胞以外的细胞类型的米托巴细胞的价值。可能性包括其他小岛细胞类型(与阿尔法细胞或增量细胞相关的计数器染色)或严重依赖米托巴的细胞类型,如神经元。为此,我们对该技术对SH-SY5Y神经母细胞(图2)或PDX1阴性小岛细胞(图4)的可转移性进行观察,可以表明我们该技术在其他细胞类型中对于小细胞通路的效用。
尽管 NRDP1:USP8 PLA 方法简单易近,但有些挑战可能会混淆此测定的结果。虽然PLA能够确定蛋白质-蛋白质相互作用在非常接近(40纳米),它不排除某些实验条件可以保持NRDP1-USP8接近,同时中断相互作用的可能性,这将错过PLA 方法。此外,尽管我们已经证明NRDP1:USP8复杂形成是胰腺β细胞中规范的CLEC16A/PARKIN-米托巴细胞通路的有效读出,但最近的研究已经观察到了PARKIN独立线粒体在线粒体中的作用质量控制23,24.我们还不知道NRDP1:USP8复杂地层如何因PARKIN独立米托巴的中断而改变。因此,使用一种补充方法,超越此处描述的方法来测定β细胞中的米托巴细胞是可取的。最后,这种米托巴复合物的稳定性取决于组分蛋白的泛化,因此添加广谱二苯基酶抑制剂PR619对于在样品制备期间保持泛化至关重要。同样,在分析NRDP1:USP8作为米托巴细胞复杂形成读物时,需要考虑对可能间接破坏NRDP1-USP8复杂成分的泛化的β细胞的操作。
由于线粒体质量控制的作用不仅在β细胞功能,而且在其他高代谢细胞类型中越来越受到重视,因此,对线粒体进行严格评估,对于希望更快速的细胞群来说,这种严格评估可能具有挑战性和耗时性。评估关键的米托巴人成分。我们描述的PLA方法是一种成本相对较低的分子级可视化技术,可在少量人类小岛样品中提供单细胞分辨率的米托巴结复合型定量分析,并可广泛应用各种细胞类型、治疗方法或疾病。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢JDRF(CDA-2016-189和SRA-2018-539)、国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所、国家卫生研究院(R01-DK-108921)、布雷姆家族和安东尼家族的资助。JDRF职业发展奖由丹麦糖尿病学院获得部分支持,该学院由诺和诺德基金会支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
