Summary
Этот протокол излагает метод количественного анализа образования митофагии протеинового комплекса, специально в бета-клетках из первичных образцов человека- иаклетов. Этот метод, таким образом, позволяет анализ митофагии из ограниченного биологического материала, которые имеют решающее значение в драгоценных человеческих образцов бета-клеток поджелудочной железы.
Abstract
Митофагия является важным митохондриальным пути контроля качества, который имеет решающее значение для поджелудочной железы газа бета-клеток биоэнергетики для топлива глюкозы стимулировали высвобождение инсулина. Оценка митофагии является сложной задачей и часто требует генетических репортеров или несколько дополнительных методов не легко использовать в образцах тканей, таких как первичные островки поджелудочной железы человека. Здесь мы демонстрируем надежный подход к визуализации и количественной оценке формирования ключевых эндогенных митофагических комплексов в первичных островках поджелудочной железы. Используя чувствительный метод перевязки близости для обнаружения взаимодействия регуляторов митофагии NRDP1 и USP8, мы можем специально количественно определить формирование основных митофагных комплексов на месте. Соединяя этот подход к противодействию транскрипции факторPDX1, мы можем количественно митофагических комплексов, и факторы, которые могут ухудшить митофагии, в частности, в бета-клетки. Методология, которая мы описываем, преодолевает потребность в больших количествах клеточных экстрактов, необходимых для других исследований взаимодействия белково-белкового взаимодействия, таких как иммунопреципиция (ИС) или масс-спектрометрия, и идеально подходит для драгоценных образцов человека, как правило, не в достаточном количестве для этих подходов. Кроме того, эта методология устраняет необходимость в методах сортировки потоков для очистки бета-клеток от неоднородной популяции островков для применения белка ниже по течению. Таким образом, мы описываем ценный протокол для визуализации митофагии, хорошо совместимых для использования в разнородных и ограниченных популяциях клеток.
Introduction
Бета-клетки поджелудочной железы производят инсулин, необходимый для поддержания нормального гомеостаза глюкозы, и их неудача приводит к развитию всех форм диабета. Бета-клетки сохраняют надежную митохондриальную способность генерировать энергию, необходимую для сочетания метаболизма глюкозы с высвобождением инсулина. В последнее время стало очевидно, что поддержание функциональной митохондриальноймассы имеет ключевое значение для оптимальной функции бета-клеток 1,2,3. Для поддержания функциональной митохондриальной массы бета-клетки полагаются на механизмы контроля качествадля удаления дисфункциональных, поврежденных или стареющих митохондрий 4. Мы и другие ранее показали, что бета-клетки полагаются на специализированную форму митохондриального оборота, называемую митохондриальной аутофагией (или митофагией), для поддержания контроля качества митохондрии как у грызунов, так и у человека островков1, 2,5. К сожалению, однако, не было простого способа обнаружения митофагии, или эндогенно выраженных митофагических компонентов, в бета-клетках поджелудочной железы человека.
Недавно мы показали, что регулирование вверх по течению митофагии в бета-клетках опирается на формирование белкового комплекса, включающего E3 лигазаclees CLEC16A и NRDP1 и deubiquitinase USP81. NRDP1 и USP8 были показаны независимо, чтобы повлиять на митофагию через действие на ключевой митофаг иинициатор PARKIN6,7. NRDP1 цели PARKIN для повсеместности и деградации, чтобы выключить митофагии6, и USP8 специально deubiquitinates K6 связанных PARKIN содействовать его транслокации в митохондрии7. Близость перевязки анализ (PLA) технология была недавний прогресс в области белкового взаимодействия биологии8, что позволяет визуализации эндогенных белковых взаимодействий на месте в одиночных клетках, и не ограничивается дефицитным материалом образца. Эта методология особенно заманчиво для человека островк / бета-клеточной биологии, в связи с редкостью наличия образцов, в сочетании с необходимостью понимания физиологически значимых белковых комплексов в неоднородных типов клеток.
Используя подход PLA, мы можем наблюдать ключевые комплексы эндофагии в первичных бета-клеток поджелудочной железы человека и нейрональных клеточных линий, и продемонстрировать влияние диабетогенной среды на митофагическом пути1. Таким образом, главной целью этого протокола является анализ конкретных митофагных белковых комплексов в тканях, не хватает обильного материала, или где обычные исследования взаимодействия белка невозможны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование де-идентифицированных донорских островков поджелудочной железы человека через Институциональный наблюдательный совет (IRB) освобождение и в соответствии с Мичиганского университета IRB политики. Островки поджелудочной железы были предоставлены NIH/NIDDK спонсируемой Комплексной программой распределения островок (IIDP).
1. Подготовка образца человеческого именноадора
-
Диссоциация одноклеточных ячеек
- Образцы культуры человека- иофорта (4000-6000 эквивалентов газолетов/10 мл носителей) в течение не менее 1 дня при 37 градусах Цельсия в поджелудочной железе, атакжеме - 1 мМ глутамина (PIM(G)), 100 единиц/мл противоопухолево-антибиотико-антибиотик, 1 мм натриевый пирруватый и 10- сыворотка (FBS) или сыворотка АБ человека.
- Используйте световой микроскоп для вскрытия при 3-х увеличении, чтобы подсчитать отдельные островки человека от культуры. Выберите 40 островков за лечение/состояние интереса (например, глюколипототоксичность) в 1,5 мл труб оков в островках.
- Островки Центрифуги при 400 х г в течение 1 мин при 10 градусах По цельсию до осадка.
- Вымойте образцы, путем краткой инверсии труб при комнатной температуре, дважды с 1 мл фосфата буферного соления (PBS), содержащего 50 мкм PR619 (ингибитор деубицициназы; для сохранения убиквитин зависимых белков ы влицаниях), с центрификацией между каждой стирки при 400 х г в течение 1 мин при 10 градусах По цельсию.
- Диссоциативные островки на одиночные клетки с 125 йл 0,25% трипсин, содержащий 50 мкм PR619 путем инкубации предварительно разогретого трипсина (37 градусов по Цельсию) в течение 3 мин с островковыми гранулами. Аккуратно рассеять островки в течение этого времени с периодическим нежным трубачом с помощью 200 л пипетки.
- Утолить трипсин с 1 мл разогретого (37 градусов по Цельсию) PIM (S) медианов, содержащих 50 мкм PR619, затем осадочных клеток центрифуги на 400 х г в течение 1 мин.
- Вымойте клетки центрифугированием при 400 х г в течение 1 мин, дважды, с PBS 50 мкм PR619.
- Наконец, повторное присоединение клеток в 150 МЛ PBS, содержащий 50 мкм PR619.
-
Одноклеточная присоединение и фиксация
- После повторного приостановки, спина клеточного раствора на матовый, заряженный, микроскоп слайды с помощью cytocentrifuge на 28 х г в течение 10 минут.
- После цитоцентрифугирования, наброски клеточной области с гидрофобной ручкой (см. Таблица материалов), чтобы свести к минимуму антитела / PLA объемы решения необходимо. Исправьте клетки с 4% параформальдегидом в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ: PFA является опасным и должны быть обработаны с осторожностью. - Для достижения наилучших результатов, выполнять окрашивания / PLA немедленно, или в течение 24 ч. При необходимости храните образцы в PBS при 4 градусах Цельсия до окрашивания не более 48 ч.
2. Иммуногистохимия
-
Блокировки
- Вымойте клетки дважды с 1x PBS в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Блок клеточного раствора, чтобы устранить фоновое окрашивание, с 10% осла сыворотки в PBS, содержащий 0,3% моющего средства (см. таблицу материалов) для 1 ч при комнатной температуре.
-
Окрашивания
- Инкубировать клетки с первичной мыши или кролика антитела против USP8 (1:250) и NRDP1 (1:250) соответственно (см. Таблица материалов) разбавленный в фосфатных буферных сосудистой с моющим средством (PBT, см. Таблица материалов), на 4 кв ночь, чтобы обнаружить митофагию комплекса сигнализации через PLA.
- Совместное инкубировать клетки с маркером, специфичным для идентификации бета-клеток, который не был поднят в мыши или кролика, чтобы не вмешиваться в сигнал PLA. В этом случае инкубируют клетки с антикозом PDX1 (1:500) в ПБТ. Инкубировать все первичные антитела на ночь при 4 градусах Цельсия, используя пластиковую пленку поверх раствора, чтобы предотвратить испарение.
3. Перегоняемый асссирование близости
- ЗОНД НОАК и контрпятно
- Подготовьте решение зонда PLA в соответствии с инструкциями производителя, т.е. сделайте 20 л зонда раствора на образец, подготовив окончательную концентрацию раствора 1:5 как анти-мышонка, так и анти-кроличьего зонда в PBT, и инкубируя в течение 20 минут в помещении Температура.
- После ночной инкубации, мыть клетки дважды с 1x PBS в течение 5 минут каждый, на рокер.
- Непосредственно перед инкубации с зондом решение, добавить анти-коза Cy5 вторичной в окончательной концентрации 1:600 в зонд решение (для обнаружения эндогенных PDX1). Добавьте 20 раствор зонда к каждому состоянию клетки, аккуратно накройте пластиковой пленкой и инкубируйте при 37 градусах По кв. м в течение 1 ч.
- Перевязка
- Вымойте клетки дважды, при комнатной температуре, с буфером A (см. таблицу материалов для рецепта) в течение 5 минут каждый, на рокер.
- Приготовьте раствор перевязки (часть реагентов обнаружения, см. Таблицаматериалов) в соответствии с инструкциями производителя. Для этого разбавляют запас перевязки (5x) 1:5 в диэтил-пиробкарбонат (DEPC) очищенной воде. Непосредственно перед инкубации добавить 0,025 U/mL лигазы. Добавьте в клетки раствор перевязки 20 л. Накройте пластиковой пленкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
- Усиления
- Вымойте клетки дважды при комнатной температуре с буфером А в течение 2 мин каждый.
- Сделать усиливающих раствор (часть обнаружения реагентов, см. Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Разбавить буфер усиления (5x) 1:5 в DEPC-обработанной воды и держать в темноте до использования. Добавьте 1:80 разбавления полимераза (часть обнаружения реагентов, см. Таблица материалов) в раствор непосредственно перед добавлением раствора в клетки.
- Добавьте в клетки 20 злификации раствора. Накройте пластиковой пленкой и поместите в темноту при 37 градусах По цельсии в течение от 1 ч 40 мин до 2 ч для максимального сигнала.
- Подготовка к визуализации
- Вымойте клетки дважды с буфером B (см. таблицу материалов для рецепта) в течение 10 минут при комнатной температуре, на рокер.
- Наконец, мыть клетки один раз в 0.01x Буфер B, в течение 2 минут при комнатной температуре на рокер.
- Маунт образцы, добавив каплю монтажа средств массовой информации, содержащие 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) и тщательно размещения coverslip над образцами с помощью скальпеля лезвие, чтобы выжать любые пузырьки образуются. Печать покрывает липы с помощью прозрачного лака для ногтей по краям.
- Образцы изображений на микроскопе, способном захватывать несколько фокусных плоскостей, такие как лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, или перевернутый флуоресцентный микроскоп с возможностями деконволюции, принимая по крайней мере 9 различных изображений фокусной плоскости.
- Захват изображений на 100-кратный увеличение, с примерно 0,45 мм z-стек высоты. Захват PLA на 550 нм возбуждение, 570 нм выбросов; противопяте пятно при возбуждении 650 нм, 670 нм выбросов; и DAPI при 405 нм возбуждении, 450 нм выбросов.
- Для обеспечения флуоресценции фоновых сигналов изображения и рассеянного света сведены к минимуму для анализа событий НОАК (особенно на широкоугольных микроскопах), обработка изображений с использованием двухмерного алгоритма деконволюции (ближайшего соседа) с помощью стандартное программное обеспечение для обработки изображений по выбору.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для Olympus использовать CellSens, Nikon использовать NIS-Элементы, Leica использовать LAS X, Зейсс - ЗЕН, Метаморф, MATLAB, Гюйгенс программного обеспечения, а также несколько плагинов доступны через Image-J. Для анализа следует проанализировать общее количество взаимодействий по всем z-стоимам с помощью программного обеспечения Image-J, обеспечив анализ только положительных ячеек Pdx-1 (раздел 3.5).
- Количественная оценка взаимодействий НОАК
- Откройте бесплатное программное приложение Image-J и откройте изображение PLA. Начните с первого резко в фокусе НОАК изображения.
- Нажмите на вкладку изображения, и выберите настроить,то порог (рисунок1A). Отрегулируйте порог, чтобы удалить все неспецифические сигналы PLA, сделайте примечание корректировки порога и попытайтесь сохранить его последовательным на протяжении всего анализа.
- Нажмите на вкладку процесса, и выберите двоичный, а затем сделать двоичный (Рисунок1B). Используйте двоичное изображение для измерения частиц,нажав на вкладку "анализировать" и нажимая частицы (рисунок1С).
- Для анализа убедитесь, что настройки следующие: Размер 0-Бесконечность, Круговая no 0-1.0, Показать - Очертания, флажки для результатов отображения,и четкие результаты (рисунок1D). Нажмите OK. Обратите внимание на количество частиц, проанализированных в электронной таблице, обозначающих образец, и положение z-stack.
- Повторите шаги 3.5.2-3.5.4 до тех пор, пока не будут проанализированы все фокус-стеки z для выборки. Сумма общее количество частиц для образца в таблице количественнообщее количество взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели первоначальные эксперименты в линии бета-клеток поджелудочной железы MIN6 и линии нейробластомы SH-SY5Y SH-SY5Y, чтобы оптимизировать и подтвердить как специфичность антител, так и визуализированные белковые взаимодействия. Клетки MIN6 были покрыты крышками на крышках на 30000 клетках/мл и оставлены придерживаться в течение 48 ч, SH-SY5Y клетки были покрыты на крышки на 15000 клеток / мл и оставили придерживаться в течение 24 ч. Протокол НОАК затем следовал, как выше, начиная с шага 1.2.3. Для обеспечения специфики сигналов НОАК, мы впервые выполнили этот подход в присутствии (i) нет первичного антитела (Рисунок 2A, Рисунок 3A), (ii) NRDP1 антитела в одиночку (Рисунок 2B, Рисунок 3B), (iii) USP8 антитела в одиночку ( Рисунок 2C, Рисунок 3C, и (iv) как NRDP1 и USP8 антител (Рисунок2D, Рисунок 3D). Для простоты настройки образца таблица 1 обозначает, как правильно макетировать экспериментальные элементы управления. Примечательно, что мы не наблюдаем пунктуатный сигнал PLA в одном первичном антителах или нет первичных условий контроля антител, тем самым подтверждая, что на месте взаимодействия конкретно наблюдаются между NRDP1 и USP8 в присутствии обоих первичных антител, как в MIN6, так и в SH-SY5Y клетки.
Затем мы адаптировали этот подход для использования с островками человека для анализа митофагных сложных взаимодействий, специально в рамках первичных бета-клеток человека. Островки человека состоят из неоднородной популяции функционально различных клеток, включая альфа, бета, дельту и PP-клетки9. В отличие от островков мыши, где бета-клетки составляют 80% массы островка, бета-клетки составляют пропорционально меньший диапазон внутри островков человека (между 28-75%)10,11,12. Таким образом, мы стремились использовать технологию PLA, чтобы позволить нам наблюдать за наличием митофточных комплексов NRDP1-USP8, специально в бета-клетках, и убедиться, что мы не наблюдали противоречивых наблюдений от других типов клеток на идохе (которые могли произойти из совместное иммунопрецистиционное исследование лизатов). Таким образом, важно обеспечить адекватную и единую дисперсию на изо, что одиночные ячейки могут быть легко дискриминированы и дополнительно проанализированы. Как видно на рисунке 4, протокол дисперсии (раздел 1) является весьма эффективным при обеспечении одиночных клеток в поле зрения микроскопа для анализа вниз по течению. Для определения бета-клеток, мы выполнили совместное окрашивание с PDX1 конкретных анти-сера во время процесса PLA. PDX1 является жизненно важным бета-клеток конкретных транскрипции фактор, который находится в зрелых инсулин-производящих бета-клеток в первую очередь в ядре13. PDX1 окрашивание было сохранено после NRDP1:USP8 PLA в первичных человеческих островков(Рисунок 4). Важно отметить, что мы использовали коза PDX1 анти-сера, чтобы избежать перекрестной реактивности с первичными антителами, используемыми для PLA (кролик анти-NRDP1 и мыши анти-USP8, соответственно). Таким образом, добавление противоядия PDX1 позволяет проводить специальную оценку эндогенных митофагных комплексов в первичных бета-клетках человека.
Используя эти подходы, мы можем составить снимок удержания митофагии NRDP1:USP8, чтобы сделать вывод о компетентности митофагического пути в бета-клетках. Чтобы расширить этот подход для использования в условиях окружающей среды эмуляции тех, типа 2 диабета14, мы лечили бета-клеточных линий и первичных человеческих островков с palmitate и высокой глюкозы, чтобы вызвать глюколипотоксичность. Действительно, мы обнаружили, что взаимодействие NRDP1 и USP8 было уменьшено после 48 ч воздействия пальмитата и высокой глюкозы в обеих бета-клеточных линий, а также первичных бета-клеток человека ПО PLA (Рисунок 5 и ссылка1). Этот результат подчеркивает осуществимость этого такого результата для оценки ключевых эндогенных факторов митофагии после диабетогенных стимулов.
Рисунок 1: Рабочий процесс анализа изображения J для количественной оценки взаимодействий НОАК. Здесь выделены важные шаги анализа. (A) Корректировка порога изображения для обеспечения конкретного анализа сигнала PLA. (B) Преобразование изображения в двоичные данные, чтобы легко количественно. (C-D) Как завершить анализ, анализируя частицы, распознаемые программным обеспечением ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: NRDP1 и USP8 специально взаимодействуют в бета-клетках поджелудочной железы. Высокое увеличение (100x) изображения мыши поджелудочной линии клеток, MIN6, показаны. (A-D) Сигнал PLA для взаимодействия NRDP1:USP8 отображается красным цветом, а ядра очерчены DAPI синим цветом. (A-C) Нет конкретного сигнала пунктуата для взаимодействия NRDP1:USP8 видно, если оба (A) или любой из (B, C) первичных антител белка опущены во время процесса PLA. Тем не менее, взаимодействие обоих белков видно НОАКв бета-клетки поджелудочной железы (D ), когда оба антитела включены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: NRDP1 и USP8 специально взаимодействуют в клетках нейробластомы. Показано высокое увеличение (100x) изображений клеточной линии нейробластомы человека, SH-SY5Y. (A-D) Сигнал PLA для взаимодействия NRDP1:USP8 отображается красным цветом, а ядра очерчены DAPI синим цветом. (A-C) Нет конкретного сигнала пунктуата для взаимодействия NRDP1:USP8 видно, если оба (A) или любой из (B, C) первичных антител белка опущены во время процесса PLA. Тем не менее, взаимодействие обоих белков видно ПО PLA (D), когда оба антитела включены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Бета-клеточные митофагийные комплексы могут быть определены в первичных островков поджелудочной железы человека на месте НОАК. Показано высокое увеличение (100x) изображений рассеянных островков человека. Одиночные клетки очерчены ядерным окрашиванием с DAPI (синим), бета клетки наблюдаются с PDX1 окрашиванием (magenta), и митофагии комплексы можно увидеть как в бета-клетки и небета клеток (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Митофагический комплекс NRDP1:USP8 дестабилизируется в бета-клетках глюколипотоксичностью.
Показано высокое увеличение (100x) изображения клеток MIN6, обработанных для обработки 48 ч с либо контролем (25 мМ глюкозы и 0,82% BSA), либо высоким содержанием глюкозы и пальмитатом (25 мм глюкозы 0,4 мм пальмитат/0,82% BSA). (A-B) Сигнал PLA (NRDP1:USP8) виден в обеих группах лечения. НОАК сигнал уменьшается в mIN6 бета-клеток после глюколипотоксичности (B) по сравнению с элементами управления (A ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Образец | ANTIBODY 1 (мышь анти-NRDP1) | ANTIBODY 2 (кролик против USP8) | ANTIBODY 3 (коза анти-PDX1) (Необязательный противопят) |
| КОНТРОЛ 1: Нет первичных антител (40 островков) | - | - | + |
| КОНТРОЛЬ 2: NRDP1 в одиночку (40 островков) | + | - | + |
| КОНТРОЛЬ 3: USP8 в одиночку (40 островков) | - | + | + |
| EXPERIMENTAL 1-x: все экспериментальные условия (по 40 островков) | + | + | + |
Таблица 1: Пример экспериментальной настройки дизайна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем простой и эффективный подход к использованию NRDP1:USP8 PLA в тканях/клетках, представляющих интерес для количественной оценки формирования высокопотечения митофагических комплексов. Ранее мы подтвердили формирование CLEC16A-NRDP1-USP8 митофагии комплекса в бета-клеток поджелудочной железы по нескольким методологиям, в том числе совместноиммунопреционных экспериментов, клеток свободного взаимодействия исследований, а также в пробирке, а также на основе клеток убиквитинация анализы, и продемонстрировал, как этот комплекс дисков регулируется митофагический поток1,15. Исследования НОАК, которые мы сообщаем и описываем здесь, позволяют быстро, количественно и клеточное представление митофагии, который хорошо адаптируется к первичным бета-клеткам человека. Кроме того, мы показали, что NRDP1:USP8 PLA могут быть адаптированы для использования вне бета-клеточной биологии в клетках нейробластомы SH-SY5Y, подчеркивая потенциальную осуществимость этого метода для мониторинга митофагных комплексов в нейронных системах.
НОАК является простым подходом; однако определенные шаги в рамках протокола имеют первостепенное значение для обеспечения четких и конкретных результатов. К ним относятся: (1) обеспечение процедуры разгона для человека островки является достаточно мягким, чтобы предотвратить лиза клетки / повреждения для оптимизации изображений, (2) добавление ингибитора деубицициназы, PR619, непосредственно перед фиксацией и во время стиха, чтобы сохранить убиквитинация государства (и, следовательно, обязательным) комплекса NRDP1-USP8 для максимального наблюдения сигнала НОАК, и (3) объективная количественная оценка событий НОАК ImageJ для обеспечения объективной оценки митофагных комплексов, а также позволяют определить условия, при которых изменения на митофагии не могут быть полными, но все еще статистически значимыми/биологически актуальными.
Известная проблема в исследованиях островка человека забота для неоднородности населенности обоих бета клеток и non-beta клеток. Использование противоголопосудом PDX1 позволяет оценить образование митофагии в бета-клетках (а также отрицательных небета-клеток PDX1). Одной из потенциальных проблем, используя PDX1 в качестве контрпятна является его выражение в клетках дельты поджелудочной железы16,17,18, хотя и в гораздо более низкой степени, чем в бета-клетки, как такие другие маркеры (т.е., NKX6.1) могут быть использованы для целевые бета-клетки более конкретно. Путем рассеивания нетронутых островков в одиночные клетки непосредственно перед цитоцентррифированием и фиксацией, мы также можем выполнять одноклеточные митофагии исследования с минимальным нарушением микроокружения островка в ходе лечения наркотиками и/или гюколипотового воздействия. Тем не менее, мы не можем исключить возможность того, что дисперсия происходит может помешать митофагическим комплексам в клетках независимо от соответствующих методов лечения.
В то время как более традиционные исследования взаимодействия белка-белка могут быть использованы в человеческих островках поджелудочной железы, таких как совместное иммунопрецициционирование и /или протеомные подходы, эти процедуры обычно требуют большого количества лизата островка, который может оказаться сложным с учетом нехватки человеческого конечного материала. Кроме того, озабоченность клеточной тип-специфическость во время этих традиционных методов становится более очевидным или требует дополнительной оптимизации потока цитометрии методы сортировки чистой популяции бета-клеток19,20, 21,22. Таким образом, наш подход PLA обеспечивает привлекательную и практическую альтернативу для белково-белкового взаимодействия исследований митофагии пути в бета-клетках человека. Примечательно, что возможность использовать всего 40 островков/условий за эксперимент для количественной оценки формирования митофагийного комплекса в тысячах отдельных бета-клеток позволяет исследователям островка сохранить их островков для других оценок от тот же донор.
Поскольку NRDP1 и USP8 повсеместно выражены, мы полагаем, что этот метод может иметь значение для оценки митофагии в типах клеток за пределами бета-клеток. Возможности включают в себя другие типы клеток на иагорах (с соответствующими контрпятнами для альфа-клеток или дельтовых клеток) или типы клеток, которые в значительной степени полагаются на митофагию, такие как нейроны. С этой целью, наше наблюдение о переносимости этого метода SH-SY5Y нейробластомы клеток(Рисунок 2) или PDX1-отрицательных клеток аклетов (Рисунок 4) может предложить полезность нашей техники для митофагии пути в других типах клеток.
Несмотря на легкость и простоту подхода NRDP1:USP8 PLA, существуют проблемы, которые могут смущь результаты этого исследования. Хотя НОАК способна выявлять взаимодействия белка и белка в непосредственной близости (40 нм), это не исключает возможности того, что некоторые экспериментальные условия могут поддерживать близость NRDP1-USP8, нарушая взаимодействие, которое будет упущено Подход НОАК. Кроме того, в то время как мы показали, что NRDP1:USP8 комплекс образования является действительным считыватель для канонических CLEC16A/PARKIN-митофагии пути в бета-клетки поджелудочной железы, последние исследования наблюдали роли ДЛЯ PARKIN-независимых митофагии в митохондриальной контроль качества23,24. Мы пока не знаем, как изменяется формирование комплекса NRDP1:USP8 из-за нарушения parkIN-независимой митофагии. Таким образом, было бы целесообразно использовать дополнительный подход, помимо описанных здесь, для того, чтобы рассказать митофагию в бета-клетках. Наконец, стабильность этого митофагионного комплекса зависит от убиквитина белков компонентов, так что добавление широкого спектра ингибитора деубитиназы ДЕ619 имеет решающее значение для поддержания убликвитина при подготовке образцов. Опять же, при анализе NRDP1:USP8 необходимо учитывать манипуляции бета-клетки, которые могут косвенно нарушить униквитинацию компонентов комплекса NRDP1-USP8.
Поскольку роль контроля качества митохондриального качества все больше ценится не только в функции бета-клеток, но и в других высоко метаболических типах клеток, строгая оценка митофагии может оказаться сложной и трудоемкой для групп, желающих более быстрого оценка важнейших компонентов митофагии. Подход НОАК, который мы описываем, является относительно недорогим методом визуализации молекулярного уровня, который может обеспечить количественный анализ митофагического комплексного образования с одноклеточным разрешением в небольшом количестве образцов на газона хасока и может быть широко применен к различным типам клеток, лечения или заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают финансовую поддержку со стороны JDRF (CDA-2016-189 и SRA-2018-539), Национального института диабета и болезней пищеварения и почек, Национальных институтов здравоохранения (R01-DK-108921), семьи Брем и семьи Энтони. Премия JDRF по развитию карьеры s.A.S. частично поддерживается Датской академией диабета, которая поддерживается Фондом Ново Нордиска.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
