Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقة للتحليل الكمي لتكوين مجمع البروتين الميتوباجي على وجه التحديد في خلايا بيتا من عينات الشُعيل البشرية الأولية. وبالتالي تسمح هذه التقنية بتحليل mitophagy من المواد البيولوجية المحدودة، والتي هي حاسمة في عينات خلايا بيتا البنكرياس البشرية الثمينة.
Abstract
Mitophagy هو مسار أساسي لمراقبة جودة الميتوكوندريا، وهو أمر بالغ الأهمية للطاقة الحيوية لخلايا بيتا في زيت البنكرياس لتغذية الأنسولين المحفز للجلوكوز. تقييم mitophagy هو التحدي وغالبا ما يتطلب الصحفيين الوراثية أو تقنيات تكميلية متعددة لا تستخدم بسهولة في عينات الأنسجة، مثل الجزر البنكرياس البشرية الأولية. هنا نبرهن على نهج قوي لتصور وتحديد تشكيل المجمعات الانقسامية الذاتية الرئيسية في جزر البنكرياس البشرية الأولية. باستخدام تقنية اختبار الربط القرب الحساسة للكشف عن التفاعل بين المنظمين mitophagy NRDP1 و USP8، ونحن قادرون على تحديد كمية تشكيل المجمعات mitophagy الأساسية في الموقع. من خلال اقتران هذا النهج لمكافحة البقع لعامل النسخ PDX1، يمكننا قياس المجمعات mitophagy، والعوامل التي يمكن أن تضعف mitophagy، وعلى وجه التحديد داخل خلايا بيتا. المنهجية التي نصفها تتغلب على الحاجة إلى كميات كبيرة من المستخلصات الخلوية اللازمة لدراسات التفاعل البروتينالبروتيني الأخرى، مثل الترسيب المناعي (IP) أو قياس الطيف الكتلي، وهي مثالية لعينات جزر الإنسان الثمينة عموما لا المتاحة بكميات كافية لهذه النهج. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية تبطل الحاجة إلى تقنيات فرز التدفق لتنقية خلايا بيتا من مجموعة من الislet غير المتجانسة لتطبيقات البروتين في المصب. وهكذا، فإننا نصف بروتوكول قيمة لتصور mitophagy متوافقة للغاية للاستخدام في مجموعات الخلايا غير متجانسة ومحدودة.
Introduction
تنتج خلايا بيتا البنكرياس الأنسولين المطلوب للحفاظ على التوازن الجلوكوز الطبيعي، ويؤدي فشلها في تطوير جميع أشكال مرض السكري. تحتفظ خلايا بيتا بقدرة الميتوكوندريا القوية لتوليد الطاقة اللازمة لاقتران استقلاب الجلوكوز بالإفراج عن الأنسولين. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن الحفاظ على كتلةالميتوكوندريا الوظيفية هو من الأهمية المحورية لوظيفة خلية بيتا الأمثل 1،2،3. من أجل الحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية، تعتمد خلايا بيتا على آليات مراقبة الجودة لإزالة الميتوكوندريا المختلة أو التالفة أو الشيخوخة4. لقد أثبتنا نحن وآخرون في السابق أن خلايا بيتا تعتمد على شكل متخصص من دوران الميتوكوندريا، يسمى الميتوكوندريا أوتوفاجي (أو الميتوثاجي)، للحفاظ على مراقبة جودة الميتوكوندريا في كل من القوارض والجزر الصغيرة البشرية1، 2،5. لسوء الحظ، ومع ذلك، لم يكن هناك طريقة بسيطة للكشف عن mitophagy، أو المكونات mitophagy أعرب عنها داخليا، في خلايا بيتا البنكرياس البشرية.
لقد أظهرنا مؤخرا أن تنظيم المنبع من mitophagy في خلايا بيتا يعتمد على تشكيل مجمع البروتين الذي يتألف من الأربطة E3 CLEC16A وNRDP1 وdeubiquitinase USP81. وقد أظهرت NRDP1 و USP8 بشكل مستقل أن تؤثر على mitophagy من خلال العمل على مفتاح mitophagy البادئ باركين6,7. NRDP1 يستهدف PARKIN لفي كل مكان وتدهور لإيقاف mitophagy6, وUSP8 deubiquitinates K6 المرتبطة باركين لتعزيز نقلها إلى الميتوكوندريا7. وقد تم إجراء تقييم الربط القرب (PLA) التكنولوجيا مؤخرا في مجال تفاعل البروتين البيولوجيا8، مما يسمح التصور من تفاعلات البروتين الذاتية في الموقع في خلايا واحدة ، ولا يحد من المواد عينة نادرة. هذه المنهجية هي تحريضية بشكل خاص لبيولوجيا الخلايا في الislet/beta البشرية، وذلك بسبب التناسل في توافر العينات، إلى جانب الحاجة إلى فهم مجمعات البروتين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية داخل أنواع الخلايا غير المتجانسة.
الاستفادة من نهج جيش التحرير الشعبى الصينى، ونحن قادرون على مراقبة المجمعات الرئيسية الذاتية mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس البشرية الأولية وخطوط الخلايا العصبية، وتبين آثار بيئة شيطانية على مسار mitophagy1. وباختصار، فإن الهدف الشامل لهذا البروتوكول هو تحليل مجمعات بروتين ميتوثاجي محددة في الأنسجة التي تفتقر إلى مواد وفيرة، أو حيث لا يمكن إجراء دراسات تقليدية للتفاعل بين البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم استخدام الجزر البنكرياسالبشرية المانحة غير المحددة من خلال إعفاء مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) وامتثالاً لسياسة IRB لجامعة ميشيغان. تم توفير الجزر البنكرياسية البشرية من قبل برنامج توزيع الجزر المتكاملة (IIDP) الذي ترعاه المعاهد القومية للصحة/المعهد الوطني للتنمية البشرية.
1. إعداد عينة من الشهي
-
تفكك خلية واحدة
- ثقافة عينات من إيطاليات الإنسان (4000-6000 islet&10 مل وسائل الإعلام) لمدة يوم واحد على الأقل في 37 درجة مئوية في وسائل الإعلام في زيت البنكرياس (PIM(S)) وسائل الإعلام المكملة مع 1 mM الجلوتامين (PIM(G)), 100 وحدة / مل مضاد حيوي مضاد للخلايا, 1 mM الصوديوم بيروفات و 10% البقرالجنيني المصل (FBS) أو مصل AB الإنسان.
- استخدام مجهر ضوء تشريح في التكبير 3X لحساب الجزر البشرية الفردية من الثقافة. اختيار 40 جزيرة لكل علاج / حالة من الفائدة (مثل السمية glucolipo) في أنابيب 1.5 مل في وسائل الإعلام جزيرة.
- جزر الطرد المركزي في 400 × ز لمدة دقيقة واحدة في 10 درجة مئوية إلى الرواسب.
- غسل العينات، عن طريق انعكاس قصير للأنابيب في درجة حرارة الغرفة، مرتين مع 1 مل الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) تحتوي على 50 μM PR619 (مثبط deubiquitinase؛ للحفاظ على تفاعلات البروتين تعتمد على يوبيكويتين)، مع الطرد المركزي بين كل غسل في 400 x ز لمدة دقيقة واحدة عند 10 درجة مئوية.
- تمنفصل الجزر في خلايا واحدة مع 125 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين تحتوي على 50 μM PR619 عن طريق احتضان التربسين prewarmed (37 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق مع الكريات جزيرة. تفريق الجزر بلطف خلال هذا الوقت مع الأنابيب لطيف الدوري باستخدام ماصة 200 درجة مئوية.
- تبريد التربسين مع 1 مل يسخن (37 درجة مئوية) PIM (S) وسائل الإعلام التي تحتوي على 50 μM PR619، ثم خلايا الرواسب عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 1 دقيقة.
- غسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 1 دقيقة، مرتين، مع PBS + 50 درجة مئوية PR619.
- وأخيرا، إعادة تعليق الخلايا في 150 μL PBS التي تحتوي على 50 μM PR619.
-
الالتزام بالخلية الواحدة وتثبيتها
- بعد إعادة التعليق، تدور حل الخلية على متجمد، مشحونة، والشرائح المجهر باستخدام الطاردة للخلايا في 28 × ز لمدة 10 دقيقة.
- بعد cytocentrifugation، قم بمخطط المنطقة الخلوية مع قلم مضاد للمشاعر (انظر جدولالمواد) لتقليل أحجام محلول الأجسام المضادة/جيش التحرير الشعبي المطلوب. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تحذير: PFA خطرة ويجب التعامل معها بعناية. - للحصول على أفضل النتائج، وتنفيذ تلطيخ / جيش التحرير الشعبى الصينى على الفور، أو في غضون 24 ساعة. إذا لزم الأمر، تخزين عينات في PBS في 4 درجة مئوية حتى تلطيخ لمدة لا تزيد عن 48 ساعة.
2. الكيمياء المناعية
-
حظر
- غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- كتلة حل الخلية، للقضاء على تلطيخ الخلفية، مع 10٪ مصل الحمار في PBS تحتوي على المنظفات 0.3٪ (انظر جدولالمواد) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
-
تلطيخ
- حضانة الخلايا مع الماوس الأولية أو الأجسام المضادة الأرنب ضد USP8 (1:250) وNRDP1 (1:250) على التوالي (انظر جدولالمواد) المخففة في الفوسفات المخزنة المالحة مع المنظفات (PBT، انظر جدولالمواد)، في 4 °C بين عشية وضحاها، إلى الكشف عن مجمع mitophagy الإشارات عبر جيش التحرير الشعبى الصينى.
- حضانة الخلايا المشتركة مع علامة محددة لتحديد خلية بيتا التي لم يتم رفعها في الماوس أو الأرنب حتى لا تتداخل مع إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى. في هذه الحالة حضانة الخلايا مع PDX1 المضادة للماعز (1:500) في PBT. احتضان جميع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، وذلك باستخدام فيلم من البلاستيك على رأس الحل لمنع التبخر.
3. الاقتراب من الربط
- جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق ومضادة وصمة
- إعداد حل التحقيق جيش التحرير الشعبى الصينى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، أي جعل 20 درجة مئوية من حل التحقيق لكل عينة عن طريق إعداد تركيز نهائي من 1:5 الحل من كل من المضادة للماوس ومكافحة الأرنب حل التحقيق في PBT، وحضانة لمدة 20 دقيقة في الغرفة درجه الحراره.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل الخلايا مرتين مع 1X PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما، على الروك.
- قبل الحضانة مع حل التحقيق، إضافة مكافحة الماعز Cy5 الثانوية في تركيز نهائي من 1:600 إلى حل التحقيق (للكشف عن PDX1 الذاتية). إضافة 20 درجة مئوية حل التحقيق لكل حالة الخلية، وتغطي بلطف مع فيلم من البلاستيك وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- الربط
- غسل الخلايا مرتين، في درجة حرارة الغرفة، مع العازلة A (انظر جدول المواد للوصفة) لمدة 5 دقائق لكل منهما، على الروك.
- إعداد حل الربط (جزء من الكواشف الكشف، انظر جدولالمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لهذا، تمييع الأسهم الربط (5X) 1:5 في ثنائي إيثيل بايرات (DEPC) المعالجة المياه. مباشرة قبل الحضانة إضافة 0.025 U / مل ligase. إضافة 20 ميكرولتر حل الربط إلى الخلايا. تغطية مع فيلم من البلاستيك وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- التضخيم
- غسل الخلايا مرتين في درجة حرارة الغرفة مع العازلة A لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- جعل حل تضخيم (جزء من الكواشف الكشف، انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تمييع التضخيم العازلة (5x) 1:5 في المياه المعالجة DEPC والحفاظ في الظلام حتى استخدامها. إضافة تخفيف 1:80 من البوليمرات (جزء من الكواشف الكشف، انظر جدول المواد) إلى الحل مباشرة قبل إضافة الحل إلى الخلايا.
- إضافة 20 درجة مئوية من محلول التضخيم إلى الخلايا. تغطية مع فيلم من البلاستيك ومكان في الظلام في 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 1 ساعة 40 دقيقة إلى 2 ساعة للإشارة القصوى.
- التحضير للتصوير
- غسل الخلايا مرتين مع العازلة B (انظر جدول المواد لوصفة) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، على الروك.
- وأخيرا، غسل الخلايا مرة واحدة في 0.01x العازلة B، لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك.
- جبل العينات عن طريق إضافة قطرة من وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي على 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI) ووضع بعناية غطاء على العينات باستخدام شفرة مشرط للضغط على أي فقاعات شكلت. غطاء الختم باستخدام طلاء الأظافر واضحة حول الحواف.
- عينات الصور على المجهر قادرة على التقاط طائرات بؤرية متعددة، مثل المجهر البؤري المسح بالليزر، أو مجهر الفلورة المقلوب مع قدرات deconvolution، مع ما لا يقل عن 9 صور طائرة محورية مختلفة.
- التقط الصور عند تكبير 100 x، مع ارتفاع مكدس z يبلغ حوالي 0.45 مم. القبض على جيش التحرير الشعبى الصينى في 550 نانومتر الإثارة، 570 نانومتر الانبعاثات؛ مكافحة وصمة عار في 650 نانومتر الإثارة, 670 نانومتر الانبعاثات; وDAPI في 405 نانومتر الإثارة، 450 نانومتر الانبعاثات.
- لضمان تقليل إشارات خلفية صورة الفلورة والضوء الضال لتحليل المصب لأحداث جيش التحرير الشعبي (وخاصة على المجاهر واسعة النطاق)، صور عملية باستخدام الإنقوبة ثنائية الأبعاد (أقرب جار) خوارزمية من خلال خوارزمية معيار معالجة الصور البرمجيات المفضلة.
ملاحظة: لأوليمبوس استخدام CellSens, نيكون استخدام NIS-العناصر, ليكا استخدام LAS X, زايس – زين, ميتامورف, MATLAB, Huygens البرمجيات, فضلا عن العديد من الإضافات المتاحة من خلال صورة-J. للتحليل، يجب تحليل العدد الإجمالي للتفاعلات عبر كافة مكدسات z باستخدام برنامج Image-J، مما يضمن تحليل الخلايا الإيجابية Pdx-1 فقط (القسم 3.5).
- التحديد الكمي لتفاعلات جيش التحرير الشعبي
- افتح تطبيق برنامج Image-J المجاني، وافتح صورة PLA. تبدأ من أول صورة جيش التحرير الشعبى الصينى بشكل حاد في التركيز.
- انقر فوق علامة التبويب صورة، وحدد ضبط، ثم عتبة (الشكل1A). ضبط العتبة لإزالة جميع إشارات جيش التحرير الشعبي غير محددة، وتقديم مذكرة من تعديل عتبة ومحاولة للحفاظ على اتساق طوال التحليل.
- انقر فوق علامة التبويب عملية، وحدد ثنائي، ثم جعل ثنائي (الشكل1B). استخدام الصورة الثنائية لقياس الجسيمات، عنطريق النقر على "تحليل" علامة التبويب والضغط تحليل الجسيمات (الشكل1C).
- للتحليل تأكد من أن الإعدادات كما يلي: الحجم = 0-اللانهاية، التعميم = 0-1.0، إظهار = المخططات التفصيلية، خانات الاختيار لنتائجالعرض، والنتائج الواضحة (الشكل 1D). انقر فوق موافق. الإحاطة علما ً بعدد الجسيمات التي تم تحليلها في عينة جدول بيانات تدل على، ووضع z-stack.
- كرر الخطوات 3.5.2-3.5.4 حتى يتم تحليل كافة مكدسات z في التركيز للعينة. جمع العدد الإجمالي للجسيمات للعينة في جدول البيانات لتحديد العدد الإجمالي للتفاعلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجرينا تجارب أولية في خط خلية بيتا البنكرياس MIN6 وخط الخلايا العصبية SH-SY5Y SH-SY5Y، لتحسين وتأكيد كل من خصوصية الأجسام المضادة وتفاعلات البروتين المرئي. تم طلاء خلايا MIN6 على الأغطية في 30،000 خلية / مل وتركت للتقيد لمدة 48 ساعة، وخلايا SH-SY5Y كانت مطلية على الأغطية في 15،000 خلية / مل وتركت للتمسك لمدة 24 ساعة. ثم اتبع بروتوكول جيش التحرير الشعبي على النحو الوارد أعلاه، ابتداء من الخطوة 1-2-3. لضمان خصوصية إشارات جيش التحرير الشعبي، قمنا أولاً بتنفيذ هذا النهج في وجود '1' لا الأجسام المضادة الأولية (الشكل2A، الشكل 3A)،(2) NRDP1 الأجسام المضادة وحدها (الشكل2B، الشكل 3B)،(3) USP8 الأجسام المضادة وحدها ( الشكل 2جيموالشكل 3 جيمو'4' كل من الأجسام المضادة NRDP1 وUSP8 (الشكل2D، الشكل 3D). لتسهيل إعداد العينة، يشير الجدول 1 إلى كيفية تخطيط عناصر التحكم التجريبية بشكل صحيح. وتجدر الإشارة إلى أننا لا نلاحظ أي إشارة جيش التحرير الشعبي في جسم مضاد أساسي واحد أو لا توجد ظروف تحكم أساسية في الأجسام المضادة، مما يؤكد أن التفاعلات في الموقع لوحظت على وجه التحديد بين NRDP1 و USP8 في وجود كل من الأجسام المضادة الأولية، في كل من MIN6 و خلايا SH-SY5Y.
نحن بعد ذلك تكييف هذا النهج للاستخدام مع الجزر البشرية لتحليل التفاعلات المعقدة mitophagy على وجه التحديد داخل خلايا بيتا البشرية الأولية. تتكون الجزر البشرية من مجموعة غير متجانسة من الخلايا المتميزة وظيفيا، بما في ذلك ألفا، بيتا، دلتا، والخلايا PP9. على النقيض من جزر الماوس حيث تمثل خلايا بيتا ~ 80٪ من كتلة جزيرة، خلايا بيتا تشكل مجموعة أصغر نسبيا داخل الجزر البشرية (بين 28-75٪)10،11،12. وهكذا، سعينا إلى استخدام تكنولوجيا جيش التحرير الشعبى الصينى للسماح لنا بمراقبة وجود مجمعات NRDP1-USP8 mitophagy على وجه التحديد داخل خلايا بيتا وضمان أننا لم نلاحظ ملاحظات مربكة من أنواع خلايا الحجية الأخرى (والتي يمكن أن تحدث من دراسات الترسيب المناعي المشترك للليسات من islet). وبالتالي، من المهم ضمان تشتت كافية وموحدة للقُنْض إلى مستوى يمكن فيه بسهولة تمييز الخلايا المفردة ومواصلة تحليلها. وكما هو مرى في الشكل4، فإن بروتوكول التشتت (القسم 1) يتسم بكفاءة عالية في ضمان وجود خلايا وحيدة في مجال المجهر لتحليل المصب. لتحديد خلايا بيتا، قمنا بتلطيخ مشترك مع PDX1 محددة المضادة للسيرا خلال عملية جيش التحرير الشعبى الصينى. PDX1 هو عامل النسخ خلية بيتا محددة حيوية، والتي وجدت في خلايا بيتا الناضجة المنتجة للأنسولين في المقام الأول داخل نواة13. تم الاحتفاظ PDX1 تلطيخ بعد NRDP1: USP8 جيشالتحرير الشعبى الصينى في الجزر البشرية الأولية (الشكل 4). الأهم من ذلك، استخدمنا الماعز PDX1 المضادة للسيرا لتجنب التفاعل عبر مع الأجسام المضادة الأولية المستخدمة لجيش التحرير الشعبى الصينى (أرنب مكافحة NRDP1 والماوس المضادة USP8، على التوالي). وهكذا، فإن إضافة PDX1 counterstaining يسمح للتقييم المحدد للمجمعات mitophagy الذاتية داخل خلايا بيتا البشرية الأولية.
باستخدام هذه النهج، يمكننا تجميع لقطة من الاحتفاظ NRDP1: USP8 مجمع mitophagy لاستنتاج كفاءة المسار mitophagy داخل خلايا بيتا. لتوسيع هذا النهج للاستخدام في الظروف البيئية محاكاة تلك من النوع 2 مرض السكري14،عالجنا خطوط خلايا بيتا والجزر الصغيرة البشرية الأولية مع بالميتات والجلوكوز عالية للحث على السمية glucolipo. في الواقع، وجدنا أن التفاعل بين NRDP1 و USP8 انخفض بعد التعرض 48 ح لبالميتات وارتفاع الجلوكوز في كل من خطوط الخلايا بيتا وكذلك خلايا بيتا البشرية الأولية من قبل جيش التحرير الشعبى الصينى (الشكل5 والمرجع1). وتسلط هذه النتيجة الضوء على جدوى هذا التقييم لتقييم العوامل الرئيسية الذاتية في أعقاب المحفزات الداخلية.
الشكل 1: سير عمل تحليل الصورة J للقياس الكمي لتفاعلات جيش التحرير الشعبي. ويسلط الضوء هنا على الخطوات الهامة للتحليل. (أ) تعديل عتبة الصورة لضمان تحليل إشارة جيش التحرير الشعبي محدد. (ب) تحويل الصورة إلى بيانات ثنائية للسماح بسهولة القياس الكمي. (C-D) كيفية الانتهاء من التحليل عن طريق تحليل الجسيمات التي تم التعرف عليها من قبل برنامج ImageJ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: NRDP1 و USP8 تتفاعل على وجه التحديد في خلايا بيتا البنكرياس. يتم عرض صور التكبير العالي (100x) لخط خلايا البنكرياس الماوس، MIN6. (A-D) يتم عرض إشارة جيش التحرير الشعبي لNRDP1: يتم عرض التفاعل USP8 باللون الأحمر، ويتم تحديد النوى من قبل DAPI باللون الأزرق. (A-C) لا توجد إشارة الملتحمة المحددة لNRDP1: يتم رؤية التفاعل USP8 إذا كان كل من (A) أو أي واحد (B ، C) من الأجسام المضادة البروتين الأولية يتم حذفها خلال عملية جيش التحرير الشعبى الصينى. ومع ذلك، فإن التفاعل بين كلا البروتينات مرئي من قبل جيش التحرير الشعبي في خلايا بيتا البنكرياس (D) عندما يتم تضمين كلا الأجسام المضادة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: NRDP1 و USP8 تتفاعل على وجه التحديد في خلايا الورم الأرومي العصبي. يتم عرض التكبير العالي (100x) من خط الخلايا الورم العصبي البشري، SH-SY5Y. (A-D) يتم عرض إشارة جيش التحرير الشعبي لNRDP1: يتم عرض التفاعل USP8 باللون الأحمر، ويتم تحديد النوى من قبل DAPI باللون الأزرق. (A-C) لا توجد إشارة الملتحمة المحددة لNRDP1: يتم رؤية التفاعل USP8 إذا كان كل من (A) أو أي واحد (B ، C) من الأجسام المضادة البروتين الأولية يتم حذفها خلال عملية جيش التحرير الشعبى الصينى. ومع ذلك، فإن التفاعل بينكلا البروتينات مرئي من قبل جيش التحرير الشعبي (D) عندما يتم تضمين كلا الأجسام المضادة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يمكن تحديد مجمعات ميتوثاجي خلية بيتا في الجزر البنكرياسية البشرية الأولية في الموقع من قبل جيش التحرير الشعبي. يتم عرض التكبير العالي (100x) صور الجزر البشرية المشتتة. يتم تحديد الخلايا المفردة عن طريق تلطيخ النووية مع DAPI (الأزرق)، ويلاحظ خلايا بيتا مع تلطيخ PDX1 (أرجواني)، ويمكن رؤية المجمعات mitophagy في كل من خلايا بيتا والخلايا غير بيتا (الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يتم زعزعة مجمع الميتوباجي USP8 في خلايا بيتا عن طريق السمية الغلوكوليبو.
يتم عرض صور التكبير العالي (100x) لخلايا MIN6 المعالجة لمدة 48 ساعة مع إما التحكم (25 مليون من الجلوكوز + 0.82٪ BSA) أو الجلوكوز العالي + بالميتات (25 مليون من الجلوكوز + 0.4 مليون بالميتات / 0.82٪ BSA). (A-B) وينظر إلى إشارة جيش التحرير الشعبي (NRDP1:USP8) في كل من مجموعات العلاج. انخفاض إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى فيخلايا بيتا MIN6 بعد السمية الغلوكوكوليبو (B) بالمقارنة مع الضوابط (A). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينه | الأجسام المضادة 1 (الماوس المضادة NRDP1) | الأجسام المضادة 2 (أرنب المضادة USP8) | الأجسام المضادة 3 (الماعز المضادة PDX1) (وصمة عار اختيارية) |
| التحكم 1: لا يوجد جسم مضاد أساسي (40 جزيرة صغيرة) | - | - | + |
| التحكم 2: NRDP1 وحدها (40 جزيرة صغيرة) | + | - | + |
| التحكم 3: USP8 وحدها (40 جزيرة صغيرة) | - | + | + |
| تجريبي 1-x: جميع الظروف التجريبية (40 جزيرة لكل منها) | + | + | + |
الجدول 1: نموذج إعداد التصميم التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقوم بوصف نهج بسيط وفعال لاستخدام NRDP1:USP8 PLA في الأنسجة / الخلايا ذات الأهمية لتحديد تشكيل المجمعات mitophagy المنبع. أكدنا في وقت سابق تشكيل مجمع CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس ية من خلال عدة منهجيات، بما في ذلك تجارب الترسيب المناعي المشترك، ودراسات التفاعل الخالي من الخلايا، وفي المختبر وكذلك في الخلايا القائمة على في كل مكان الاختبارات، وأظهرت كيف أن هذا المحركات المعقدة ينظم تدفق mitophagic1،15. دراسات جيش التحرير الشعبى الصينى نبلغ ونصف هنا تسمح لنظرة سريعة، كمية، وخلية محددة من مسار mitophagy التي هي قابلة للتكيف للغاية مع خلايا بيتا البشرية الأولية. بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا أن NRDP1:USP8 PLA يمكن تكييفها للاستخدام خارج بيولوجيا خلية بيتا في خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y، وتسليط الضوء على الجدوى المحتملة لهذه التقنية لرصد المجمعات mitophagy في النظم العصبية كذلك.
جيش التحرير الشعبي هو نهج مباشر; ومع ذلك، فإن بعض الخطوات المتخذة في إطار البروتوكول ذات أهمية قصوى لضمان تحقيق نتائج واضحة ومحددة. وتشمل هذه: (1) ضمان إجراء تفريق الجزر البشرية خفيفة بما فيه الكفاية لمنع تحلل الخلايا / الضرر لتحسين الصور، (2) إضافة مثبطات deubiquitinase، PR619، مباشرة قبل التثبيت وخلال الشهي للحفاظ على حالة في كل مكان (وبالتالي ملزمة) من مجمع NRDP1-USP8 لمراقبة إشارة قصوى من قبل جيش التحرير الشعبي، و (3) التحديد الكمي الموضوعي لأحداث جيش التحرير الشعبي من قبل ImageJ لضمان تقييم غير متحيز ة للمجمعات mitophagy وتسمح أيضا لتحديد الشروط التي قد لا تكون التغييرات على mitophagy كاملة ولكن لا تزال ذات أهمية إحصائية / ذات الصلة بيولوجيا.
ومن التحديات المعروفة في دراسات السلالة البشرية الاهتمام بالسكان غير المتجانسين لكل من خلايا بيتا والخلايا غير بيتا. استخدامنا للبقعة المضادة PDX1 يسمح لتقييم تشكيل معقدة mitophagy داخل خلايا بيتا (وكذلك PDX1 الخلايا السلبية غير بيتا). أحد الشواغل المحتملة باستخدام PDX1 كبقعة مضادة هو التعبير في خلايا دلتا البنكرياس16،17،18،وإن كان إلى درجة أقل بكثير مما كانت عليه في خلايا بيتا، مثل هذه العلامات الأخرى (أي NKX6.1) يمكن استخدامها ل استهداف خلايا بيتا بشكل أكثر تحديداً. من خلال تفريق الجزر سليمة في خلايا واحدة مباشرة قبل cytocentrifugation والتثبيت، ونحن أيضا قادرة على إجراء دراسات الخلية واحدة mitophagy مع الحد الأدنى فقط من تعطيل البيئة الدقيقة جزيرة خلال العلاج من المخدرات و / أو التعرض السمية الغلوكوبوليكانية. ومع ذلك، لا يمكننا استبعاد إمكانية أن تشتت الISlet يمكن أن تتداخل مع المجمعات mitophagic داخل الخلايا بشكل مستقل عن العلاجات ذات الصلة.
في حين يمكن استخدام دراسات التفاعل البروتينالبروتيني والبروتينالتقليدية أكثر في جزر البنكرياس البشرية، مثل الترسيب المناعي المشترك و / أو النهج البروتيومية، تتطلب هذه الإجراءات عموما كمية كبيرة من الليسات جزيرة، والتي يمكن أن تثبت تحديا نظرا لندرة المواد البشرية islet المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، فإن القلق من خصوصية نوع الخلية خلال هذه التقنيات التقليدية يصبح أكثر وضوحا أو يتطلب تحسين إضافي لطرق قياس التدفق الخلوي لفرز مجموعات خلايا بيتا النقية19،20، 21،22. وهكذا، لدينا نهج جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر بديلا جذابا وعمليا لدراسات التفاعل البروتيني والبروتين من مسار mitophagy في خلايا بيتا البشرية. وتجدر الإشارة إلى أن القدرة على استخدام ما يصل إلى 40 جزيرة إجمالية / شرط لكل تجربة لتحديد كمية تشكيل مجمع mitophagy في الآلاف من خلايا بيتا الفردية يسمح للباحثين جزيرة القدرة على الحفاظ على استعداداتهم جزيرة لتقييمات أخرى من نفس المانحة.
كما يتم التعبير عن NRDP1 و USP8 في كل مكان، ونحن نتكهن هذه التقنية قد يكون لها قيمة لتقييم mitophagy في أنواع الخلايا وراء خلايا بيتا. وتشمل الاحتمالات أنواع خلايا جزيرة أخرى (مع البقع المضادة ذات الصلة لخلايا ألفا أو خلايا دلتا) أو أنواع الخلايا التي تعتمد بشكل كبير على mitophagy، مثل الخلايا العصبية. ولهذه الغاية، فإن ملاحظتنا لقابلية نقل هذه التقنية إلى خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y (الشكل2) أو خلايا الحجة السلبية PDX1 (الشكل 4) يمكن أن تشير إلى فائدة تقنيتنا للمسار mitophagy في أنواع الخلايا الأخرى.
على الرغم من سهولة وبساطة نهج NRDP1:USP8 جيش التحرير الشعبي، هناك تحديات يمكن أن تشوش نتائج هذا القول. في حين أن جيش التحرير الشعبي قادر على التأكد من التفاعلات البروتين البروتين في القرب جدا (40 نانومتر)، فإنه لا يستبعد إمكانية أن بعض الظروف التجريبية يمكن أن تحافظ على قرب NRDP1-USP8 في حين تعطيل التفاعل، والتي سوف تفوت من قبل نهج جيش التحرير الشعبي. وعلاوة على ذلك، في حين أننا قد أظهرت أن NRDP1: USP8 تشكيل معقدة هو قراءة صالحة للمسار CLEC16A/PARKIN-mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس، وقد لاحظت الدراسات الحديثة أدوار لparkIN مستقلة mitophagy في الميتوكوندريا مراقبة الجودة23،24. نحن لا نعرف حتى الآن كيف يتم تعديل NRDP1:USP8 تشكيل معقدة من قبل تعطيل mitophagy باركين مستقلة. وهكذا، فإن استخدام نهج تكميلي يتجاوز تلك الموصوفة هنا للتدقيق mitophagy في خلايا بيتا سيكون من المستحسن. وأخيرا، فإن استقرار هذا المجمع mitophagy يعتمد على في كل مكان من البروتينات المكونة، بحيث إضافة طيف واسع من مثبطات deubiquitinase PR619 أمر بالغ الأهمية للحفاظ على كل شيء أثناء إعداد العينة. مرة أخرى، التلاعب في خلايا بيتا التي قد تعطل بشكل غير مباشر في كل مكان من مكونات مجمع NRDP1-USP8 تحتاج إلى النظر عند تحليل NRDP1:USP8 كقراءة لتشكيل معقدة mitophagy.
كما يتم تقدير دور مراقبة الجودة الميتوكوندريا على نحو متزايد ليس فقط وظيفة خلية بيتا ولكن أيضا أنواع أخرى من الخلايا الأيضية للغاية، وتقييم دقيق من mitophagy يمكن أن تثبت تحديا وتستغرق وقتا طويلا للمجموعات الراغبة في الحصول على أسرع تقييم المكونات mitophagy حاسمة. نهج جيش التحرير الشعبي الذي نصفه هو منخفض التكلفة نسبيا، تقنية التصور على المستوى الجزيئي التي يمكن أن توفر تحليلا كميا لتشكيل معقدة mitophagy مع قرار خلية واحدة في عينات جزيرة بشرية كمية صغيرة ويمكن تطبيقها على نطاق واسع إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا أو العلاجات أو حالات المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالدعم التمويلي المقدم من JDRF (CDA-2016-189 وSRA-2018-539)، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-DK-108921)، وأسرة Brehm، وعائلة أنتوني. وتحظى جائزة التطوير الوظيفي لـ JdRF إلى S.A.S. بدعم جزئي من الأكاديمية الدانمركية للسكري، التي تدعمها مؤسسة نوفو نورديسك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
