Summary
Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.
Abstract
La mitofagia è un percorso di controllo della qualità mitocondriale essenziale, che è fondamentale per la bioenergetica delle cellule beta delle isoloti pancreatiche per alimentare il rilascio di insulina stimolato dal glucosio. La valutazione della mitofagia è impegnativa e spesso richiede giornalisti genetici o molteplici tecniche complementari non facilmente utilizzate in campioni di tessuto, come le isole pancreatiche primarie umane. Qui dimostriamo un approccio robusto per visualizzare e quantificare la formazione di complessi chiave di mitofagia endogena nelle isole pancreatiche primarie. Utilizzando la tecnica di analisi della legatura di prossimità sensibile per rilevare l'interazione dei regolatori di mitopagia NRDP1 e USP8, siamo in grado di quantificare specificamente la formazione di complessi mitopagia essenziali in situ. Accresciuto questo approccio per contrastare la controtendenza per il fattore di trascrizione PDX1, possiamo quantificare i complessi di mitofagia e i fattori che possono compromettere la mitofagia, in particolare all'interno delle cellule beta. La metodologia che descriviamo supera la necessità di grandi quantità di estratti cellulari necessari per altri studi di interazione proteina-proteina, come l'immunoprecipitazioni (IP) o la spettrometria di massa, ed è ideale per preziosi campioni di isole umane generalmente non disponibili in quantità sufficienti per questi approcci. Inoltre, questa metodologia evita la necessità di tecniche di selezione del flusso per purificare le cellule beta da una popolazione di isolotto eterogeneo per applicazioni di proteine a valle. Perquesto, descriviamo un protocollo prezioso per la visualizzazione della mitofagia altamente compatibile per l'uso in popolazioni cellulari eterogenee e limitate.
Introduction
Le cellule beta pancreatiche producono l'insulina necessaria per mantenere l'omeostasi normale del glucosio e il loro fallimento si traduce nello sviluppo di tutte le forme di diabete. Le cellule beta mantengono una robusta capacità mitocondriale per generare l'energia necessaria per accoppiare il metabolismo del glucosio con rilascio di insulina. Recentemente, è diventato evidente che il mantenimento della massa mitocondriale funzionale è di fondamentale importanza per la funzione ottimale della cella beta1,2,3. Al fine di sostenere la massa mitocondriale funzionale, le cellule beta si basano su meccanismi di controllo di qualità per rimuovere i mitocondri disfunzionali, danneggiati o i mitocondri di invecchiamento4 . Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule beta si basano su una forma specializzata di turnover mitocondriale, chiamata autofagia mitocondriale (o mitopagia), per mantenere il controllo della qualità mitocondriale sia nei roditori che nelle isole umane1, 2,5. Purtroppo, tuttavia, non esisteva un metodo semplice per rilevare la mitofagia, o componenti mitoplasmasi endogenamente espressi, nelle cellule beta pancreatiche umane.
Recentemente abbiamo dimostrato che la regolazione a monte della mitofagia nelle cellule beta si basa sulla formazione di un complesso proteico che comprende i legamenti E3 CLEC16A e NRDP1 e la deubiquitinasi USP81. NRDP1 e USP8 hanno dimostrato indipendentemente di influenzare la mitopfagia attraverso l'azione sull'initiatore di mitopfagia chiave PARKIN6,7. NRDP1 si rivolge a PARKIN per l'ubiquitinazione e la degradazione per spegnere la mitofagia6e USP8 deubiquitinates specificamente PARKIN K6-linked per promuovere la sua traslocazione a mitocondri7. La tecnologia di analisi della legatura di prossimità (PLA) èstata un recente progresso nel campo della biologia dell'interazione delle proteine 8, consentendo la visualizzazione di interazioni endogene di proteine in situ in singole cellule e non è limitata da scarsi materiali campione. Questa metodologia è particolarmente allettante per la biologia delle cellule umane-beta, a causa della disponibilità del campione, unita alla necessità di comprendere i complessi proteici fisiologicamente rilevanti all'interno di tipi di cellule eterogenee.
Utilizzando l'approccio PLA, siamo in grado di osservare i principali complessi mitogeni endogeni nelle cellule beta pancreatiche umane primarie e nelle linee cellulari neuronali, e dimostrare gli effetti di un ambiente diabegenico sul percorso mitopfagia1. In sintesi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare specifici complessi proteici mitopagia in tessuti privi di materiale abbondante, o dove non sono possibili studi convenzionali di interazione proteica.
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Protocol
L'uso di isole pancreatiche umane de-identificate del donatore avviene tramite un'esenzione dell'IRB (Institutional Review Board) e in conformità con la politica IRB dell'Università del Michigan. Le isole pancreatiche umane sono state fornite dal programma integrato di distribuzione dell'isola (IIDP) sponsorizzato da NIH/NIDDK.
1. Preparazione del campione di isleta umana
-
Dissociazione a cella singola
- Campioni di isolotto umano di coltura (4000-6000 equivalenti di isolotto/10 mL di supporti) per almeno 1 giorno a 37 gradi centigradi in supporti di isolotto pancreatico (PIM(S)) integrati con 1 mM di glutammina (PIM(G)), 100 unità/mL antimicotico-antibiotico, 1 mM di piratosa di sodio e 10 % bovina fetale siero (FBS) o siero UMANO AB.
- Utilizzare un microscopio luminoso di dissezione a un ingrandimento 3x per contare le singole isole umane dalla coltura. Prelevare 40 isolotti per trattamento/condizione di interesse (come la glucolipotossicità) in tubi da 1,5 mL nel supporto dell'isolotto.
- Le isole Centrifuga a 400 x g per 1 min a 10 gradi centigradi.
- I campioni di lavaggio, mediante breve inversione dei tubi a temperatura ambiente, due volte con 1 mL di salina tampolatata per fosfati (PBS) contenente 50 PR619 (un inibitore della deubiquitinasi; per preservare le interazioni tra proteine dipendenti dall'ubiquitina, con centrifugazione tra ogni lavaggio a 400 x g per 1 min a 10 gradi centigradi.
- Dissociate le isole in singole cellule con 125 gradi di ritegno dello 0,25% contenente 50 :M PR619 incubando la trypsin preriscaldata (37 gradi centigradi) per 3 min con pellet di isolotto. Disperdere delicatamente le isse durante questo periodo con una pipetta delicata periodica utilizzando una pipetta da 200 l.
- Quenpsin con un supporto PIM riscaldato da 1 mL (37 gradi centigradi) contenente 50 -M PR619, quindi sedimentare le cellule centrifundo a 400 x g per 1 min.
- Lavare le cellule per centrifugazione a 400 x g per 1 min, due volte, con PBS - 50 - M PR619.
- Infine, risospendere le celle in PBS 150 .
-
Aderenza e fissazione di una singola cellula
- Dopo la sospensione, far girare la soluzione cellulare su vetrini smerigliati, carichi, al microscopio utilizzando una citocentrifuga a 28 x g per 10 min.
- Dopo la citocentrifuga, delineare l'area cellulare con una penna idrofobica (vedere la Tabella dei materiali) per ridurre al minimo i volumi di soluzione anticorpo/PLA necessari. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min a temperatura ambiente.
AVVISO: il PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura. - Per ottenere i migliori risultati, eseguire la colorazione/PLA immediatamente, o entro 24 h. Se necessario, conservare i campioni in PBS a 4 gradi centigradi fino a ottenere una colorazione non superiore a 48 h.
2. Immunoistochimica
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Blocco
- Lavare le cellule due volte con 1x PBS per 5 min a temperatura ambiente.
- Soluzione a celle a blocchi, per eliminare la colorazione dello sfondo, con il siero del 10% dell'asino in PBS contenente il detersivo dello 0,3% (si veda la tabella deimateriali) per 1 h a temperatura ambiente.
-
Colorazione
- Cellule incubate con anticorpi di topo primario o coniglio contro USP8 (1:250) e NRDP1 (1:250) rispettivamente (vedi Tabella dei materiali) diluite nel fosfato tampinato con detersivo (PBT, vedi Table of Materials),a 4 rilevare la segnalazione complessa di mitofagia tramite PLA.
- Co-incubare le cellule con un marcatore specifico per l'identificazione delle cellule beta che non è stato sollevato nel mouse o nel coniglio in modo da non interferire con il segnale PLA. In questo caso incubare cellule con PDX1 anti-capra (1:500) in PBT. Incubare tutti gli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi, utilizzando pellicola di plastica sopra la soluzione per prevenire l'evaporazione.
3. Saggio di legatura di prossimità
- Sonda e contromacchia PLA
- Preparare la soluzione di sonda PLA secondo le istruzioni del produttore, vale a dire, fare 20 l di soluzione sonda per campione, preparando una concentrazione finale di soluzione 1:5 sia anti-topo che anti-coniglio in PBT, e incubazione per 20 min a room temperatura.
- Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule due volte con 1x PBS per 5 min ciascuno, su un rocker.
- Poco prima dell'incubazione con la soluzione di sonda, aggiungere Cy5 anti-gola secondario ad una concentrazione finale di 1:600 alla soluzione sonda (per il rilevamento di PDX1 endogeno). Aggiungere la soluzione a sonda 20 per ogni condizione della cella, coprire delicatamente con pellicola di plastica e incubare a 37 gradi centigradi per 1 h.
- Legatura
- Lavare le cellule due volte, a temperatura ambiente, con buffer A (vedere la Tabella dei Materiali per la ricetta) per 5 min ciascuno, su un rocker.
- Preparare la soluzione di legatura (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Per questo, diluire lo stock di legatura (5x) 1:5 in acqua trattata decontemporanea (DEPC) dietile. Immediatamente prima dell'incubazione aggiungere 0,025 U/mL ligase. Aggiungere una soluzione di legatura da 20 l alle cellule. Coprire con pellicola di plastica e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Amplificazione
- Lavare le cellule due volte a temperatura ambiente con buffer A per 2 min ciascuno.
- Fare la soluzione di amplificazione (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Diluire il buffer di amplificazione (5x) 1:5 in acqua trattata con DEPC e tenere al buio fino all'uso. Aggiungere una diluizione 1:80 di polimerasi (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) alla soluzione immediatamente prima di aggiungere la soluzione alle cellule.
- Aggiungere 20 - soluzione di amplificazione alle cellule. Coprire con pellicola di plastica e mettere al buio a 37 gradi centigradi per un valore compreso tra 1 h 40 min e 2 h per il segnale massimo.
- Preparazione per l'imaging
- Lavare le cellule due volte con buffer B (vedere la Tabella dei Materiali per ricetta) per 10 min a temperatura ambiente, su un rocker.
- Infine, lavare le cellule una volta in 0.01x Buffer B, per 2 min a temperatura ambiente su un rocker.
- Montare i campioni aggiungendo una goccia di supporti di montaggio contenenti 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e posizionando con attenzione una coverslip sopra i campioni utilizzando una lama del bisturi per premere eventuali bolle formate. Sigillare le labbra con smalto chiaro intorno ai bordi.
- Esempi di immagini su un microscopio in grado di catturare più piani focali, come un microscopio confocale a scansione laser o un microscopio a fluorescenza invertita con capacità di deconvoluzione, prendendo almeno 9 diverse immagini del piano focale.
- Acquisire immagini con un ingrandimento di 100 volte, con un'altezza dello z-stack di circa 0,45 mm. Catturare Il PLA a 550 nm eccitazione, 570 nm emissioni; contro la macchia a 650 nm eccitazione, 670 nm emissione; e DAPI a 405 nm eccitazione, 450 nm emissioni.
- Per garantire che i segnali di sfondo dell'immagine a fluorescenza e la luce vagante siano ridotti al minimo per l'analisi a valle degli eventi PLA (in particolare sui microscopi widefield), le immagini di processo utilizzando un algoritmo di deconvoluzione bidimensionale (vicino più vicino) software di elaborazione delle immagini standard prescelto.
NOTA: Per l'uso di Olympus CellSens, Nikon utilizza NIS-Elements, Leica utilizzare LAS X, zeiss – .eiss – EN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, così come diversi plugin disponibili attraverso Image-J. Per l'analisi, il numero totale di interazioni su tutti gli z-stack deve essere analizzato utilizzando il software Image-J, assicurando che vengano analizzate solo le celle positive Pdx-1 (sezione 3.5).
- Quantificazione delle interazioni con PLA
- Aprire l'applicazione software gratuita Image-J e aprire l'immagine PLA. Iniziare dalla prima immagine PLA nitidamente messa a fuoco.
- Fare clic sulla scheda immagine e selezionare Regola, quindi soglia (Figura 1A). Regolare la soglia per rimuovere tutti i segnali PLA non specifici, prendere nota della regolazione della soglia e cercare di mantenerla coerente durante l'analisi.
- Fare clic sulla scheda processo e selezionare binary, quindi rendere binario (Figura 1B). Utilizzare l'immagine binaria per misurare le particelle, facendo clic sulla scheda "Analizza" e premendo Analizza particelle (Figura 1C).
- Per l'analisi, assicurarsi che le impostazioni siano le seguenti: Dimensione : 0-Infinito, Circolarità 0–1,0, Mostra , Contorni, caselle di controllo per Visualizza risultatie Cancella risultati (Figura 1D). Fare clic su OK. Prendere nota del numero di particelle analizzate in un foglio di calcolo che denota il campione e della posizione della pila z.
- Ripetere i passaggi da 3.5.2–3.5.4 fino a quando non sono stati analizzati tutti gli stack z a fuoco per il campione. Sommare il numero totale di particelle per il campione nel foglio di calcolo per quantificare il numero totale di interazioni.
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Representative Results
Abbiamo condotto esperimenti iniziali nella linea di cellule beta pancreatiche MIN6 e nella linea di cellule del neuroblastoma SH-YY5Y SH-YY5Y, per ottimizzare e confermare sia la specificità degli anticorpi che le interazioni proteiche visualizzate. Le cellule MIN6 sono state placcate su coverlips a 30.000 celle / mL e lasciate aderire per 48 h, le cellule SH-SY5Y sono state placcate su coverlips a 15.000 celle / mL e lasciate aderire per 24 h. Il protocollo PLA è stato poi seguito come sopra, a partire dal passo 1.2.3. Per garantire la specificità dei segnali PLA, questo approccio è stato prima eseguito in presenza di (i) nessun anticorpo primario (Figura 2A, Figura 3A), (ii) solo anticorpo NRDP1 (Figura 2B, Figura 3B), (iii) solo anticorpo USP8 ( Figura 2C, Figura 3C) e (iv) entrambi gli anticorpi NRDP1 e USP8 (Figura 2D, Figura 3D). Per semplificare la configurazione dei campioni, nella tabella 1 viene indicato come eseguire correttamente il layout dei controlli sperimentali. In particolare, osserviamo nessun segnale PLA forato in singoli anticorpi primari o nessuna condizione primaria di controllo degli anticorpi, confermando così che le interazioni in situ sono specificamente osservate tra NRDP1 e USP8 in presenza di entrambi gli anticorpi primari, sia in MIN6 che in cellule SH-SY5Y.
Abbiamo poi adattato questo approccio per l'uso con isolotti umani per analizzare le interazioni complesse della mitofagia specificamente all'interno delle cellule beta umane primarie. Le isole umane sono composte da una popolazione eterogenea di cellule funzionalmente distinte, tra cui cellule alfa, beta, delta e PP9. A differenza degli isolotti di topo in cui le cellule beta rappresentano l'80% della massa di isole, le cellule beta costituiscono un intervallo proporzionalmente più piccolo all'interno delle isole umane (tra il 28-75%)10,11,12. Pertanto, abbiamo cercato di utilizzare la tecnologia PLA per consentire di osservare la presenza di complessi mitofagia NRDP1-USP8 specificamente all'interno delle cellule beta e di garantire che non osservassimo osservazioni confuse provenienti da altri tipi di cellule studi di co-immunoprecipitazioni di lismi iletto). Pertanto, è importante garantire una dispersione adeguata e uniforme delle isolotto a un livello tale che le singole cellule possano essere facilmente discriminate e analizzate ulteriormente. Come si vede nella Figura 4, il protocollo di dispersione (sezione 1) è altamente efficiente nel garantire singole cellule nel campo visivo del microscopio per l'analisi a valle. Per identificare le cellule beta, abbiamo eseguito la co-colorazione con PDX1 specifico anti-sera durante il processo PLA. PDX1 è un fattore di trascrizione specifico delle cellule beta, che si trova nelle cellule beta mature che producono insulina principalmente all'interno del nucleo13. La colorazione PDX1 è stata mantenuta dopo NRDP1:USP8 PLA nelle isole primarie umane (Figura 4). È importante sottolineare che abbiamo usato la capra PDX1 anti-sera per evitare la reattività incrociata con anticorpi primari utilizzati per il PLA (coniglio anti-NRDP1 e topo anti-USP8, rispettivamente). Pertanto, l'aggiunta di controstazione PDX1 consente la valutazione specifica dei complessi mitogeni endogeni all'interno delle cellule beta umane primarie.
Utilizzando questi approcci, possiamo compilare un'istantanea della conservazione del complesso mitofale NRDP1:USP8 per dedurre la competenza del percorso di mitopagia all'interno delle cellule beta. Per espandere questo approccio per l'uso all'interno di condizioni ambientali emulando quelle del diabete di tipo 214,abbiamo trattato linee di cellule beta e isolotti umani primari con palmitate e glucosio elevato per indurre la glucolipotossicità. Infatti, abbiamo scoperto che l'interazione di NRDP1 e USP8 è diminuita a seguito di un'esposizione di 48 h al palmitato e all'alto glucosio in entrambe le linee cellulari beta e nelle cellule beta umane primarie da parte di PLA (Figura 5 e riferimento1). Questo risultato evidenzia la fattibilità di questo saggio per valutare i principali fattori di mitofagia endogeni in seguito a stimoli diabetogeni.
Figura 1: Flusso di lavoro dell'analisi dell'immagine J per la quantificazione delle interazioni PLA. Le fasi importanti dell'analisi sono evidenziate qui. (A) Regolazione della soglia dell'immagine per garantire un'analisi specifica del segnale PLA. (B) Conversione di immagini in dati binari per consentire una facile quantificazione. (C-D) Come finalizzare l'analisi analizzando le particelle riconosciute dal software ImageJ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: NRDP1 e USP8 interagiscono specificamente nelle cellule beta pancreatiche. Vengono mostrate immagini ad alto ingrandimento (100x) della linea cellulare pancreatica del topo, MIN6. (A-D) Il segnale PLA per l'interazione NRDP1:USP8 è mostrato in rosso e i nuclei sono delineati da DAPI in blu. (A-C) Nessun segnale di puncinato specifico per l'interazione NRDP1:USP8 è visto se entrambi (A) o uno (B, C) degli anticorpi proteici primari viene omesso durante il processo PLA. Tuttavia, l'interazione di entrambe le proteine è visibile dal PLA nelle cellule beta pancreatiche (D) quando entrambi gli anticorpi sono inclusi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: NRDP1 e USP8 interagiscono specificamente nelle cellule del neuroblastoma. Immagini ad alto ingrandimento (100x) della linea cellulare del neuroblastoma umano, SH-SY5Y, sono mostrate. (A-D) Il segnale PLA per l'interazione NRDP1:USP8 è mostrato in rosso e i nuclei sono delineati da DAPI in blu. (A-C) Nessun segnale di puncinato specifico per l'interazione NRDP1:USP8 è visto se entrambi (A) o uno (B, C) degli anticorpi proteici primari viene omesso durante il processo PLA. Tuttavia, l'interazione di entrambele proteine è visibile dal PLA ( D) quando entrambi gli anticorpi sono inclusi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: I complessi di mitofagia a cellule beta possono essere identificati nelle isole pancreatiche umane primarie in situ da PLA. Vengono mostrate immagini ad alto ingrandimento (100x) di isolotti umani dispersi. Le singole cellule sono delineate dalla colorazione nucleare con DAPI (blu), le cellule beta sono osservate con la colorazione PDX1 (magenta) e i complessi mitopagy possono essere osservati sia nelle cellule beta che nelle cellule non beta (rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il complesso di mitofagia NRDP1:USP8 è destabilizzato nelle cellule beta dalla glucolipotossicità.
Immagini ad alto ingrandimento (100x) di cellule MIN6 trattate per 48 h con entrambi i controlli (25 mM di glucosio - 0,82% BSA) o alto glucosio - palmitate (25 mM di glucosio - 0,4 mm palmitate/0.82% BSA) sono mostrati. (A-B) Il segnale PLA (NRDP1:USP8) è visto in entrambi i gruppi di trattamento. Il segnale PLA diminuisce nelle cellule beta MIN6 dopo la glucolipotossicità (B) rispetto ai controlli (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| campione | ANTIBODY 1 (mouse anti-NRDP1) | ANTIBODY 2 (coniglio anti-USP8) | ANTIBODY 3 (capra anti-PDX1) (Contatore opzionale) |
| CONTROLLO 1: Nessun anticorpo primario (40 isolotti) | - | - | + |
| CONTROLLO 2: NRDP1 da solo (40 isolotti) | + | - | + |
| CONTROLLO 3: USP8 da solo (40 isolotti) | - | + | + |
| EXPERIMENTAL 1-x: tutte le condizioni sperimentali (40 isole ciascuna) | + | + | + |
Tabella 1: Esempio di configurazione della progettazione sperimentale.
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Discussion
Qui descriviamo un approccio semplice ed efficiente per utilizzare NRDP1:USP8 PLA in tessuti/cellule di interesse per quantificare la formazione di complessi mitopagia a monte. In precedenza abbiamo confermato la formazione del complesso mitopagy CLEC16A-NRDP1-USP8 nelle cellule beta pancreatiche da diverse metodologie, tra cui esperimenti di co-immunoprecipitazioni, studi di interazione senza cellule e in vitro e analisi dell'ubiquitinazione, e ha dimostrato come questo complesso aziona regolato flusso mitofagico1,15. Gli studi PLA che riportiamo e descriviamo qui consentono una visione rapida, quantitativa e specifica delle cellule del percorso di mitofagia che è altamente adattabile alle cellule beta umane primarie. Inoltre, abbiamo dimostrato che NRDP1:USP8 PLA può essere adattato per l'uso al di fuori della biologia delle cellule beta nelle cellule del neuroblastoma SH-SY5Y, evidenziando la potenziale fattibilità di questa tecnica per monitorare i complessi mitopagici anche nei sistemi neuronali.
Il PLA è un approccio semplice; tuttavia, alcuni passi all'interno del protocollo sono della massima importanza per garantire risultati chiari e specifici. Questi includono: (1) garantire che la procedura di dispersione per le isole umane sia abbastanza mite da prevenire la lisi/danno cellulare per ottimizzare le immagini, (2) aggiunta dell'inibitore della deubiquitinasi, PR619, immediatamente prima della fissazione e durante i fusi bit per preservare il stato di ubiquitinazione (e quindi vincolante) del complesso NRDP1-USP8 per l'osservazione del segnale massimo da parte del PLA e (3) la quantificazione oggettiva degli eventi Di PLA da parte di ImageJ per garantire una valutazione imparziale dei complessi mitopagia e consentire anche la determinazione di condizioni in base alle quali i cambiamenti in mitofagia possono non essere completi, ma ancora statisticamente significativi/biologicamente rilevanti.
Una sfida ben nota all'interno degli studi sulle isolottorie umane è la preoccupazione per la popolazione eterogenea di cellule beta e non beta. Il nostro uso della controstaina PDX1 consente la valutazione della formazione complessa mitopagia all'interno delle cellule beta (così come le cellule non beta negative PDX1). Una potenziale preoccupazione che utilizza PDX1 come controstaina è la sua espressione nelle cellule delta pancreatiche16,17,18, anche se in misura molto inferiore rispetto alle cellule beta, come tali altri marcatori (cioè, NKX6.1) potrebbero essere impiegati per cellule beta di destinazione in modo più specifico. Disperando isolette intatte in singole cellule immediatamente prima della citocentrizione e della fissazione, siamo anche in grado di eseguire studi sulla mitofagia a singola cellula con un'interruzione minima del microambiente dell'isolotto durante il corso dei trattamenti farmacologici e/o esposizione glucolipotossico. Tuttavia, non possiamo escludere la possibilità che la dispersione dell'isolotto possa interferire con i complessi mitofagici all'interno delle cellule indipendentemente dai trattamenti pertinenti.
Mentre studi più tradizionali di interazione proteina-proteina possono essere impiegati in isole pancreatiche umane, come la co-immunoprecipitazioni e/o gli approcci proteomici, queste procedure generalmente richiedono una grande quantità di lisaio, che può rivelarsi impegnativo data la scarsità di materiale isolotto umano disponibile. Inoltre, la preoccupazione della specificità del tipo di cellula durante queste tecniche tradizionali diventa più evidente o richiede un'ulteriore ottimizzazione dei metodi di citometria di flusso per ordinare le popolazioni di cellule beta pure19,20, 21,22. Pertanto, il nostro approccio PLA fornisce un'alternativa attraente e pratica per gli studi di interazione proteina-proteina del percorso di mitofagia nelle cellule beta umane. In particolare, la capacità di utilizzare fino a 40 isolotti/condizione totali per esperimento per quantificare la formazione complessa di mitofagia in migliaia di singole cellule beta consente ai ricercatori delle isole la possibilità di conservare i loro preparati di isolotto per altre valutazioni stesso donatore.
Poiché NRDP1 e USP8 sono espressi onnipresentemente, ipotizziamo che questa tecnica possa avere un valore per la valutazione della mitopagia nei tipi di cellule al di là delle cellule beta. Le possibilità includono altri tipi di cellule isolet (con controstaine rilevanti per le cellule alfa o delta) o tipi di cellule che si basano fortemente sulla mitofagia, come i neuroni. A tal fine, la nostra osservazione della trasferibilità di questa tecnica alle cellule del neuroblastoma SH-SY5Y (Figura 2) o cellule di isolotto PDX1-negativo (Figura 4) potrebbe suggerire l'utilità della nostra tecnica per il percorso di mitopfagia in altri tipi di cellule.
Nonostante la facilità e la semplicità dell'approccio PLA NRDP1:USP8, ci sono sfide che potrebbero confondere i risultati di questo test. Sebbene il PLA sia in grado di accertare le interazioni proteina-proteina in prossimità molto ravvicinata (40 nm), non esclude la possibilità che determinate condizioni sperimentali possano mantenere la prossimità NRDP1-USP8 interrompendo l'interazione, che verrebbero perse dal Approccio PLA. Inoltre, mentre abbiamo dimostrato che la formazione complessa NRDP1:USP8 è una lettura valida per la via canonica CLEC16A/PARKIN-mitophagy nelle cellule beta pancreatiche, studi recenti hanno osservato ruoli per mitopfagia parkIN-indipendente nel mitocondriale controllo qualità23,24. Non sappiamo ancora come la formazione complessa NRDP1:USP8 sia modificata dall'interruzione della mitofagia indipendente da PARKIN. Pertanto, sarebbe consigliabile utilizzare un approccio complementare al di là di quelli qui descritti per testare la mitofagia nelle cellule beta. Infine, la stabilità di questo complesso di mitofagia dipende dall'ubiquitinazione delle proteine componenti, in modo tale che l'aggiunta di un inibitore della deubiquitinasi ad ampio spettro PR619 è fondamentale per mantenere l'ubiquitazione durante la preparazione del campione. Anche in questo caso, le manipolazioni delle cellule beta che possono interrompere indirettamente l'ubiquitinazione dei componenti del complesso NRDP1-USP8 devono essere considerate quando si analizza NRDP1:USP8 come una lettura per la formazione complessa di mitopagia.
Poiché il ruolo del controllo di qualità mitocondriale è sempre più apprezzato non solo nella funzione delle cellule beta, ma anche in altri tipi di cellule altamente metaboliche, la rigorosa valutazione della mitofagia può rivelarsi impegnativa e dispendiosa in termini di tempo per i gruppi che desiderano valutazione dei componenti cruciali della mitofagia. L'approccio PLA che descriviamo è una tecnica di visualizzazione a livello molecolare relativamente a basso costo che può fornire un'analisi quantitativa della formazione complessa di mitofagia con risoluzione a singola cella in piccoli campioni di isolotto umano e potrebbe essere ampiamente applicata a una varietà di tipi di cellule, trattamenti o condizioni di malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno al finanziamento da JDRF (CDA-2016-189 e SRA-2018-539), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), la famiglia Brehm e la famiglia Anthony. Il JDRF Career Development Award a S.A.S. è in parte sostenuto dalla Danish Diabetes Academy, sostenuta dalla Novo Nordisk Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
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