Summary

Orthotopic Rat nyre transplantasjon: en roman og forenklet kirurgisk tilnærming

Published: May 07, 2019
doi:

Summary

Formålet med dette manuskriptet og protokollen er å forklare og demonstrere i detalj den kirurgiske prosedyren for orthotopic nyre transplantasjon hos rotter. Denne metoden er forenklet for å oppnå riktig mengde donor nyre og forkorte reperfusion tid ved hjelp av venøs og urinleder cuff anastomose teknikk.

Abstract

Nyre transplantasjon gir økt overlevelse og bedre livskvalitet for pasienter med end-stadium nyresykdom, sammenlignet med alle typer nyre erstatning terapi. I løpet av de siste ti årene har rotte nyre transplantasjon modellen blitt brukt til å studere immunologiske fenomener av avvisning og toleranse. Denne modellen har blitt et uunnværlig verktøy for å teste nye immunmodulerende legemidler og regimer før du fortsetter med dyre prekliniske store dyrestudier.

Denne protokollen gir en detaljert oversikt over hvordan du pålitelig utføre orthotopic nyre transplantasjon hos rotter. Denne protokollen inneholder tre karakteristiske skritt som øker sannsynligheten for å lykkes: å gjennomføre donor nyre ved å skylle gjennom portalen vene og bruk av et mansjett-system for å anastomose nyre årer og urinlederne, og dermed redusere kulde og varme iskemi ganger. Ved hjelp av denne teknikken, har vi oppnådd overlevelse utover 6 måneder med normal serum kreatinin i dyr med syngeneic eller tolerant nyre transplantasjon. Avhengig av formålet med studien, kan denne modellen endres ved pre-eller posttransplant behandlinger for å studere akutte, kroniske, cellulære eller antistoff-mediert avvisning. Det er en reproduserbar, pålitelig og kostnadseffektiv dyremodell for å studere ulike aspekter ved nyre transplantasjon.

Introduction

Historisk ble den første transplantasjon avvisning studier utført av brent og Medawar bruker hud transplantasjon i gnagere1. Det ble snart klart at huden har distinkte immunologiske funksjoner, noe som gjør det til et svært immunogenic organ som er forskjellig i avvisning fra andre vascularized solide organer2. Rat studier av solid organ transplantasjon avvisning er fast begrenset til hjerte, lever og nyre transplantasjon. Selv om hver av disse organene er egnet til å studere avvisning, det er fordeler og ulemper til hver av dem. Hjertet transplantasjon er ofte transplantert inn i magen og endetarms til aorta og vena cava, med mottakerens eget hjerte på plass3. Dette betyr ikke gjenskape menneskelige kliniske, anatomiske og fysiologiske forhold. I tillegg hjerter er svært følsomme for kaldt iskemi og må reperfused fortrinnsvis innen 1 time for å kunne gjenopprette sin funksjon4. Leveren transplantasjon er generelt ansett for å være kirurgisk mer utfordrende og tid-følsom å utføre. Etter å ha fjernet den innfødte leveren, donor leveren må implantert og reperfused innen 30 min som mottakerne ikke kan vare lenger uten en fungerende lever5. Hepatic arterien, Portal vene, og spesielt galle duct gjenoppbygging krever raffinert kirurgiske ferdigheter. I tillegg til kirurgiske utfordringer, leveren er kjent for å ha tolerogenic egenskaper og gnagere og mennesker kan bli operativt tolerant6,7,8. Nyrene, i motsetning til de nevnte organene, kan være transplantert i en orthotopic mote, er kjent for å være en immunogenic organ med konsistent, reproduserbar avvisning episoder (hvis ikke aper), og gir mulighet for langvarig kalde iskemi tider av flere Timer. Dette gjør rotte nyrene transplantasjon en ideell modell for å studere allograft avvisning og toleranse.

Nyre transplantasjon (KT) er det foretrukne valget av behandling for pasienter med end-Stage nyresykdom. I løpet av de siste ti årene, kortsiktige overlevelse utfall etter KT har bedret seg dramatisk, men langsiktige overlevelse utfall er stillestående9. Konvensjonelle immunsuppressiv regimer forblir standard anti-avvisning terapi. Men kronisk bruk av immunsuppressiv terapier forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet, slik som nefrotoksisitet, diabetes, og sekundær ondartet10,11,12. På lang sikt, kronisk antistoff-og cellulær-mediert avvisning truer pode overlevelse, med begrensede terapeutiske alternativer tilgjengelig.

Et viktig mål i transplantasjon er induksjon av transplantasjon toleranse for å obviate behovet for kroniske immunsuppresjon. The Rat KT-modellen er et robust verktøy for å undersøke immunologiske avvisning prosessen og for å evaluere nye tilnærminger til immunomodulation og transplantasjon toleranse. Rotta fungerer også som en passende modell for å studere akutt og kronisk celle-og antistoff-mediert avvisning13, 14,15,16,17. Denne kirurgiske modellen har vist seg å være en pålitelig, reproduserbar og kostnadseffektiv verktøy for å studere ulike aspekter ved allograft avvisning og toleranse. Det er ofte brukt til å teste romanen toleranse-inducing protokoller før foretaket dyre og tungvint store dyr studier. Utføre KT i rotter krever omfattende kirurgisk trening og ekspertise for å nå overlevelse på > 90%. I dette manuskriptet og i den med følgende instruksjonsvideoen, gir vi en trinnvis oversikt for orthotopic KT i rotte, som vellykket utført i mange år på vår institusjon.

Før du starter en prosedyre, er donor-og mottaker valg kritisk og avhenger av typen eksperiment. Ideelt sett bør donorer og mottakere veie mellom 220 – 260 g og være mellom 8 – 12 ukers alder. Dyr under 220 g har liten diameter arterier, årer, og urinlederne, noe som gjør anastomose i mottakeren spesielt utfordrende. Mindre blodtap kan forårsake hypovolemi og føre til død i mindre dyr. Dyr tyngre enn 260 g vise mer fett rundt sine fartøy, og fartøyet isolasjon vil kreve mer operative tid og øke kulden iskemi tid.

Protocol

Lewis (RT11) og Dark AGOUTI (da) (RT1Aa) rotter ble kjøpt fra kommersielle leverandører (se tabellen over materialer). Disse fullt MHC-feilaktige stammer blir ofte brukt til å studere akutt renal allograft avvisning. Alle dyrene ble plassert og vedlikeholdt i henhold til National Institutes of Health ‘ s (NIH) retningslinjer i en bestemt patogen-fritt anlegg ved Johns Hopkins University. Alle prosedyrer ble godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen. <p class…

Representative Results

Vi utførte syngeneic (n = 5) og allogene nyre transplantasjon (n = 5). Dyr med en syngeneic transplantasjon oppnådde lang tids overlevelse uten noen immunsuppressiv behandling. Dyr som fikk en allogene transplantasjon uten immunsuppresjon avviste sin pode og bukket under for nyresvikt med en median overlevelse på 8 dager (Figur 4a). Gjennomsnittlig serum kreatinin økt beskjedent i syngeneic gruppen mens den økte med 14-fold i allogene gruppen (0,5 mg/d…

Discussion

I dette manuskriptet beskriver vi den kirurgiske metoden for orthotopic KT i rotter i detalj, inkludert alt nødvendig utstyr som trengs for å utføre denne prosedyren (figur 5). I 1965 publiserte Fisher og Lee den første rapporten om KT-rotter, som ble starten på et spennende undersøkende felt18. Siden da har det blitt innført mange endringer for å forbedre reproduserbarheten til denne modellen. Det har fungert som en effektiv dyremodell for å studere iskemi-r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av en generøs gave fra Bombeck Family Estate.

Materials

Buprenorphine HCL Reckitt Benckiser Healthcare UK NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved Zhenbang, China 11cm Flat handle 
Heparin sodium injection USP Sagent Pharmaceuticals  NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth Jingzhong, China WA3010
Micro needle holder Jingzhong, China WA2010
Micro vessel clamps Jingzhong, China WA40120
Micro spring sciccor 1 ROBOZ RS-5620
Micro spring sciccor 2 F.S.T. 91501-09
Micro spring sciccor 3 Zhenbang, China 8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506) Astellas
Rats Charles River & Taconic Biosciences  LEW/Crl & DA-M 
Shaver Wahl 79600-2101
Suture 4-0 Ethicon J304H
Suture, 4-0  Ethicon 683G
Suture, 10-0  Ethicon 2820G
Syringes & Needles BD
Thread, 8-0 Ashaway 75290
Ureteral cuff Microlumen 160-1 Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm 
Venous cuff Intramedic BD 7441 PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm

References

  1. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  2. Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
  3. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
  4. Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
  5. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
  6. Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
  7. Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
  8. Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
  9. Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
  10. Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
  11. Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
  12. de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
  13. Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
  14. Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
  15. Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
  16. Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
  17. Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
  18. Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
  19. Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of “weak histoincompatibility” by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
  20. Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
  21. Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
  22. Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
  23. D’Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
  24. Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
  25. Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
  26. Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
  27. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
  28. Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
  29. Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
  30. Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
  31. Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
  32. Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat–a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
  33. Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
  34. Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K., Wang, W., Wesson, R. N., Cameron, A. M., Sun, Z. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. J. Vis. Exp. (147), e59403, doi:10.3791/59403 (2019).

View Video