Summary
本手稿和程序的目的是详细解释和演示大鼠原位肾移植的手术方法。该方法简化后, 采用静脉和输尿管袖吻合术, 实现供肾的正确灌注, 缩短再灌注时间。
Abstract
与任何类型的肾脏替代疗法相比, 肾移植为终末期肾病患者提供了更高的生存率和更高的生活质量。在过去的几十年里, 大鼠肾移植模型被用来研究排斥和耐受的免疫现象。在进行昂贵的临床前大型动物研究之前, 该模型已成为测试新的免疫调节药物和方案的不可或缺的工具。
该方案提供了如何可靠地在大鼠中进行原位肾移植的详细概述。该方案包括三个独特的步骤, 增加成功的概率: 通过冲洗门静脉灌注供肾和使用袖系统来吻合肾静脉和输尿管, 从而减少寒冷和温暖缺血时间。使用这种技术, 我们已经达到了存活率超过6个月与正常血清肌酐的动物与同种或耐受的肾脏移植。根据研究的目的, 这种模型可以通过移植前或移植后的治疗来改变, 以研究急性、慢性、细胞或抗体介导的排斥反应。研究肾移植的不同方面是一种可重复、可靠、经济高效的动物模型。
Introduction
从历史上看, 第一次移植排斥研究是由布伦特和医疗通过在啮齿类动物1中进行皮肤移植进行的。很快就可以看出, 皮肤具有明显的免疫学特征, 使其成为一个高度免疫原性器官, 不同于其他血管化固体器官2的排斥反应。大鼠对固体器官移植排斥反应的研究通常仅限于心脏、肝脏和肾脏移植。虽然这些器官中的每一个都适合研究排斥, 但每个器官都有优点和缺点。心脏移植通常移植到腹部, 并与主动脉和静脉吻合, 受者的本地心脏就位 3.这并不能重现人类的临床、解剖和生理状况。此外, 心脏对冷缺血非常敏感, 必须在1小时内优先再灌注, 才能恢复其功能4。肝脏移植通常被认为是手术更具挑战性和时间敏感性的执行。去除原生肝脏后, 捐献者的肝脏必须在30分钟内植入和再灌注, 因为没有正常运作的肝脏,受者就无法持续更长的时间5。肝动脉、门静脉, 尤其是胆管重建需要精细的手术技巧。除了手术的挑战, 肝脏是已知的具有耐受性的属性和啮齿类动物和人类可以成为操作耐受6,7,8。肾脏, 不像前面提到的器官, 可以移植在一个原位的方式, 已知是一个免疫原器官与一致的, 可重复的排斥发作 (如果不是免疫抑制), 并允许长时间的冷缺血时间小时。这使得大鼠肾移植成为研究同种异体移植排斥反应和耐受性的理想模型。
肾移植 (KT) 是终末期肾病患者的首选治疗方法。在过去几十年中, KT 之后的短期生存结果有了显著改善, 但长期生存结果却停滞不前。常规免疫抑制方案仍然是标准的抗排斥治疗。然而, 长期使用免疫抑制疗法会导致显著的发病率和死亡率, 如肾毒性、糖尿病和10、11、12只继发性恶性肿瘤.长期, 慢性抗体和脂肪介导的排斥威胁移植物的生存, 有限的治疗选择可用。
移植的一个主要目标是诱导移植耐受性, 以避免慢性免疫抑制的需要。大鼠 KT 模型是研究免疫排斥过程和评估免疫调节和移植耐受新方法的可靠工具。大鼠也是研究急性和慢性细胞和抗体介导的排斥13,14,15,16, 17的合适模型。这种手术模型已被证明是一个可靠的, 可重复的, 和具有成本效益的工具, 以研究同种异体移植排斥和耐受的各个方面。在进行昂贵而繁琐的大型动物研究之前, 它经常被用来测试新的公差诱导方案。在大鼠身上进行 KT 手术需要广泛的手术培训和专业知识, 才能达到 gt;90% 的存活率。在这份手稿和随附的教学视频中, 我们为大鼠的原位 KT 提供了一个逐步的大纲, 在我们的机构成功地执行了多年。
在开始任何程序之前, 捐献者和受赠者的选择都是至关重要的, 这取决于实验的性质。理想情况下, 捐献者和受赠者的体重应在220-260 克之间, 年龄在8-12周之间。220克以下的动物有小直径的动脉、静脉和输尿管, 这使得接受者的吻合特别具有挑战性。轻微的失血会导致低血容量, 并导致较小的动物死亡。体重超过260克的动物在血管周围显示出更多的脂肪, 血管隔离将需要更多的手术时间, 并增加冷缺血时间。
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Protocol
Lewis (RT1 1) 和深色 Agouti (da)(rt1a a) 大鼠是从商业供应商处购买的 (见《材料表》)。这些完全 mhc 不匹配菌株经常被用来研究急性肾移植排斥反应。所有动物都是根据国家卫生研究院 (NIH) 的指导方针, 在约翰·霍普金斯大学的一个特定的无病原体设施中安置和饲养的。所有程序都得到了机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 捐助者程序
- 准备和高压灭菌所有的手术器械, 用于此程序的消毒手段, 并使用一次性无菌手套, 以防止传染性并发症。
- 用异氟醚吸入致头大鼠 (诱导 3%-4%, 维护 1%-2%)在剩下的程序。给所有供体和受接受动物皮下的预防性丁丙诺非, 以 0.1 mg kg 体重进行镇痛。
- 现在, 将老鼠放置在仰角, 用无菌遮罩胶带固定四肢。
- 使用机械裁剪器将腹部的头发移开。
- 使用眼睛润滑剂, 并使用在聚苯二酚碘浸泡的无菌纱布, 然后是浸泡在异丙醇的纱布, 对手术领域进行消毒。
- 在第一个切口之前, 通过检查脚趾没有夹紧戒反射, 确保大鼠被充分麻醉。
- 使用剪刀 , 首先做一个大的纵向中线皮肤和肌肉切口从联合到 , 并进入腹腔。
- 在腹壁两侧插入两把牵引器, 以暴露腹腔内。
- 用潮湿的无菌纱布覆盖肠道, 并将其转移到腹部的右侧, 暴露主动脉、静脉和左肾。用1毫升预热的盐水和1毫升注射器, 使肠道和腹部器官保持正常温度下的湿润。
- 用第二块湿纱布覆盖和动员胃和脾颅骨到肾脏, 并用一个小的湿纱布覆盖暴露的肾脏 (图 1a)。
- 使用显微外科解剖钳从结缔组织中分离和动员左肾动脉和静脉。通过对左性腺静脉进行烧蚀来隔离左肾静脉, 并通过对肾上腺动脉进行烧蚀来分离左肾动脉。之后, 通过解剖结缔组织, 将左肾椎弓根的主动脉和静脉上、下, 动员主动脉和静脉上、下 (图 1b)。
- 使用解剖钳将输尿管从结缔组织中分割和动员, 并使用微剪刀, 在从肾盆测量的长度为2厘米的对角线切口。将聚酰胺袖口 (见材料表) 插入输尿管的一半, 并通过放置一个8-0 的结固定袖口丝缝合线 (图 1c)。
注: 重要的是不要从输尿管中取出所有脂肪和结缔组织, 因为它们提供保护, 防止由粘连引起的梗阻, 并且它们的去除可能会导致输尿管坏死。注意保持血管向输尿管供氧。 - 通过解剖钳或微剪刀将左肾从肾周脂肪中分离, 从而动员左肾。保留连接肾脏的脂肪胶囊, 并使用该部位处理肾脏。
- 暴露下腔静脉。
- 在静脉中使用带有 27 G 针的注射器 , 管理 200 个单位的肝素。用棉签给注射部位按压至少 1分钟, 以防止出血。
- 识别门静脉 (pv) 和下腔静脉 (ivc) (图 1d)。用 16 G 针将50毫升的冷盐水与500单位肝素混合在门静脉中冲洗肾脏 (图 1e)。冲洗前, 在肝下水平处切除下腔静脉和针插入部位的门静脉尾端, 让血液排出循环。开始冲洗肾脏, 逐渐注入盐水溶液。观察肾脏颜色的变化, 从深红色到均匀的灰色和苍白的颜色 (图 1f)。
- 冲洗后, 将肾动脉和静脉近端连接到主动脉和静脉, 并将冲洗后的肾脏放在冰上的冷盐水中的培养皿中。图 2A表示捐献者程序的示意图概述。
- 一旦肾脏处于冷盐水中, 固定和固定静脉袖口的手柄 (见材料表), 轻轻地将肾静脉拉过袖口。然后, 用 8-0 丝缝合线 (图 2b) 放置三个结, 将肾静脉固定在袖口上。
注: 在固定静脉的同时, 要特别注意静脉的方向。旋转静脉会导致血液流动受阻, 导致血栓形成。
2. 收件人程序
- 重复捐献者过程中的步骤1.1–1.11。
- 将两个无菌微血管夹放在主动脉和静脉最近的左肾动脉和静脉 (图 3a)。
- 将受者的肾静脉与肾脏入口近端结扎。用肝素化盐水冲洗肾静脉, 将血管中所有剩余的血液取出。
- 将结扎的肾静脉滑过先前位于供体肾脏的被铐肾静脉, 并以8-0 固定丝缝合 (图 3b)。在袖口上固定肾静脉时保持相同的位置方向。
- 将输尿管连接在左肾下极的水平。从肾周脂肪中调动肾脏。
- 将肾动脉近端与受者肾脏的入口连接。用肝素化盐水冲洗, 以去除血管中多余的血液。使用10-0 尼龙缝合线 (图 3c), 对8至10个中断缝合线进行肾动脉端到端吻合。利用平位层来操纵动脉。
- 取下血管夹子, 重新启动肾脏的再灌注。首先取下静脉上的夹子, 然后是动脉上的夹子 (图 3d)。使用无菌棉签, 以减轻任何渗出区周围的吻合区域。几分钟就足以实现专利吻合。
- 简要观察肾脏以评估是否有足够的灌注。再灌注后, 肾脏应立即改变颜色, 并在几分钟后逐渐恢复其自然的暗红色 (图 3e)。输尿管的可见蠕动和现场尿液的产生有时会被观察到。
- 通过将输尿管袖口的外露尖端插入收件人输尿管并使用8-0 固定收件人输尿管完成丝缝合 (图 2 c 和图 3f)。
- 为了保持捐献者和接受者输尿管的位置, 将每个输尿管侧的两端绑起来。
- 或者, 右肾可以通过绑下右肾动脉和静脉4-0 丝缝合和切除肾脏肾。
- 从腹腔取出所有的纱布, 将所有器官恢复到自然位置, 在肠道上喷1毫升盐水以保持湿润, 并通过在直肠肌肉上使用4-0 可吸收的缝合线和4-0 丝缝合来关闭皮肤在中断的方式。
3. 术后护理
- 将动物放在干净的笼子里, 可以获得空气中的水和食物, 并允许在37°c 的加热垫上回收。
- 注射 0.1 mg/kg 丁丙诺非进行镇痛, 并监测动物的恢复情况。根据不适或疼痛的迹象, 未来几天可能需要额外的止痛药管理。抗生素不是例行使用, 因为感染并发症是罕见的。
- 观察恢复时间为 1-2小时, 然后将动物送回动物设施。检查动物2x–3x 的前 24小时, 然后进行日常检查。注意疼痛和痛苦的迹象, 口服和泌尿系统输出。
- 手术后7-10天取出缝线。
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Representative Results
我们进行了同源 (n = 5) 和同种异体肾移植 (n = 5)。进行同源移植的动物在没有任何免疫抑制治疗的情况下实现了长期生存。在没有免疫抑制的情况下接受同种异体移植的动物拒绝了移植, 并死于肾功能衰竭, 平均生存期为 8天 (图 4a)。在同种组中, 平均血清肌酐略有增加, 而同种组则增加了 14倍 (0.5 mg/dL 对 7.0 mg/dl, p & lt;0.01) (图 4b)。在解释后, 同种异体肾移植的宏观观点没有显示出任何异常。肾脏颜色和内部结构保持原封不动。相反, 被排斥动物的同种异体肾脏移植呈现红色出血性斑块, 内部结构遭到破坏 (图 4c)。血红素和异黄素染色的同种异体移植物显示薄肾小球毛细血管循环与正常数量的内皮细胞和系膜细胞。被拒绝的同种异体移植显示被破坏的肾小球结构, 有炎症和管状炎的迹象 (图 4d)。为了确认 t 细胞介导的排斥反应, 我们进行了 CD8 + 染色。虽然同种异体移植显示出很少的阳性 CD8 + T 细胞, 但被排斥的同种异体移植在肾小球和管状组织内和周围的 CD8 + 细胞数量明显较高 (图 4e), 证实 t-cl 介导的排斥。
图 1: 供体肾切除术.(A) 打开腹部时, 用潮湿的纱布隔离左肾。(B) 左肾动脉和静脉从周围的脂肪中分离和动员。(C) 输尿管用一个单一的丝质缝合线结扎、戴上手铐并固定。(D) 确定门静脉 (pv) 和下腔静脉 (ivc), 并通过门静脉灌注肾脏。(E) 灌注成功地执行, 因为正确的肾脏和肝脏变得苍白, 冲洗动物的门静脉。(F) 成功的灌注显示一个苍白的肾脏和血管准备移植。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 肾移植过程的原理图概述。(A) 捐助方程序示意图概述。(B) 袖口供体静脉示意图概述。(C) 受者与袖口供体静脉吻合及输尿管吻合术示意图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 受者肾移植.(A) 受者的动脉和静脉从周围的脂肪中动员起来, 并在分离后夹紧。(B) 引入供体肾, 静脉通过袖口技术连接, 并以8-0 固定缝合。(C) 动脉以端到端的方式缝合。(D) 拆除夹子。(E) 肾脏重新灌注, 恢复其自然的颜色, 没有任何出血。(F) 最后, 输尿管通过使用先前放置的袖口进行吻合, 并与8-0 固定缝合。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 肾移植存活.(A) 卡普兰-迈耶的数字表明, 随着时间的推移, 同种异体或同种异体肾脏移植的大鼠是存活的。(B) 与非移植动物相比, 不同基因或同种异体肾移植大鼠血清肌酐的测定和比较。(C) 第8天同种异体 (上) 肾移植和同种异体 (下) 肾移植移植的宏观概况。动物在解释之前是用生理盐水来代替的。最后两个面板显示了 (d) 血红素和 eosin 染色的微观概述, 以及 (e) cd8 + 的同源 (上) 和异基因 (底部) 肾脏外植体的微观概述。图像是在200x 放大倍率下拍摄的。* 如果p < 0.05 , 结果被认为具有统计学意义。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 所需的手术器械.(1) 直剪刀。(2) 精细剪刀。(3) 微弹簧剪刀 1 (输尿管结扎)。(4) 微弹簧剪刀2。(5) 微弹簧剪刀3。(6) 小型动物外科牵引器。(7) 钳子。(8) 微钳, 直, 光滑。(9) 解剖钳, 弯曲。(10) 微针座。(11) 针架。(12) 8-0无针编织丝缝合线。(13) 4-0 丝缝线。(14) 微容器夹具 (一对)。(15) 微容器夹紧应用。(16) 细头夹具。(17) 肝素。(18) 容器夹具 (中等大小)。(19) 容器夹具 (大)。(20) 无菌棉签。(21) 10-0 针微缝合。(22) 无菌纱布。(23) 肝素化盐水冲洗注射器。(24) 60 cc 注射器, 带针头。(25) 10 cc 注射器。(26) 1个 cc 注射器。(27) 25 g/5 英寸针。(28) 19 g 针。(29) 修剪器。(30) 双极烧焦系统。(31) 胶带。(32) 培养皿, 含0.9% 生理盐水。(33) 60 毫升注射器, 含50毫升肝素盐水, 用于灌注。(34) 10个 cc 注射器, 5 cc 肝素盐水冲洗。(35) 袖口。(36) 静脉袖口。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在本手稿中, 我们详细介绍了大鼠原位 KT 的手术方法, 包括执行此过程所需的所有必要设备 (图 5)。1965年, 费舍尔和李发表了第一份关于老鼠 KT 的报告, 这成为一个令人兴奋的调查领域18的开始。自那时以来, 已经引入了许多修改, 以提高该模型的重现性。由于部分和全部 MHC 错配组合的几个自亲和外交系的存在, 为研究缺血再灌注损伤和肾移植排斥反应和耐受性提供了有效的动物模型.大鼠 KT 模型可以作为一种工具, 在将研究范围扩大到猪和非人类灵长类动物模型之前, 对啮齿类动物肾移植排斥反应或耐受性的研究是有限的。小鼠肾移植模型在技术上具有很大的挑战性, 需要很长的训练时间才能达到 gt;80 20来的存活率.小鼠模型的另一个局限性是自然接受同种异体肾移植, 而不需要免疫抑制约30% 的受者。然而, 其他器官移植小鼠, 如皮肤和心脏, 在10天内被拒绝, 这表明排斥肾同种异体移植完全 mhc 错配小鼠是弱的, 并不代表临床情况 21。然而, 如果技术上的挑战能够克服, 老鼠模型是首选的机制研究同种异体排斥, 因为有转基因敲入或敲除小鼠。
大鼠的 KT 可以通过多种方式进行。我们将讨论这些不同方法的一些优点和缺点。无论首选的技术, 它总是至关重要的, 以减少温暖的缺血时间, 避免不可逆转的伤害移植物和受者。
右肾对左肾
大鼠的腹部解剖结构与人类非常相似。由于肝脏的解剖位置, 左肾的位置比右肾优越。使用左肾的优点之一是血管的长度。一般来说, 左肾动脉和静脉的长度是右肾血管的两倍。这在进行吻合时尤其有益, 因为在这种情况下, 血管长度不是一个限制因素。然而, 有报道的右侧供体肾回收和移植22,23。使用两个肾脏进行移植的方法也被描述了24。
通过门静脉冲洗供体肾
这个程序的关键步骤之一是供体肾灌注。灌注是必要的, 以消除所有的献血者的血液从血管和肾脏, 冷却器官, 以减缓生物恶化。有描述为灌注肾脏的各种各样的方法。我们已经尝试了以不同的方式冲洗肾脏, 并得出结论, 冲洗肾脏通过门静脉提供了优势, 并一贯导致完全灌注肾脏和血管。文献中描述的常规方法包括在结扎肾动脉和静脉后冲洗供肾, 或通过24、25、26、27 经肾下主动脉逆行,28. 这些方法可能导致内皮损伤和肾血管收缩, 因为增加局部压力或不完全灌注由于低灌注压力29,30。
通过门静脉冲洗肾脏, 压力由心脏控制。在灌注过程中, 心脏仍然处于活动状态, 并以正常方式将灌注液泵入主动脉和肾脏, 并产生脉动流, 防止剪切压力流对毛细血管和肾小球造成损害。当移植肾脏整体或使用正确的肾脏进行移植时, 这种方法适用于实现均匀的灌注和同时收获两个肾脏。
动脉和静脉吻合术
大鼠 KT 模型中最关键的步骤之一是以省时的方式进行可靠的微血管吻合。供体肾动脉可与受者的肾动脉或主动脉吻合。将供体血管与主动脉和下腔静脉吻合会导致受者器官的缺血性损伤。在这个协议中, 我们证明了端到端的肾动脉吻合术, 因为它避免了对其他器官的缺血性损伤。在动脉吻合过程中, 重要的是在处理血管时不要损坏腔的内皮表面。对于静脉吻合, 我们使用袖口技术, 以减少温暖缺血时间, 缩短手术过程。这已被证明是一个非常可靠和持久的方法, 以确保足够的静脉流动。为了确保足够的静脉流动, 当静脉固定在一起时, 必须不要扭伤或扭曲静脉。或者, 端到端静脉吻合或端到端静脉吻合是可能的, 这取决于外科医生的喜好。理想情况下, 动脉和静脉血管吻合术需要20-30分钟。
Pahlavan 等人在文献筛选31的基础上总结了每种技术的并发症。在任何显微外科血管吻合术后可能发生的主要并发症之一是血栓形成。结扎和充分冲洗受者血管可显著减少血栓形成, 这肯定不是经常观察到的并发症。其他并发症是再灌注后吻合口的泄漏或破裂。这与显微外科技术不足或血管处理不当有关。
输尿管吻合术
输尿管必须非常小心地处理, 尤其是在分离捐献者的输尿管时。输尿管周围结构的损伤可导致输尿管缺血, 导致狭窄和梗阻, 在最坏的情况下, 输尿管坏死。文献报道了输尿管吻合术的不同方法。端到端, 袖口辅助端到端, 膀胱贴膜, 膀胱插入是最常用的 19,32,33。在之前的研究中, 我们使用了两端有斜边的袖口, 以方便两端进入输尿管。我们没有观察到任何尿漏或血块的形成。然而, 这种技术的长期并发症 (和 gt;30 天) 包括肾积水和偶尔的肾结石, 这可以解释为狭窄的形成, 脱位, 或由于输尿管结石的袖口阻塞。这一发现与其他报告和我们自己的使用袖口进行输尿管吻合的发现是一致的。术后经常注意到输尿管并发症, 肾损伤严重, 无法挽救, 需要对动物进行安乐死。
术后护理和生存
移植动物的术后护理需要充分的疼痛管理和对动物的整体活动、体重观察和尿液产生的详细观察。术后早期常见的并发症包括动脉或静脉吻合出血、尿漏、输尿管梗阻或因缺血时间延长而导致移植功能延迟。有这些并发症的动物表现出适度的活动, 通常保持在一个驼背的位置, 没有泌尿系统的输出和营养摄入。一般情况下, 术后对动物进行高达1-5 毫升的盐水, 以加快其恢复速度, 防止脱水。没有免疫抑制的动物可以存活 7至10天, 这就有足够的治疗窗口来测试新的药物或其他方法。如果动物被充分的免疫抑制 (1.0 mg/gg\ day FK506 皮下注射) 或耐受性, 它们可以像以前报告的 13. 一样, 在过去6个月内长期监测。大鼠肾移植模型允许定义的机制诱导耐受机制使用独特的方法干细胞动员之前, 证实这一现象的大动物34。几十年来, rat KT 一直向调查人员提供关键信息, 今后还将继续这样做。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的资金来自邦贝克家族庄园的一份慷慨的礼物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
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