Summary
Le but de ce manuscrit et protocole est d’expliquer et de démontrer en détail la procédure chirurgicale de transplantation rénale orthotopique chez le rat. Cette méthode est simplifiée pour obtenir la perfusion correcte du rein donneur et raccourcir le temps de reperfusion en utilisant la technique de l’anastomose du brassard veineux et urétral.
Abstract
La transplantation rénale offre des taux de survie accrus et une meilleure qualité de vie pour les patients atteints d’insuffisance rénale terminale, comparativement à tout type de traitement de substitution rénale. Au cours des dernières décennies, le modèle de transplantation rénale de rat a été utilisé pour étudier les phénomènes immunologiques de rejet et de tolérance. Ce modèle est devenu un outil indispensable pour tester de nouveaux produits pharmaceutiques et schémas immunomodulateurs avant de procéder à des études de gros animaux précliniques coûteuses.
Ce protocole fournit une vue d’ensemble détaillée de comment effectuer de manière fiable la transplantation rénale orthotopique chez le rat. Ce protocole comprend trois étapes distinctes qui augmentent la probabilité de succès: perfusion du rein donneur par rinçage à travers la veine portante et l’utilisation d’un système de Brassard pour s’anastomosent les veines rénales et les ustères, réduisant ainsi le froid et chaud temps d’ischémie. En utilisant cette technique, nous avons atteint des taux de survie au-delà de 6 mois avec la créatinine sérique normale chez les animaux avec des greffes rénales syngéniques ou tolérantes. Selon le but de l’étude, ce modèle peut être modifié par des traitements antérieurs ou postgreffés pour étudier le rejet aigu, chronique, cellulaire ou médié par les anticorps. Il s’agit d’un modèle animal reproductible, fiable et rentable pour étudier différents aspects de la transplantation rénale.
Introduction
Historiquement, les premières études de rejet de greffe ont été effectuées par Brent et Medawar en utilisant des greffes de peau chez les rongeurs1. Il est vite devenu clair que la peau a des caractéristiques immunologiques distinctes, ce qui en fait un organe hautement immunogénique qui est différent dans le rejet d’autres organes solides vascularisés2. Les études de rat sur le rejet de greffe d’organe solide sont habituellement limitées aux greffes cardiaques, hépatiques et rénales. Bien que chacun de ces organes soit apte à étudier le rejet, il existe des avantages et des inconvénients pour chacun d’eux. Les greffes cardiaques sont souvent transplantées dans l’abdomen et anastomosées à l’aorte et à la veine cave, avec le cœur natif du receveur en place3. Cela ne recréent pas les conditions cliniques, anatomiques et physiologiques humaines. En outre, les coeurs sont très sensibles à l’ischémie froide et doivent être reperfusés préférentiellement dans 1 h afin de pouvoir récupérer leur fonction4. Les greffes hépatiques sont généralement considérées comme étant chirurgicalement plus difficiles et plus sensibles au temps à effectuer. Après avoir enlevé le foie indigène, le foie de donneur doit être implanté et reperfusés dans les 30 min car les receveurs ne peuvent pas durer plus longtemps sans un foie fonctionnel5. L’artère hépatique, la veine portale, et surtout la reconstruction du canal biliaire nécessitent des compétences chirurgicales raffinées. Outre les défis chirurgicaux, le foie est connu pour posséder des propriétés tolérogènes et les rongeurs et les humains peuvent devenir opérationnellement tolérants6,7,8. Le rein, contrairement aux organes susmentionnés, peut être transplanté dans une mode orthotopique, est connu pour être un organe immunogénique avec des épisodes de rejet cohérents et reproductibles (si non immunodéprimés), et permet des temps d’ischémie froide prolongée de plusieurs Heures. Cela rend la greffe de rein de rat un modèle idéal pour étudier le rejet d’allogreffe et la tolérance.
La transplantation rénale (KT) est le choix préféré du traitement pour les patients atteints d’une maladie rénale terminale. Au cours des dernières décennies, les résultats de survie à court terme après l’AC se sont améliorés de façon spectaculaire, mais les résultats de survie à long terme stagnent9. Les schémas immunosuppresseurs conventionnels demeurent le traitement antirejet standard. Cependant, l’utilisation chronique de thérapies immunosuppressives provoque une morbidité et une mortalité significatives, telles que la néphrotoxicité, le diabète et les tumeurs malignes secondaires10,11,12. À long terme, les anticorps chroniques et le rejet cellulaire menacent la survie du greffon, avec des options thérapeutiques limitées disponibles.
Un objectif majeur dans la transplantation est l’induction de la tolérance de transplantation afin d’éviter le besoin d’immunosuppression chronique. Le modèle KT de rat est un outil robuste pour étudier le processus de rejet immunologique et pour évaluer de nouvelles approches de l’immunomodulation et de la tolérance de transplantation. Le rat sert également de modèle approprié pour étudier le rejet aigu et chronique par les cellules et les anticorps,13,14,15,16,17. Ce modèle chirurgical s’est avéré être un outil fiable, reproductible et rentable pour étudier divers aspects du rejet et de la tolérance de l’allogreffe. Il est souvent utilisé pour tester de nouveaux protocoles induisant la tolérance avant d’entreprendre des études coûteuses et encombrantes sur les grands animaux. L’exécution de KT chez le rat nécessite une formation chirurgicale et une expertise approfondies pour atteindre des taux de survie de > 90%. Dans ce manuscrit et dans la vidéo d’instruction qui l’accompagne, nous fournissons un contour étape par étape pour l’AC orthotopique chez le rat, comme cela a été réalisé avec succès pendant de nombreuses années dans notre établissement.
Avant de commencer toute procédure, la sélection des donateurs et des destinataires est essentielle et dépend de la nature de l’expérience. Idéalement, les donateurs et les bénéficiaires devraient peser entre 220 et 260 g et être âgés de 8 à 12 semaines. Les animaux de moins de 220 g ont des artères, des veines et des uureters de petit diamètre, ce qui rend l’anastomose du receveur particulièrement difficile. Une légère perte de sang peut provoquer une hypovolémie et entraîner la mort chez les animaux plus petits. Les animaux de plus de 260 g affichent plus de graisses autour de leurs vaisseaux, et l’isolement des vaisseaux nécessitera plus de temps et augmentera le temps d’ischémie froide.
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Protocol
Les rats Lewis (RT11) et Dark Agouti (DA) (RT1Aa) ont été achetés auprès de vendeurs commerciaux (voir le tableau des matériaux). Ces souches complètement incompatibles avec le MHC sont souvent utilisées pour étudier le rejet de l’allogreffe rénale aiguë. Tous les animaux ont été logés et maintenus selon les directives des instituts nationaux de santé (NIH) dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes à l’Université Johns Hopkins. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
1. procédure des donateurs
- Préparer et autoclaver tous les instruments chirurgicaux à utiliser dans cette procédure comme moyen de stérilisation et utiliser des gants stériles jetables pour prévenir les complications infectieuses.
- Anesthésier le rat donneur par inhalation d’isoflurane (induction à 3% – 4% et entretien à 1% – 2%) pour le reste de la procédure. Donner à tous les animaux donneurs et receveurs une buprénorphine préemptive sous-cutanée à 0,1 mg/kg de poids corporel pour l’analgésie.
- Maintenant, placez le rat dans une position décubitus dorsal et Immobilisez les membres avec du ruban adhésif stérile.
- Utilisez une tondeuse mécanique pour enlever les poils de la zone abdominale.
- Appliquez un lubrifiant pour les yeux et utilisez de la gaze stérile imbibée d’iode povidone, suivie d’une gaze imbibée d’alcool isopropylique, pour stériliser le champ chirurgical.
- Avant la première incision, assurez-vous que le rat est convenablement anesthésié en vérifiant l’absence du réflexe de retrait de pincement de l’orteil.
- En utilisant des ciseaux, commencez par faire une grande incision longitudinale de la peau et du muscle de la symphyse pubis au xiphoïde, et entrez dans la cavité péritonéale.
- Insérez deux rétracteurs de chaque côté de la paroi abdominale afin d’exposer la cavité intra-abdominale.
- Recouvrir l’intestin d’une gaze stérile humide et la déplacer vers le côté droit de l’abdomen, exposant l’aorte, la veine cave et le rein gauche. Appliquez 1 mL de solution saline préchauffée avec une seringue de 1 CC pour garder les intestins et les organes abdominaux humides et à une température normale.
- Appliquez une deuxième gaze humide pour couvrir et mobiliser l’estomac et la rate crânienne au rein et une petite gaze humide pour couvrir le rein exposé (figure 1a).
- Utiliser des pinces de dissection microchirurgicales pour isoler et mobiliser l’artère rénale gauche et la veine du tissu conjonctif et de l’autre. Isoler la veine rénale gauche en cautérant la veine gonadique gauche et isoler l’artère rénale gauche en cautérant l’artère surrénale. Après cela, mobiliser l’aorte et la veine cave supérieure et inférieure du pédicule rénal gauche en disséquant le tissu conjonctif avec des forceps disséchants (figure 1B).
- Diviser et mobiliser l’urètre à partir du tissu conjonctif en utilisant des pinces de dissection, et faire une incision diagonale à une longueur de 2 cm mesurée à partir du bassin rénal, en utilisant des microciseaux. Insérez un brassard en polyamide (voir le tableau des matériaux) à mi-chemin dans l’urètre et fixez le brassard en plaçant un noeud avec 8-0 suture en soie (figure 1C).
NOTE: il est important de ne pas enlever tous les tissus graisseux et conjonctifs de l’urètre, car ils protègent contre l’obstruction causée par les adhérences, et leur élimination peut provoquer une nécrose urétrale. Prêter une attention particulière à la préservation du récipient fournissant de l’oxygène à l’urètre. - Mobiliser le rein gauche en le séparant de la graisse périnéphrique en utilisant des pinces ou des microciseaux disséchants. Laissez la capsule adipeuse du rein attachée et utilisez ce site pour manipuler le rein.
- Exposer la veine cave inférieure.
- Administrer 200 unités d’héparine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 27 G dans la veine du pénis. Faire pression sur le site d’injection avec un coton-tige pendant au moins 1 min pour éviter les saignements.
- Identifiez la veine portale (PV) et la Vena cave inférieure (IVC) (figure 1D). Rincer le rein en injectant 50 mL de solution saline froide mélangée avec 500 unités d’héparine dans la veine portante à l’aide d’une aiguille de 16 G (figure 1E). Avant de rincer, coupez la veine cave inférieure au niveau infrahépatique et la veine portale caudale au site d’insertion de l’aiguille pour permettre au sang de sortir de la circulation. Commencez à rincer le rein en infutilisant graduellement la solution saline. Observez un changement de couleur du rein du rouge foncé à une couleur grise et pâle uniforme (figure 1F).
- Après le rinçage, ligaturer l’artère rénale et la veine proximale de l’aorte et de la veine cave et placer le rein rincé dans une boîte de Petri dans une solution saline froide sur glace. La figure 2 A représente l’aperçu schématique de la procédure de donneur.
- Une fois que le rein est dans une solution saline froide, fixez et immobilisez la poignée du brassard de veine (voir le tableau des matériaux) et tirez doucement la veine rénale à travers le brassard. Ensuite, fixez la veine rénale au-dessus du brassard en plaçant trois noeuds en utilisant une suture de soie de huit zéros (figure 2b).
Remarque: prêchez une attention particulière à l’orientation de la veine tout en la fixant en place. Les veines pivotées provoquent une obstruction du flux sanguin et conduisent à une thrombose.
2. procédure du bénéficiaire
- Répétez les étapes 1.1 à 1.11 de la procédure de donneur.
- Placer deux pinces à micro-vaisseaux atraumatiques sur l’artère rénale gauche et la veine proximale de l’aorte et de la Vena cave (figure 3A).
- Ligate la veine rénale réceptrice proximale à l’entrée du rein. Rincer la veine rénale avec une solution saline héparinée pour éliminer tout le sang restant du vaisseau.
- Glissez la veine rénale ligné au-dessus de la veine rénale menottée précédemment positionnée dans le rein donneur et fixez-la avec un 8-0 suture en soie (figure 3B). Maintenez la même orientation positionnelle lorsque vous fixez la veine rénale sur le brassard.
- Ligate l’urètre au niveau du pôle inférieur du rein gauche. Mobilisez le rein de la graisse périnéphrique.
- Ligate l’artère rénale proximale à l’entrée du rein receveur. Rincer avec de la solution saline hépariné pour éliminer tout excès de sang dans le récipient. Effectuer une anastomose de bout en bout de l’artère rénale avec 8 à 10 sutures interrompues à l’aide d’une suture en nylon 10-0 (figure 3C). Manœuvre de l’artère en utilisant la couche adventitielle.
- Retirez les pinces du récipient pour réamorcer la reperfusion du rein. Commencez par retirer la bride de la veine suivie de la bride sur l’artère (figure 3D). Utilisez un coton-tige stérile pour faire légèrement pression sur les zones d’suintement autour de la région de l’anastomose. Quelques minutes suffisent pour obtenir une anastomose de brevet.
- Observez brièvement le rein pour évaluer la perfusion adéquate. Immédiatement après la reperfusion, le rein doit changer de couleur et retrouver graduellement sa couleur rouge foncé naturelle après quelques minutes (figure 3E). On observe parfois un péristaltisme visible de l’urètre et de la production d’urine sur place.
- Terminez en insérant la pointe exposée du brassard urétral dans l’urètre du receveur et fixez l’uétre du receveur avec un 8-0 suture en soie (figure 2C et figure 3F).
- Afin de maintenir en position le donneur et le receveur, attacher les extrémités de chaque côté de l’urètre les uns aux autres.
- En option, le rein droit peut être néphrectomisé en attachant l’artère rénale droite et la veine avec une suture de soie 4-0 et en enlevant le rein.
- Enlevez tous les gazes de la cavité abdominale, retournez tous les organes à leur position naturelle, injectez 1 ml de solution saline sur les intestins pour les garder humides, et fermez l’abdomen en utilisant une suture absorbable 4-0 sur le muscle rectus et une suture de soie 4-0 pour fermer la peau de manière interrompue.
3. soins postopératoires
- Placer l’animal dans une cage propre avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et permettre la récupération sur un coussin chauffant à 37 ° c.
- Injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour l’analgésie et surveiller l’animal pour le récupérer. L’administration d’analgésiques supplémentaires peut être nécessaire dans les prochains jours, en fonction des signes d’inconfort ou de douleur. Les antibiotiques ne sont pas administrés systématiquement, car les complications infectieuses sont rares.
- Observez la récupération pendant 1 – 2 h avant de retourner l’animal à l’animalerie. Inspecter l’animal 2x – 3x par jour pendant les 24 premiers h, suivi d’une inspection quotidienne. Faites attention aux signes de douleur et de détresse, d’ingestion orale et de sortie urinaire.
- Retirez les mailles 7 – 10 jours après l’opération.
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Representative Results
Nous avons effectué des greffes de rein syngéniques (n = 5) et allogéniques (n = 5). Les animaux ayant une greffe syngénique ont atteint une survie à long terme sans traitement immunosuppresseur. Les animaux qui ont reçu une greffe allogénique sans immunosuppression ont rejeté leur greffe et succombé à une insuffisance rénale avec une survie médiane de 8 jours (figure 4a). La créatinine sérique moyenne a augmenté modestement dans le groupe syngénique alors qu’elle a augmenté de 14 fois dans le groupe allogénique (0,5 mg/dL versus 7,0 mg/dL, p < 0,01) (figure 4B). Lors de l’explantation, la vue macroscopique de l’allogreffe de rein syngénique n’a montré aucune anomalie. La couleur du rein et les structures internes sont restées intactes. En revanche, les allogreffes rénales des animaux rejetés présentaient des taches hémorragiques rouges avec la destruction des structures internes (figure 4C). Les taches de l’hématoxyline et de l’éosine des greffes syngéniques montrent des boucles capillaires glomérulaires minces avec un nombre normal de cellules endothéliales et mésansiques. Les allogreffes rejetées montraient des structures glomérulaires détruites avec des signes d’inflammation et de tubulite (figure 4D). Pour confirmer le rejet médié par la cellule T, nous avons effectué la coloration Alors que les allogreffes syngéniques montraient très peu de cellules positives de l + T, les allogreffes rejetées montraient un nombre significativement plus élevé de cellules de 1 + + dans et autour des glomérules et des tubuli (figure 4E), confirmant le rejet médié par les lymphocytes t.
Figure 1 : Néphrectomie des donneurs. (A) lors de l’ouverture de l’abdomen, le rein gauche est isolé avec des Gauzes humides. (B) l’artère rénale gauche et la veine sont isolées et mobilisées à partir de la graisse environnante. (C) l’urètre est ligné, menotté et fixé avec une seule suture de soie. (D) la veine portale (PV) et la Vena cave inférieure (IVC) sont identifiées et le rein est perfusés par la veine portale. (E) la perfusion est exécutée avec succès car le rein droit et le foie deviennent pâles en rinçant la veine portante de l’animal. Fla perfusion réussie démontre un rein pâle et des vaisseaux prêts à être transplantés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : Aperçu schématique de la procédure de transplantation rénale. A) vue d’ensemble schématique de la procédure du donneur. B) vue d’ensemble schématique d’une veine donneuse menottée. Cvue d’ensemble schématique de l’anastomose du receveur et de la veine donneuse menottée et de l’anastomose des ustères. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Transplantation rénale chez le receveur. (A) l’artère et la veine du receveur sont mobilisées à partir de la graisse environnante et serrées après la séparation. (B) le rein donneur est introduit, et les veines sont reliées par la technique du brassard et fixées avec un 8-0 suture. (C) les artères sont suturées dans une mode de bout en bout. (D) les pinces sont enlevées. (E) le rein est reperfusés et récupère sa couleur naturelle sans saignement. (F) Enfin, les uureters sont anastomosés en utilisant le brassard précédemment placé et fixés avec un 8-0 suture. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Survie des greffes rénales. (A) la figure de Kaplan-Meyer démontre la survie des rats avec des greffes de rein syngéniques ou allogéniques au fil du temps. Bmesure et comparaison de la créatinine sérique chez les rats présentant des greffes de rein syngéniques ou allogéniques par rapport aux animaux non transplantés. (C) vue d’ensemble macroscopique des reins explicés de la transplantation rénale syngénique (supérieure) et allogénique (inférieure) au jour 8. Les animaux ont été perfusés avec une solution saline avant l’explting. Les deux derniers panneaux présentent un aperçu microscopique de la coloration (D) de l’hématoxyline et de l’éosine et (E) de l’explants de rein (en haut) et de l’allogénique (en bas) de l’acide syngénique. Les images sont prises sous grossissement 200X. * Les résultats ont été jugés statistiquement significatifs si p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Instruments chirurgicaux requis . (1) ciseaux droits. (2) ciseaux fins. (3) micro-ciseaux à ressort 1 (ligature de l’urètre). (4) ciseaux micro-ressorts 2. (5) ciseaux micro-ressorts 3. (6) rétracteurs chirurgicaux pour petits animaux. (7) forceps. (8) microforceps, droit, lisse. (9) pinces de dissection, incurvées. (10) porte-aiguille micro. (11) porte aiguille. (12) 8-0 suture en soie tressée sans aiguille. (13) 4-0 suture en soie. (14) pinces micro-vaisseaux (une paire). (15) pince de serrage micro-cuve. (16) pince à pointe fine. (17) héparine. (18) bride du récipient (taille moyenne). (19) bride de cuve (grande). (20) Écouvillons stériles en coton. (21) 10-0 micro-suture avec aiguille. (22) gaze stérile. (23) seringue de rinçage saline hépariné. (24) 60 seringue CC avec aiguille. (25) seringue de 10 cm3. (26) 1 seringue CC. (27) 25 G 5/8 pouces aiguilles. (28) aiguilles 19 G. (29) Trimmer. (30) système de cauterie bipolaire. (31) ruban adhésif. (32) boîte de Petri avec 0,9% de solution saline normale. (33) 60 seringue CC avec solution saline hépariné 50 CC pour perfusion. (34) seringue de 10 cm3 avec 5 CC de rinçage à la solution saline hépariné. (35) brassard de l’urètre. (36) brassard de veine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons en détail la méthode chirurgicale pour l’AC orthotopique chez le rat, y compris tous les équipements nécessaires pour effectuer cette procédure (figure 5). En 1965, Fisher et Lee ont publié le premier rapport sur l’AC chez les rats, qui est devenu le début d’un champ d’investigation passionnant18. Depuis lors, de nombreuses modifications ont été introduites pour améliorer la reproductibilité de ce modèle. Il a servi de modèle animal efficace pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion et le rejet et la tolérance des greffes rénales, grâce à la disponibilité de plusieurs souches consanguines et non consanguine avec des combinaisons partielles et complètes de discordance de MHC19. Le modèle KT de rat peut servir d’outil pour tester des hypothèses avant d’étendre les investigations aux modèles de primates non humains de l’KT. les options pour étudier le rejet de greffe de rein ou la tolérance chez les rongeurs sont limitées. Le modèle de transplantation rénale chez la souris est techniquement très difficile et nécessite une longue période d’entraînement pour atteindre des taux de survie de > 80%20. Une autre limitation du modèle de souris est l’acceptation spontanée d’allogreffe rénale sans nécessité d’immunosuppression chez environ 30% des receveurs. Cependant, d’autres greffes d’organes chez des souris, comme la peau et le cœur, sont rejetées dans les 10 jours, ce qui suggère que le rejet des allogreffes rénales chez les souris totalement incompatibles avec la MHC est faible et n’est pas représentatif de la situation clinique21. Cependant, si le défi technique peut être surmonté, les modèles de souris sont préférés pour des études de mécanisme de rejet d’allogreffe en raison de la disponibilité de souris knock-in ou knock-out génétiquement modifiées.
KT chez le rat peut être effectué de plusieurs façons. Nous discuterons de quelques avantages et inconvénients de ces différentes méthodes. Quelle que soit la technique préférée, il est toujours essentiel de réduire le temps d’ischémie tiède et d’éviter des lésions irréversibles au greffon et au receveur.
Droit versus rein gauche
L’anatomie abdominale des rats est très similaire à celle des humains. Le rein gauche est situé supérieur par rapport au rein droit en raison de la position anatomique du foie. L’un des avantages de l’utilisation du rein gauche est la longueur des vaisseaux. En général, l’artère rénale gauche et la veine sont deux fois la longueur des vaisseaux rénaux droits. Ceci est particulièrement bénéfique lors de l’exécution d’une anastomose où la longueur des vaisseaux n’est pas un facteur limitatif. Cependant, il existe des rapports de prélèvement et de transplantation de rein de donneur à droite22,23. Des approches utilisant les deux reins pour la transplantation ont également été décrites24.
Rinçage du rein donneur via la veine portale
L’une des étapes clés de cette procédure est la perfusion rénale du donneur. La perfusion est nécessaire pour éliminer tout le sang de donneur des vaisseaux et des reins et pour refroidir l’organe vers le bas pour ralentir la détérioration biologique. Il existe différentes méthodes décrites pour perfusant le rein. Nous avons expérimenté avec le rinçage du rein de différentes façons et a conclu que le rinçage du rein à travers la veine porte offre des avantages et conduit systématiquement à la perfusion complète du rein et des vaisseaux. Les approches conventionnelles décrites dans la littérature impliquent le rinçage du rein donneur après ligature de l’artère rénale et la veine ou rétrograde par l’aorte infrarénaux24,25,26,27 , 28. ces approches peuvent entraîner des lésions endothéliales et une vasoconstriction rénale en raison de pressions locales accrues ou d’une perfusion incomplète due à une faible pression de perfusion29,30.
En rinçant le rein à travers la veine portale, la pression est gérée par le cœur. Pendant la perfusion, le cœur est toujours actif et pompe le liquide de perfusion de façon normale à l’aorte et au rein avec écoulement pulsatile, empêchant les dommages aux capillaires et aux glomérules dus au débit de pression de cisaillement. En transplantant des reins en bloc ou en utilisant le rein droit pour la transplantation, cette méthode est appropriée pour obtenir une perfusion uniforme et pour récolter les deux reins en même temps.
Anastomose artérielle et veineuse
L’une des étapes les plus critiques du modèle KT de rat est d’effectuer une anastomose microvasculaire fiable de manière efficace dans le temps. L’artère rénale du donneur peut être anastomosée à l’artère rénale du receveur ou à l’aorte. L’anastomosage des vaisseaux donneurs vers l’aorte et la veine cave inférieure provoque une lésion ischémique des organes du receveur. Dans ce protocole, nous démontrons l’anastomose de bout en bout des artères rénales, car elle évite les lésions ischémiques à d’autres organes. Au cours de l’anastomose artérielle, il est important de ne pas endommager la surface endothéliale de la lumière lors de la manipulation du navire. Pour l’anastomose veineuse, nous utilisons une technique de Brassard pour réduire le temps d’ischémie tiède et raccourcir la procédure opératoire. Cela s’est avéré être une méthode très fiable et durable pour assurer un écoulement veineux adéquat. Pour assurer un écoulement veineux adéquat, il est impératif que les veines ne soient pas entortillées ou vrillées lorsque celles-ci sont fixées ensemble. Alternativement, une anastomose de bout-à-bout ou de bout-à-côté est possible, selon la préférence du chirurgien. Idéalement, l’anastomose des vaisseaux artériels et veineux doit prendre entre 20 et 30 min.
Pahlavan et coll. ont résumé les complications de chaque type de technique sur la base d’un dépistage de la littérature31. Une des principales complications qui peuvent survenir après toute anastomose du vaisseau MICROCHIRURGICAL est la thrombose. La ligature et le rinçage adéquat des vaisseaux récepteurs réduisent significativement la formation de thrombose, et ce n’est certainement pas une complication fréquemment observée. D’autres complications sont la fuite ou la rupture de l’anastomose après reperfusion. Ceci est lié à une technique microchirurgicale inadéquate ou à une manipulation inadéquate des vaisseaux.
Anastomose urétérale
L’urètre doit être manipulé avec le plus grand soin, surtout lors de l’isolement de l’urètre dans le donneur. Les lésions aux structures périurémiques peuvent provoquer une ischémie urétrale entraînant des restrictions et une obstruction et, dans le pire des cas, une nécrose urétrale. La littérature rapporte différentes méthodes pour l’anastomose urétérale. Bout-à-bout, bout-à-bout assisté par brassard, patch de vessie, et insertion de la vessie sont les plus couramment utilisés19,32,33. Dans les études précédentes, nous avons utilisé un brassard avec des bords obliques sur les deux extrémités pour faciliter l’entrée dans l’urètre sur les deux extrémités. Nous n’avons observé aucune fuite d’urine ou formation de caillots sanguins. Cependant, les complications à long terme (> 30 jours) de cette technique comprennent l’hydronéphrose et occasionnellement la néphrolithiase, qui peut être expliquée par la formation de sténose, la dislocation, ou l’obstruction du brassard due à des pierres urétérales. Cette constatation est cohérente avec d’autres rapports et nos propres résultats de l’anastomose urétérale avec un brassard. Les complications urétrales sont souvent remarquées postopératoires après une blessure importante au rein, sont inrécupérables, et exigent que l’animal soit euthanasié.
Soins postopératoires et survie
Les soins postopératoires des animaux transplantés nécessitent une gestion adéquate de la douleur et des observations détaillées de l’activité globale des animaux, des observations de poids et de la production d’urine. Les complications précoces postopératoires courantes comprennent les saignements de l’anastomose artérielle ou veineuse, les fuites d’urine, l’obstruction urétrale ou la fonction de greffe retardée en raison d’une durée d’ischémie prolongée. Les animaux avec ces complications montrent une activité modeste et restent généralement dans une position de dos de Bossi sans sortie urinaire et apport nutritif. En général, il est favorable d’administrer jusqu’à 1 – 5 mL de solution saline aux animaux postopératoires pour accélérer leur rétablissement et prévenir la déshydratation. Les animaux qui ne reçoivent pas d’immunosuppression peuvent survivre entre 7 et 10 jours, ce qui permet une fenêtre thérapeutique suffisante pour tester de nouveaux médicaments ou d’autres méthodes. Si les animaux sont adéquatement immunodéprimés (1,0 mg/kg/jour FK506 par voie sous-cutanée) ou tolérants, ils peuvent être surveillés à long terme au cours des 6 derniers mois, comme indiqué précédemment13. Le modèle de transplantation rénale de rat a permis la définition des mécanismes de tolérance induits par l’utilisation d’une approche unique de la mobilisation des cellules souches avant de confirmer ce phénomène chez les gros animaux34. Rat KT a fourni des informations cruciales aux enquêteurs pendant des décennies, et il continuera à le faire à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par un don généreux du domaine familial Bombeck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C.
- Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
- Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
- Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
- Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
- Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
- Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
- de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
- Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
- Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
- Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
- Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
- Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
- Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
- Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of "weak histoincompatibility" by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
- Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Silber, S. J., Crudop, J.
- D'Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
- Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
- Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
- Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
- Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
- Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat--a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
- Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
- Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).
