Ortotopisk råtta njure transplantation: en ny och förenklad kirurgisk metod
Summary
Syftet med detta manuskript och protokoll är att i detalj förklara och demonstrera det kirurgiska ingreppet av ortotopisk njur transplantation hos råttor. Denna metod är förenklad för att uppnå rätt per fusion av givarens njure och förkorta reperfusion tid med hjälp av venösa och uretär manschetten anastomos teknik.
Abstract
Njur transplantation erbjuder ökad överlevnads grad och förbättrad livskvalitet för patienter med Terminal njur sjukdom, jämfört med någon typ av njur ersättnings behandling. Under de senaste decennierna, råtta njure transplantation modell har använts för att studera immunologiska fenomen avstötning och tolerans. Denna modell har blivit ett oumbärligt verktyg för att testa nya immunmodulerande läkemedel och regimer innan man går vidare med dyra prekliniska, stora djur studier.
Detta protokoll ger en detaljerad översikt över hur man tillförlitligt utföra ortotopisk njur transplantation hos råttor. Detta protokoll innehåller tre distinkta steg som ökar sannolikheten för framgång: per fusion av donatorns njure genom att spola genom portalen ven och användningen av en manschett system för att anastomose njurvener och ureters, vilket minskar kallt och varmt ischemi tider. Med denna teknik har vi uppnått överlevnads tal längre än 6 månader med normal serumkreatinin hos djur med syngena eller toleranta njur transplantationer. Beroende på syftet med studien, denna modell kan modifieras av pre-eller posttransplanterade behandlingar för att studera akut, kronisk, cellulär, eller anti kropp-medierad avslag. Det är en reproducerbar, pålitlig och kostnads effektiv djur modell för att studera olika aspekter av njur transplantation.
Introduction
Historiskt sett utfördes de första transplantations avstötnings studierna av Brent och Medawar med hjälp av hud transplantationer på gnagare1. Det blev snart klart att huden har distinkta immunologiska egenskaper, vilket gör det till ett mycket immunogent organ som är annorlunda i avstötning från andra vaskulariserad solida organ2. Råtta studier av fast organ transplantation avslag är vanligt vis begränsad till hjärta, lever, och njure transplantationer. Även om var och en av dessa organ är lämplig för att studera avslag, det finns fördelar och nack delar med var och en av dem. Hjärt transplantationer transplanteras ofta in i buken och anastomoseras till aorta och Vena Cava, med mottagarens infödda hjärta på plats3. Detta återskapar inte humana kliniska, anatomiska och fysiologiska tillstånd. Dessutom, hjärtan är mycket känsliga för kall ischemi och måste reperfused företrädes vis inom 1 h för att kunna återvinna sin funktion4. Lever transplantationer anses i allmänhet vara kirurgiskt mer utmanande och tids känsliga att utföra. Efter avlägsnande av den infödda levern, donator levern måste implanteras och reperfused inom 30 min som mottagarna inte kan pågå längre utan en fungerande lever5. Den hepatiska artären, Portal ven, och särskilt Gall kanalen rekonstruktion kräver raffinerade kirurgiska färdigheter. Förutom de kirurgiska utmaningarna är levern känd för att inneha tolerogena egenskaper och gnagare och människor kan bli operationellt toleranta6,7,8. Njuren, till skillnad från de ovan nämnda organen, kan transplanteras i en ortotopisk mode, är känt för att vara ett immunogent organ med konsekventa, reproducerbara avstötnings episoder (om inte immunsupprimerade), och möjliggör långvarig kall ischemi tider av flera Timmar. Detta gör rått njure transplantation en idealisk modell för att studera transplantatavstötning avstötning och tolerans.
Njur transplantation (KT) är det föredragna valet av behandling för patienter med njur sjukdom i slutstadiet. Under de senaste decennierna, kortsiktiga överlevnad resultat efter KT har förbättrats dramatiskt, men långsiktiga överlevnad resultat är stagnerande9. Konventionella immunsuppressiva regimer förblir standard anti-avvisande behandling. Emellertid, kronisk användning av immunosuppressiva terapier orsakar betydande sjuklighet och dödlighet, såsom nefrotoxicitet, diabetes, och sekundära maligniteter10,11,12. På lång sikt, kronisk anti kropp-och cellulär-medierad avstötning hotar transplantat överlevnad, med begränsade terapeutiska alternativ tillgängliga.
Ett viktigt mål vid transplantation är induktion av transplantations tolerans för att undanröja behovet av kronisk immunsuppression. Den råtta kt modell är en robust redskap till undersöka den immunologisk avstötning förlopp och till bedöma ny närma sig till immun modulering och transplantations tolerans. Råttan fungerar också som en lämplig modell för att studera akuta och kroniska cell-och antikroppsmedierade avstötning13,14,15,16,17. Denna kirurgiska modell har visat sig vara ett tillförlitligt, reproducerbart och kostnads effektivt verktyg för att studera olika aspekter av transplantatavstötning och tolerans. Det används ofta för att testa nya tolerans-inducerande protokoll innan företaget dyra och besvärliga stora djur studier. Att utföra KT i råttor kräver omfattande kirurgisk träning och expertis för att nå överlevnads grad på > 90%. I detta manuskript och i medföljande instruktions video, ger vi en steg-för-steg disposition för ortotopisk KT i råtta, som framgångs rikt utförs i många år på vår institution.
Innan ett förfarande inleds är givar-och mottagar urvalet kritiskt och beror på försöks verksamhetens art. Helst bör donatorer och mottagare väga mellan 220 – 260 g och vara mellan 8 – 12 veckors ålder. Djur under 220 g har små-diameter artärer, vener, och ureters, vilket gör anastomosen i mottagaren särskilt utmanande. Mindre blod förlust kan orsaka hypovolemi och leda till döden hos mindre djur. Djur tyngre än 260 g Visa mer fett runt sina fartyg, och fartygets isolering kommer att kräva mer operativ tid och öka den kalla ischemi tiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript beskriver vi den kirurgiska metoden för ortotopisk KT hos råttor i detalj, inklusive all nödvändig utrustning som behövs för att utföra denna procedur (figur 5). I 1965, Fisher och Lee publicerade den första rapporten om KT i råttor, som blev början på en spännande undersökande fält18. Sedan dess har många ändringar införts för att förbättra reproducerbarheten för denna modell. Det har fungerat som en effektiv djur modell för a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av en generös gåva från Bombeck Family Estate.
Materials
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
- Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
- Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
- Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
- Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
- Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
- Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
- de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
- Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
- Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
- Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
- Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
- Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
- Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
- Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of “weak histoincompatibility” by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
- Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
- Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
- D’Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
- Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
- Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
- Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
- Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
- Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat–a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
- Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
- Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).
