Summary

Trapianto di rene ortotopico ratto: un nuovo approccio chirurgico semplificato

Published: May 07, 2019
doi:

Summary

Lo scopo di questo manoscritto e protocollo è quello di spiegare e dimostrare in dettaglio la procedura chirurgica del trapianto di rene ortotopico nei ratti. Questo metodo è semplificato per ottenere la corretta perfusione del rene donatore e abbreviare il tempo di riperfusione utilizzando la tecnica di anastomosi del polsino venoso e ureterale.

Abstract

Il trapianto di rene offre un aumento dei tassi di sopravvivenza e una migliore qualità della vita per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale, rispetto a qualsiasi tipo di terapia sostitutiva renale. Nel corso degli ultimi decenni, il modello di trapianto di rene di ratto è stato utilizzato per studiare i fenomeni immunologici di rigetto e tolleranza. Questo modello è diventato uno strumento indispensabile per testare nuovi farmaci e regimi immunomodulatori prima di procedere con costosi studi preclinici su animali di grandi dimensioni.

Questo protocollo fornisce una panoramica dettagliata su come eseguire in modo affidabile il trapianto di rene ortotopico nei ratti. Questo protocollo comprende tre passaggi distintivi che aumentano la probabilità di successo: perfusione del rene donatore da vampate attraverso la vena portale e l’uso di un sistema di polsino per anastomose le vene renali e ureteri, diminuendo così freddo e caldo tempi di ischemia. Utilizzando questa tecnica, abbiamo raggiunto tassi di sopravvivenza oltre i 6 mesi con la normale creatinina sierica negli animali con trapianti renali singenici o tollerante. A seconda dello scopo dello studio, questo modello può essere modificato da trattamenti pre-o post-trapianto per studiare il rigetto acuto, cronico, cellulare o mediato dagli anticorpi. Si tratta di un modello animale riproducibile, affidabile e conveniente per studiare diversi aspetti del trapianto di rene.

Introduction

Storicamente, i primi studi di rigetto del trapianto sono stati eseguiti da Brent e Medawar utilizzando trapianti di pelle nei roditori1. Ben presto divenne chiaro che la pelle ha caratteristiche immunologiche distinte, rendendolo un organo altamente immunogenico che è diverso nel rigetto da altri organi solidi vascolarizzati2. Studi di ratto di rigetto di trapianto di organo solido sono abitualmente limitati a cuore, fegato, e trapianti di rene. Anche se ciascuno di questi organi è adatto a studiare il rigetto, ci sono vantaggi e svantaggi per ciascuno di essi. I trapianti cardiaci sono spesso trapiantati nell’addome e anastomosed all’aorta e alla vena cava, con il cuore nativo del ricevente in posizione3. Questo non ricrea le condizioni cliniche umane, anatomiche e fisiologiche. Inoltre, i cuori sono molto sensibili all’ischemia fredda e devono essere riperfuso preferenzialmente entro 1 h al fine di essere in grado di recuperare la loro funzione4. I trapianti di fegato sono generalmente considerati chirurgicamente più impegnativi e sensibili al tempo per eseguire. Dopo aver rimosso il fegato nativo, il fegato donatore deve essere impiantato e riperfuso entro 30 min come i destinatari non possono durare più a lungo senza un fegato funzionante5. L’arteria epatica, la vena del portale e soprattutto la ricostruzione del dotto biliare richiedono abilità chirurgiche raffinate. Oltre alle sfide chirurgiche, il fegato è noto per possedere proprietà tollerogeniche e roditori e gli esseri umani possono diventare operalmente tolleranti6,7,8. Il rene, a differenza degli organi di cui sopra, può essere trapiantato in modo ortotopico, è noto per essere un organo immunogeno con episodi di rigetto coerenti e riproducibili (se non immunosoppressi), e consente tempi prolungati di ischemia fredda di diversi Ore. Questo rende il trapianto di rene di ratto un modello ideale per studiare il rigetto e la tolleranza dell’alloinnesto.

Il trapianto di rene (KT) è la scelta preferita di trattamento per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Negli ultimi decenni, i risultati di sopravvivenza a breve termine dopo KT sono migliorati drasticamente, ma i risultati di sopravvivenza a lungo termine sono stagnanti9. I regimi immunosoppressori convenzionali restano la terapia standard anti-rigetto. Tuttavia, l’uso cronico di terapie immunosoppressive provoca morbilità e mortalità significative, come nefrotossicità, diabete e neoplasie secondarie10,11,12. Nel lungo termine, il rigetto cronico di anticorpi e cellulari-mediati minaccia la sopravvivenza del trapianto, con limitate opzioni terapeutiche disponibili.

Un obiettivo importante nel trapianto è l’induzione della tolleranza al trapianto al fine di ovviare alla necessità di immunosoppressione cronica. Il modello di ratto KT è uno strumento robusto per indagare il processo di rigetto immunologico e per valutare nuovi approcci all’immunomodulazione e alla tolleranza al trapianto. Il ratto funge anche da modello adatto per lo studio di rigetto acuto e cronico di cellule e anticorpi mediati13,14,15,16,17. Questo modello chirurgico ha dimostrato di essere uno strumento affidabile, riproducibile e conveniente per studiare vari aspetti del rigetto e della tolleranza dell’alloinnesto. Viene spesso utilizzato per testare nuovi protocolli che inducano la tolleranza prima di intraprendere studi costosi e ingombranti su grandi animali. L’esecuzione di KT in ratti richiede un’ampia formazione chirurgica e competenze per raggiungere tassi di sopravvivenza di > 90%. In questo manoscritto e nel video didattico di accompagnamento, forniamo un contorno passo-passo per il KT ortotopico nel ratto, come eseguito con successo per molti anni presso la nostra istituzione.

Prima di iniziare qualsiasi procedura, la selezione del donatore e del destinatario è critica e dipende dalla natura dell’esperimento. Idealmente, i donatori e i riceventi dovrebbero pesare tra 220 – 260 g ed essere tra 8 – 12 settimane di età. Gli animali sotto 220 g hanno arterie di piccolo diametro, vene e ureteri, rendendo l’anastomosi nel ricevente particolarmente impegnativa. Una minore perdita di sangue può causare ipovolemia e portare alla morte in animali più piccoli. Animali più pesanti di 260 g mostrano più grasso intorno ai loro vasi, e l’isolamento della nave richiederà più tempo operativo e aumentare il tempo di ischemia fredda.

Protocol

Lewis (RT11) e Dark Agouti (da) (RT1Aa) ratti sono stati acquistati da venditori commerciali (vedere la tabella dei materiali). Questi ceppi completamente non corrispondenti a MHC sono spesso usati per studiare il rigetto acuto dell’alloinnesto renale. Tutti gli animali sono stati alloggiati e mantenuti secondo le linee guida nazionali degli istituti di salute (NIH) in una struttura specifica priva di agenti patogeni presso la Johns Hopkins University. Tutte le procedure sono state …

Representative Results

Abbiamo eseguito trapianti di rene singenici (n = 5) e allogenico (n = 5). Gli animali con un trapianto syngeneico hanno raggiunto la sopravvivenza a lungo termine senza alcun trattamento immunosoppressivo. Gli animali che hanno ricevuto un trapianto allogenico senza immunosoppressione hanno respinto il loro innesto e hanno ceduto all’insufficienza renale con una sopravvivenza mediana di 8 giorni (Figura 4a). La creatinina sierica media è aumentata modesta…

Discussion

In questo manoscritto, descriviamo in dettaglio il metodo chirurgico per il KT ortotopico nei ratti, comprese tutte le attrezzature necessarie per eseguire questa procedura (Figura 5). Nel 1965, Fisher e Lee pubblicarono il primo rapporto sul KT in ratti, che divenne l’inizio di un emozionante campo investigativo18. Da allora, sono state introdotte molte modifiche per migliorare la riproducibilità di questo modello. Ha servito come un modello animale efficace per stu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da un generoso dono della tenuta di famiglia Bombeck.

Materials

Buprenorphine HCL Reckitt Benckiser Healthcare UK NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved Zhenbang, China 11cm Flat handle 
Heparin sodium injection USP Sagent Pharmaceuticals  NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth Jingzhong, China WA3010
Micro needle holder Jingzhong, China WA2010
Micro vessel clamps Jingzhong, China WA40120
Micro spring sciccor 1 ROBOZ RS-5620
Micro spring sciccor 2 F.S.T. 91501-09
Micro spring sciccor 3 Zhenbang, China 8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506) Astellas
Rats Charles River & Taconic Biosciences  LEW/Crl & DA-M 
Shaver Wahl 79600-2101
Suture 4-0 Ethicon J304H
Suture, 4-0  Ethicon 683G
Suture, 10-0  Ethicon 2820G
Syringes & Needles BD
Thread, 8-0 Ashaway 75290
Ureteral cuff Microlumen 160-1 Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm 
Venous cuff Intramedic BD 7441 PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm

References

  1. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  2. Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
  3. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
  4. Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
  5. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
  6. Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
  7. Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
  8. Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
  9. Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
  10. Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
  11. Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
  12. de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
  13. Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
  14. Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
  15. Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
  16. Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
  17. Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
  18. Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
  19. Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of “weak histoincompatibility” by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
  20. Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
  21. Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
  22. Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
  23. D’Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
  24. Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
  25. Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
  26. Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
  27. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
  28. Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
  29. Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
  30. Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
  31. Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
  32. Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat–a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
  33. Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
  34. Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K., Wang, W., Wesson, R. N., Cameron, A. M., Sun, Z. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. J. Vis. Exp. (147), e59403, doi:10.3791/59403 (2019).

View Video