Summary
Her præsenterer vi en metode til at registrere embryonale muskelsammentrækninger i Drosophila embryoner i en ikke-invasiv og detaljeorienteret måde.
Abstract
Koordinerede muskelsammentrækninger er en form for rytmisk adfærd set tidligt under udviklingen i Drosophila embryoner. Neuronal sensoriske feedback kredsløb er forpligtet til at styre denne adfærd. Manglende fremstilling af det rytmiske mønster af sammentrækninger kan være tegn på neurologiske abnormiteter. Vi har tidligere konstateret, at defekter i protein O-mannosylation, en posttranslationel protein modifikation, påvirke Axon morfologi af sensoriske neuroner og resultere i unormale koordinerede muskelsammentrækninger i embryoner. Her præsenterer vi en forholdsvis enkel metode til at registrere og analysere mønsteret af peristaltiske muskelsammentrækninger ved levende billeddannelse af sene stadie embryoner op til udklæknings punktet, som vi plejede at karakterisere muskel kontrakternes fænotype af protein O-mannosyltransferase-mutanter. Data fra disse optagelser kan bruges til at analysere muskel sammentrækning bølger, herunder hyppighed, retningen af formering og relative amplitude af muskelsammentrækninger på forskellige krops segmenter. Vi har også undersøgt kropsholdning og udnyttet en fluorescerende markør udtrykt specifikt i muskler til præcist at bestemme positionen af embryo-midterlinjen. En lignende tilgang kan også udnyttes til at studere forskellige andre adfærd under udvikling, såsom embryo rullende og klækning.
Introduction
Peristaltisk muskelsammentrækning er en rytmisk motorisk adfærd svarende til at gå og svømme i mennesker1,2,3. Embryonale muskelsammentrækninger set i Drosophila sene stadier embryoner repræsenterer et eksempel på en sådan adfærd. Drosophila er en fremragende model organisme til at studere forskellige udviklingsmæssige processer, fordi embryonale udvikling i Drosophila er velkarakteriseret, relativt kort, og let at overvåge. Det overordnede mål med vores metode er omhyggeligt at registrere og analysere det bølgende mønster af sammentrækning og afslapning af embryonale muskler. Vi brugte en enkel, ikke-invasiv tilgang, der tilbyder en detaljeret visualisering, registrering og analyse af muskelsammentrækninger. Denne metode kan også potentielt anvendes til at studere andre in vivo processer, såsom embryonale rullende ses i sene stadier embryoner lige før klækning. I tidligere undersøgelser, embryonale muskelsammentrækninger blev for det meste analyseret med hensyn til hyppighed og retning1,2. For at estimere det relative omfang af sammentrækninger, når de skrider frem langs krops aksen i den forreste eller bageste retning, har vi brugt embryoner, der udtrykker GFP specifikt i musklerne. Denne analyse giver en mere kvantitativ måde at analysere muskelsammentrækninger og at afsløre, hvordan kropsholdning i embryoner opretholdes i løbet af rækken af peristaltiske bølger af muskelsammentrækninger.
Peristaltiske muskelsammentrækninger styres af central Pattern generator (CPG) kredsløb og kommunikation mellem neuroner i det perifere nervesystem (PNS), centralnervesystemet (CNS), og muskler4,5. Manglende fremstilling af normale peristaltiske muskelsammentrækninger kan føre til defekter såsom manglende luge2 og unormal larve bevægelse6 og kan være tegn på neurologiske abnormiteter. Levende billeddannelse af peristaltiske bølger af muskelsammentrækning og detaljeret analyse af sammentrækning fænotyper kan hjælpe afdække patogene mekanismer forbundet med genetiske defekter påvirker muskler og neurale kredsløb involveret i bevægelse. Vi har for nylig brugt denne tilgang til at undersøge mekanismer, der resulterer i en kropsholdning torsion fænotype protein O-mirrisyltransferase (pomt) mutanter7.
Protein O-mannosylation (POM) er en særlig type post translationel modifikation, hvor der tilsættes mannose sukker til Serin eller Threonin rester af sekretoriske pathway proteiner8,9. Genetiske defekter i POM forårsage medfødte muskuløse dystrofier (cmd) i mennesker10,11,12. Vi undersøgte de kausative mekanismer af disse sygdomme ved hjælp af Drosophila som et model system. Vi fandt, at embryoner med mutationer i Drosophila protein O-mannosyltransferase gener POMT1 og POMT2 (alias roteret mave (rt) og snoet (tw)) viser en forskydning ("rotation") af krops segmenter, hvilket resulterer i en unormal kropsholdning7. Interessant, denne defekt faldt sammen med den udviklingsmæssige fase, når peristaltiske muskelsammentrækninger bliver fremtrædende7.
Da unormal kropsholdning i POM-mutant embryoner opstår, når muskulatur og epidermis allerede er dannet, og peristaltiske bølger af koordinerede muskelsammentrækninger er begyndt, har vi en hypotese om, at unormal kropsholdning kan være et resultat af unormal muskel sammentrækninger snarere end en defekt i muskler eller/og epidermis morfologi7. Cmd'er kan forbindes med unormale muskelsammentrækninger og kropsholdning defekter13, og dermed analysen af kropsholdning fænotype i Drosophila pomt mutanter kan belyse patologiske mekanismer forbundet med muskuløse dystrofier . For at undersøge forholdet mellem kropsholdning fænotype af Drosophila pomt mutanter og mulige abnormaliteter i peristaltiske bølger af muskelsammentrækninger, vi besluttede at analysere muskelsammentrækninger i detaljer ved hjælp af en levende Imaging tilgang.
Vores analyse af peristaltiske sammentrækning bølger i Drosophila embryoner afslørede to særskilte sammentrækning modes, udpeget som type 1 og type 2 bølger. Type 1 bølger er simple bølger formerings fra forreste til posterior eller omvendt. Type 2 bølger er bifasisk bølger, der indleder ved den forreste ende, udbrede halvvejs i den bageste retning, momentant standse, danner en tidsmæssig statisk sammentrækning, og derefter, i den anden fase, er fejet af en Peristaltisk sammentrækning, som udbreder fremad fra den bageste ende. Vildtype embryoner genererer normalt en serie af sammentrækninger, der består af ca. 75% type 1 og 25% type 2 bølger. I modsætning hertil genererer Pomt -mutant embryoner type 1 og type 2 bølger ved omtrent lige relative frekvenser.
Vores tilgang kan give detaljerede oplysninger til kvantitativ analyse af muskelsammentrækninger og embryo rullende7. Denne fremgangsmåde kan også tilpasses til analyser af andre adfærd, der involverer muskelsammentrækninger, såsom udklækning og kravle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
- Forbered et flue bur ved at gøre ca. 50 huller i en 100 mL kapacitet Tri-Corner plast bæger ved hjælp af en varm 25 G nål (Se tabel over materialer).
- Forbered 60 mm x 15 mm Petri skåle med æblesaft-agar (3% agar og 30% æblesaft).
- Forbered frisk gær pasta ved at blande tør gær granulat og vand. Spred gær pastaen på æble agarpladerne for at øge æglægningen.
- Bedøvelse omkring 50-60 fluer (brug omtrent lige mange mænd og kvinder) på CO2 og læg dem i flue buret.
Bemærk: Ved hjælp af en øget andel af kvinder (op til ~ 2:1 forholdet mellem kvinder: mænd) kan bidrage til at øge mængden af æg til nogle genotyper. - Fastgør en æblesaft-agar Petri skål med gær pasta til flue buret stramt og forsegle det med modellering ler. Sørg for, at den er forseglet i alle hjørner.
- Vent indtil fluer vågner op fra anæstesi og derefter invertere buret sådan, at Petri skålen er nu i bunden. Sæt buret i en inkubator med kontrolleret temperatur (25 °C) og luftfugtighed (60%).
- Lad fluer lægge æg til 2-3 h, Udskift æble pladen med en frisk, og lad pladen med æg alder for 19-20 h i en inkubator.
Bemærk: Før ovenstående trin skal fluer synkroniseres for at lette indsamlingen af stadie 17e-f (19-21 h AEL) embryoner. Dette kan opnås ved at overføre fluer til et bur med en frisk gær-æblesaft-agar plade 3-4 gange for 12 h (en gang hver 3-4 h). At holde fluer ved kontrollerede cirkadiske lysmiljø (LD Cycle) kan også hjælpe med at indsamle en synkroniseret population af embryoner, men det var ikke afgørende i vores eksperimenter.
2. indsamling af embryoner
- Pick forsigtigt embryoner med en våd pensel og placere dem i en indsamling glas skål fyldt med 1x PBS.
- Vælg de embryoner, der har deres tracheae fyldt med luft. Luftfyldte tracheae indikerer, at embryonerne har nået stadie 17, og at deres peristaltiske muskelsammentrækninger burde være påbegyndt. Tracheae bliver tydeligt synlig, når de fyldes med luft, som kan tjene som markør for etape 17.
- Placer en æblesaft agar plade på en glas rutsjebane og Overfør forsigtigt embryoner fra PBS til pladen. Line op embryonerne med deres ventrale side op.
Bemærk: Dorsale og ventrale sider af embryoner kan skelnes ved placeringen af dorsale vedhæng på æggeskallen. - Lav en rektangulær voks grænse på en anden glas rutsjebane ved hjælp af en voks pen (Se tabel over materialer).
- Placer et dobbeltsidet klæbebånd inden for denne grænse, og saml forsigtigt embryonerne op ved at sænke dette dias på agar-pladen. Påfør forsigtigt Tryk for at sikre, at embryonerne holder sig til båndet godt, med deres Rygside opad. Hvis det er nødvendigt, kan embryoner rulles på båndet for at korrigere deres orientering. Gør alle manipulationer mens overvåger embryoner under en dissektion mikroskop.
- Dæk embryoner med 1x PBS til levende billeddannelse af muskelsammentrækninger.
Bemærk: Nogle procedurer beskrevet ovenfor er relateret til grundlæggende Drosophila teknikker, der anvendes i mange undersøgelser. Mere detaljerede beskrivelser af almindeligt Drosophila teknikker kan findes andetsteds14.
3. registrering af embryoner
- Udfør levende billeddannelse af monterede embryoner på et epiflourescence-mikroskop med en tidsforskudt funktion og et digitalt kamera med passende emissions filtre (Se tabel over materialer) ved hjælp af en 10x vand nedsænknings objektiv.
Bemærk: Her brugte vi embryoner, der udtrykker GFP i musklerne. Andre fluorescerende markører med passende excitation lys og emission filter sæt kan også anvendes (f. eks, for tdTomato detektion, man kan bruge en Chroma ET-561 filter sæt til excitation og emission omkring optimal 554 nm og 581 nm, henholdsvis). - Udfør Live videooptagelse af embryoner ved hjælp af egnet software (Se tabel over materialer) for omkring 1-2 h med en erhvervelse sats på 4 frames/s.
Bemærk: For at analysere rullende af det udviklende embryon i dets skal, kan embryoner uden ekspression af fluorescerende markører anvendes. Til dette formål påføres regelmæssig lysbelysning uden spektral filtre for at visualisere embryo bevægelse i skallen (Se film 2).
4. analyse af optagelserne
- Eksporter den optagede video direkte til billede J for yderligere analyser (f. eks. som AVI-filer).
- I ImageJ, beskære videooptagelser til størrelsen af de enkelte embryoner ved at tegne en boks omkring hvert embryo og derefter klikke på billedet > afgrøde. Dette reducerer i høj grad størrelsen af videofiler uden at påvirke dens opløsning og letter deres analyse.
- Roter beskårne billeder for at opnå lodret position af embryo midlinien i forhold til skærmen, ved at klikke på billedet > omdanne > rotere.
Bemærk: Valg af eksempel under denne proces vil give vejledning til rotation, der viser gitterlinjer for at sikre den lodrette placering af midterlinjen. - Kvantitativ analyse af rullende embryon :
Bemærk: for afstands analyser skal du først bekræfte, at dine billeder indeholder skaleringsoplysninger. Billed skala kan tilføjes ved at vælge Analysér ≫ Angiv skalering, og indtast derefter en konvertering af pixels til afstande, f. eks.- Marker positionen af den ene eller begge tracheae i det første billede af videoen på et punkt midt mellem posterior og forreste ende. Klik på Analysér ≫ værktøjer > ROI Manager og registrere denne position som skive nummer-y koordinat-x koordinere ved at tegne en boks på ca. 7 μm med 7 μm omkring det og skrive t på tastaturet. Sørg for, at der, når du skriver t, er valgt en interesseregion på videoen. Alternativt kan du vælge fanen Tilføj (t) på ROI Manager for at registrere placeringen af luftrøret i stedet for at skrive kommandoen.
Bemærk: Regionen af interesse kan variere i form eller størrelse afhængigt af embryonale region eller udviklingsmæssige begivenhed, der undersøges. - Marker positionen af det samme område af luftrøret efter hver Peristaltisk sammentrækning. Mål afstanden fra præ-sammentrækning position til post-sammentrækning position ved at tegne en linje, der forbinder centrene i hver boks og skrive m på tastaturet. Konverter afstanden til μm ved hjælp af en kendt skala af billeder. Alternativt kan du måle afstanden i μm i et enkelt trin ved at klikke på analysér ≫ Angiv skala , og Indtast den kendte konverteringsfaktor for pixel-til-Micron for at give en rapport i mikron.
Bemærk: En afstand i pixels kan indtastes sammen med dens tilsvarende afstand i μm. - Korrelerer afstanden og retningen af hver rullende hændelse med retningen af muskelsammentrækning i mindst 8 embryoner for statistisk signifikante forskelle.
- Marker positionen af den ene eller begge tracheae i det første billede af videoen på et punkt midt mellem posterior og forreste ende. Klik på Analysér ≫ værktøjer > ROI Manager og registrere denne position som skive nummer-y koordinat-x koordinere ved at tegne en boks på ca. 7 μm med 7 μm omkring det og skrive t på tastaturet. Sørg for, at der, når du skriver t, er valgt en interesseregion på videoen. Alternativt kan du vælge fanen Tilføj (t) på ROI Manager for at registrere placeringen af luftrøret i stedet for at skrive kommandoen.
- Kvantitativ analyse af embryonale muskelsammentrækninger:
- Brug embryoner, der udtrykker fluorescerende markører i muskler (f. eks. brugte vi transgene fluer til at udtrykke en fusions konstruktion af Myosin Heavy CHain promoter og GFP kaldet MHC-gfp5) til at analysere muskel sammentræknings parametre som sammentrækning amplitude.
- Brug optagelsen af fluorescerende udlæser og tegn en region af interesse (f. eks. en æske med 15 μm til 45 μm [HXW]) centreret på musklerne (som er tydeligt synlige på grund af tilstedeværelsen af fluorescerende markør) i et bestemt karrosseri segment, og vælg fanen Tilføj (t) på e ROI Manager til at registrere positionen af ROI. Klik på ROI manager > mål for at registrere den gennemsnitlige fluorescerende intensitet for hver region af interesse valgt for hver frame i videoen.
- Flyt boksen til Centre for andre krops segmenter af interesse, og klik på Tilføj (t) i ROI Manager for at registrere deres positioner. Dette vil give regioner af interesse af samme størrelse i alle krops segmenter, der skal analyseres. Vælg mindst en posterior, en medial, og et forreste segment, f. eks, henholdsvis A7, A4 og T2.
- I ROI Manager skal du vælge alle områder af interesse optaget som skive nummer-y koordinat-x-koordinat (f. eks. ved at vælge mens du holder CTRL) og klikke på mere > multi måling for at måle den gennemsnitlige fluorescerende intensiteten af hver region af interesse for alle rammer af videoen, og rapportere hver måling i en tabel. Hver region af interesse er en kolonne i tabellen, og hver ramme er en række. Overfør tabellen til et regnearksprogram for yderligere analyser.
- Afbild en graf med rammenummer på x-aksen og gennemsnitlig fluorescerende intensitet på y-aksen. Rammenummer kan konverteres til tiden ved hjælp af billedhastigheden (4 frames/s) af videoen (figur 1A).
- Bestem muskel sammentrækning amplitude ved at anslå stigningen i GFP fluorescens intensitet i forhold til baseline. Muskelsammentrækninger øger GFP-intensiteten, da de bringer mere GFP ind i nærheden af fokusområdet, da flere muskler bliver trukket ind under disse sammentrækninger (film 1)7. Fastlægge en baseline fluorescens som den gennemsnitlige intensitet mellem sammentrækning bølger. Normaliser GFP-intensiteten til grundlinjen ved at dividere alle værdier for ROI-intensitet med basis intensiteten.
Bemærk: Hver profil har en anden baseline fluorescens, da der kan være forskellige udtryks niveauer i forskellige muskel segmenter.
Bemærk: En potentiel komplikation er, at GFP-fluorescensen kan ændre sig over tid på grund af foto blegning. Dette kan løses ved at overvåge ændringer i fluorescens baseline og ved hjælp af en tilstrækkelig stikprøvestørrelse til bølge analyser (vi bruger normalt sæt af 10 fluorescerende bølger og bekræfter, at baseline er omtrent konstant ved at tage et gennemsnit på kun de Peak minima som baseline, der er faldet i fluorescens med 10% eller mindre i forhold til den oprindelige minima peak). En impuls-LED-belysning kan også anvendes til at afbøde dette problem16. - Sammenlign muskelsammentrækninger på venstre og højre side af embryonet ved at analysere spids intensiteter på begge sider af embryonet for samme segmenter. Brug sammentrækning amplitude og tid af peak intensiteter til at undersøge forskelle i omfang og timing af peristaltiske muskelsammentrækning bølger formerings langs begge sider af embryonet.
- Sammenlign normaliseret intensitet af GFP på forskellige segmenter (f. eks. i anterior, mediale og posterior regioner) under muskelsammentrækning bølge formering at undersøge ændringer i sammentrækning som bølgen udbrede. Denne analyse bestemmer også retningen af bølgen (dvs., om den udbreder mod forreste eller bageste regioner af embryonet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normale peristaltiske muskelsammentrækninger er vist i et WT (Wild-type, Canton-S) embryo i film 1. Den gennemsnitlige hyppighed af peristaltiske bølger af muskelsammentrækninger i vores analyse var 47 sammentrækninger pr. time, og den gennemsnitlige amplitude var 60% over baseline for WT-embryoner. Embryo rulningen vises for et WT -embryo i film 2, med den hvide pil, der markerer den oprindelige position af et luftrør, og en sort pil, der skildrer positionen af en dorsale vedhæng. Den dorsale vedhæng (udvendig) bevæger sig ikke, mens tracheae (interiør) gør, hvilket indikerer, at embryonet er rullet ind i dets skal
I vores analyse af mønster af muskelsammentrækninger, udpegede vi en Peristaltisk sammentrækning som en type 1 bølge, hvis dens profil har et højdepunkt, der opstår i den bageste region først, efterfulgt af toppe i midten og forreste regioner (Forward Wave) eller en profil, hvor Peak først opstår på forreste segmenter og derefter udbreder mod posterior regioner (baglæns bølge) (figur 2A og film 1). Vi observerede også en anden type bølger, som vi udpegede som type 2. Type 2 bølger starter i den ene ende af embryonet (normalt anterior), gå videre mod de midterste regioner, og derefter vende tilbage til deres oprindelse som en fejer bølge re-initieret i den modsatte ende (figur 2a og film 1, bølge 4). Pomt -mutant embryoner viser unormal relativ hyppighed af type 1/type 2-bølge generering (figur 3), hvilket resulterer i abnormitet i kropsholdning, krops torsion (eller "rotation") fænotype (figur 4).
Figur 1 A viser muskel sammentrækning amplitude overvåges over tid som NORMALISERET gfp intensitet på forskellige embryo segmenter (anterior, midten og posterior). Toppe i løbet af 165-178 s tidsperiode repræsenterer en simpel Forward Wave (type 1). Figur 1 B viser, at der ikke er nogen forskel i amplituden (afbildet som gfp-intensitet) og tidspunktet for muskelsammentrækninger på højre og venstre side af embryonet.
Figur 2 viser type 1 og type 2 muskel sammentræknings profiler genereret ved hjælp af gfp intensitet som et mål for sammentrækning amplitude. En type 1 bølge er en enkelt bølge genereret ved den forreste eller bageste ende af embryonet, der fortsætter udbredelse mod den modsatte ende. Type 2 er en bifasisk bølge, hvor bølgen udbreder til midten af embryonet i den første fase og derefter vender tilbage til oprindelsen som en Peristaltisk sammentrækning reinitieret i den modsatte ende. Hver bølgelinje repræsenterer normaliseret GFP intensitet detekteret i successive krops segmenter af et embryo, og toppe svarer til muskelsammentrækning. Skrå udseende af toppe illustrerer, at muskelsammentrækninger formere sig langs efterfølgende segmenter, fra forreste til posterior, eller omvendt, og dermed toppe forekomme på hinanden følgende måde i successive krops segmenter.
Figur 3 indeholder grafer for sammentrækning bølge serie i WT og pomt mutant embryoner. Graferne illustrerer, at type 2-sammentrækning bølger genereres ved øget relativ hyppighed i Pomt mutanter, i forhold til WT embryo. Rækken af bølger i WT embryo (øverste graf) skildrer sammentrækninger vist i film 1.
Figur 4 viser faste WT-og pomt -mutant embryoner med muskler, som er plettet med fluorescein-konjugeret phalloidin for at fremhæve embryo kropsholdning. Den buede stiplede linje illustrerer kropsholdningen fænotype af en POMT mutant.
Film 1: eksempel på peristaltiske muskelsammentrækninger af et WT embryo. Muskelsammentrækninger vises i et pseudo farvet format for at illustrere stigningen i GFP-intensitet, når der forekommer sammentrækning (de fleste lyse pixels er røde). Videoen blev erhvervet ved 4 frames/s (fps) og er vist ved 20 fps. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Film 2: en vild-type embryo rullende i sin Shell. Hvid pil indikerer den oprindelige placering af et luftrør, og sort pil indikerer positionen af en dorsale vedhæng. Bemærk, at når embryoet ruller, skifter trakeal position, men rygningen bevæger sig ikke, hvilket illustrerer, at embryonet ruller inde i æggeskallen. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Figur 1 : Muskel sammentrækning amplitude. (A) gfp-intensiteten afbildes i forhold til (Y-aksen) tid (X-akse) for forskellige krops segmenter af embryonet. B) gfp-intensitet (Y-akse) afbildet mod tid for venstre og højre side af det samme segment af et kontraherende embryon. Frame rate er 4 frames/s for begge grafer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Type 1 og type 2 peristaltiske muskel sammentrækning bølge profiler. A) type 1-bølge profil, hvor individuelle linjer repræsenterer NORMALISEREDE gfp-intensiteter for bestemte karrosseri segmenter over tid, mens toppene indikerer sammentrækning begivenheder. (B) type 2 bølge profil, der viser et eksempel på en bifasisk sammentrækning bølge, plottet på samme måde som i a. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Serier af sammentrækning bølger genereret af vilde-type og pomt mutant embryoner. Blå og røde stænger skildrer type 1 og type 2 bølger, hhv. Bemærk, at Pomt -mutanten genererer en øget andel af type 2-bølger sammenlignet med WT. WT-grafen repræsenterer sammentrækninger vist i film 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fiksede og farvede pomt mutant (rt-) og WT embryoner. Bemærk rotationen i krops segmenter af det Pomt -mutante embryon, fremhævet af en stiplet linje, der sporer positionen af midterlinjen. Musklerne visualiseres ved hjælp af farvning med fluorescein-konjugeret phalloidin. Anterior er til venstre, dorsale er op. Scale bar = 100 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores metode giver en kvantitativ måde at analysere vigtige embryo adfærd under udvikling, såsom peristaltiske muskel sammentrækning bølger, herunder bølge hyppighed, amplitude og mønster, samt bølgeeffekt på embryo rullende og kropsholdning. Dette kan være nyttigt i analyser af forskellige mutanter til at studere rollen af specifikke gener i reguleringen af disse og andre adfærd under fosterudviklingen. Vi har brugt ændringer i muskel-specifikke GFP markør intensitet til at analysere muskel sammentrækning amplitude, hyppighed og retning af sammentrækning bølge formering i embryoner. Disse ændringer i GFP-signalet afspejler omfanget af sammentrækninger, da ordregivende organ segmenter bringer mere GFP ind i et ROI og nærheden af fokusområdet. Denne fremgangsmåde forenkler analyserne betydeligt og giver en bedre visuel gengivelse af mønstret for peristaltiske sammentræknings bølger.
I vores eksperimenter brugte vi genotyper med muskel specifik transgen ekspression af GFP til at visualisere og studere i detaljer muskelsammentrækninger under fosterudviklingen. Andre undersøgelser brugte en lignende tilgang til at analysere larve bevægelse såsom kravle og bøje5,15. En lignende teknik til at studere koordinerede muskelsammentrækninger blev tidligere anvendt til sandwich forberedelse af embryoner, hvilket er en mere invasiv tilgang, der kan påvirke embryo adfærd og udvikling3. I modsætning hertil er vores metode helt ikke-invasiv og embryonerne er uforstyrrede under assays. Vores protokol kræver ikke, at embryonerne skal dechorioneres eller devitellinated, og levende embryoner af interesse kan inddrives efter assays og formeret til yderligere analyser.
Vores metode kan potentielt udvikles yderligere til en høj indholdsanalyse (HCA)-baseret screening for at isolere og analysere mutationer, der påvirker embryonale muskelsammentrækninger og andre adfærd og udviklingsmæssige processer. Denne strategi, for eksempel, kan bruges til samtidig registrere muskelsammentrækninger af mange embryoner og til vurdering af deres reaktion på forskellige stimuli, narkotika, eller miljømæssige ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Projektet blev delvist støttet af nationale institutter for sundhedstilskud RO1 NS099409, NS075534 og CONACYT 2012-037 (S) til VP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
