Summary
ここでは、ショウジョウバエ胚における胚筋収縮を非侵襲的かつ詳細指向的に記録する方法を提示する。
Abstract
協調筋収縮は、ショウジョウバエ胚の発達の初期に見られるリズミカルな行動の一形態である。この動作を制御するには、ニューロン感覚フィードバック回路が必要です。収縮のリズミカルなパターンを生成する失敗は、神経学的異常を示すことができます。我々は以前、タンパク質O-mannosylation(翻訳後タンパク質修飾)の欠陥が感覚ニューロンの軸質形態に影響を及ぼし、胚の異常な協調筋収縮をもたらすことを発見した。ここでは、タンパク質の筋肉収縮表現型を特徴付けるために使用した後期胚の生画像を用いて、蠕動脈性筋収縮のパターンを記録・解析する比較的簡単な方法を提示する。O-マンノシルトランスフェラーゼ変異体。これらの記録から得られたデータは、周波数、伝播の方向および異なる身体セグメントにおける筋肉収縮の相対振幅を含む筋肉収縮波を分析するために使用することができる。また、体の姿勢を調べ、筋肉に特異的に発現した蛍光マーカーを利用して、胚の中線の位置を正確に決定しました。同様のアプローチは、胚の転がりや孵化など、発達中の様々な他の行動を研究するためにも利用できます。
Introduction
蠕動筋収縮は、人間1、2、3の歩行および水泳に似たリズミカルな運動行動である。ショウジョウバエ後期胚に見られる胚筋収縮は、そのような行動の一例を表す。ショウジョウバエは、ショウジョウバエの胚発生が特徴的で、比較的短く、監視しやすいため、様々な発達過程を研究する優れたモデル生物です。私たちの方法の全体的な目標は、胚筋の収縮と弛緩の波のようなパターンを慎重に記録し、分析することです。私たちは、筋肉の収縮の詳細な視覚化、記録と分析を提供するシンプルで非侵襲的なアプローチを使用しました。この方法は、孵化直前の後期胚に見られる胚転がりなど、生体内の他のプロセスを研究するためにも使用できる可能性がある。以前の研究では、胚性筋収縮は主に頻度と方向1、2の観点から分析された。前方向または後方向に体軸に沿って進行する収縮の相対的な程度を推定するために、我々は筋肉に特にGFPを発現する胚を使用した。この分析は、筋肉の収縮を分析し、筋肉収縮の一連の蠕タルな波の間に胚の体の姿勢がどのように維持されるかを明らかにするより定量的な方法を提供します。
蠕動筋収縮は、中枢パターン発生器(CPG)回路および末梢神経系(PNS)、中枢神経系(CNS)、および筋肉4、5のニューロン間の通信によって制御される。正常な蠕動性筋収縮を生じさせることができないと、孵化2および異常な幼虫移動6の障害などの欠陥を引き起こし、神経学的異常を示す可能性がある。筋肉収縮の周座波のライブイメージングと収縮型の詳細な分析は、移動に関与する筋肉や神経回路に影響を与える遺伝的欠陥に関連する病原性メカニズムを明らかにするのに役立ちます。我々は最近、そのアプローチを用い、pロテインO-mアノシルtランスフェラーゼ(POMT)変異体7の体姿勢ねじり表現型をもたらすメカニズムを調査した。
タンパク質Oマンノシル化(POM)は、分泌経路タンパク質のセリンまたはスレオニン残基にマンノース糖を添加する特別なタイプの翻訳後修飾である8,9である。POMの遺伝的欠陥は、ヒト10、11、12における先天性筋ジストロフィー(CMD)を引き起こす。ショウジョウバエをモデルシステムとして用いて、これらの疾患の原因メカニズムを調べました。ショウジョウバエタンパク質O-mannosyltransferase遺伝子POMT1およびPOMT2(別名、回転腹部(rt)およびねじれ(tw)の変異を有する胚は、 体のセグメントの変位(「回転」)は、異常な体の姿勢7をもたらす。興味深いことに、この欠陥は、蠕因性筋収縮が顕著になると発達段階と一致した7.
筋肉と表皮が既に形成され、協調筋収縮の蠕動波が始まったときにPOM変異胚の異常な体姿勢が生じるので、異常な体の姿勢は異常な筋肉の結果である可能性があると仮定した。筋肉や表皮の形態の欠陥よりもむしろ収縮7.CMDは、異常な筋肉収縮および姿勢欠陥13に関連することができ、したがって、ショウジョウバエPOMT変異体における姿勢表現型の分析は、筋ジストロフィーに関連する病理学的メカニズムを解明しうる.ショウジョウバエPOMT変異体の体姿勢表現型と筋収縮の蠕動脈波の異常との関係を調べるため、生を用いて筋肉収縮を詳細に解析することにした。イメージングアプローチ。
ショウジョウバエ胚の蠕因性収縮波の分析により、タイプ1とタイプ2の波に指定された2つの異なる収縮モードが明らかになった。タイプ1波は、前から後部に伝播する単純な波、またはその逆です。タイプ2波は、前端で開始し、後方の途中で伝播し、一時的に停止し、時間的静的収縮を形成し、第2段階の間に、伝播する蠕動収縮によって掃引される二相波である。後端から前方に進む。野生型胚は通常、約75%タイプ1と25%タイプ2波から成る一連の収縮を生成する。対照的に、POMT変異型胚は、ほぼ等しい相対周波数でタイプ1とタイプ2波を生成します。
我々のアプローチは、筋肉収縮および胚転がり7の定量分析のための詳細な情報を提供することができる。このアプローチは、ハッチングやクロールなどの筋肉の収縮を伴う他の行動の分析にも適しています。
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Protocol
1. 準備
- ホット25G針を使用して、100 mL容量のトライコーナープラスチックビーカーに約50個の穴を作ってフライケージを準備します(材料の表を参照)。
- リンゴジュース寒天(3%寒天と30%リンゴジュース)で60ミリメートルx15ミリメートルペトリ皿を準備します。
- 乾燥酵母顆粒と水を混合することにより、新鮮な酵母ペーストを準備します。リンゴ寒天プレートに酵母ペーストを広げ、卵の産卵を増やします。
- CO2に約50~60羽のハエ(男女ほぼ同数を使用)を麻酔し、フライケージに入れる。
注:女性の増加率(メスの最大2:1の比率:男性)を使用すると、いくつかのゲノムタイプの産卵量を増やすのに役立ちます。 - フライケージに酵母ペーストを入れたリンゴジュース寒天ペトリ皿をしっかりと取り付け、粘土をモデリングして密封します。すべてのコーナーでシールされていることを確認します。
- ハエが麻酔から目を覚ますまで待ってから、ペトリ皿が底に今あるようにケージを反転します。ケージを制御温度(25°C)と湿度(60%)のインキュベーターに入れます。
- ハエは2-3時間卵を産み、リンゴプレートを新鮮なものに置き換え、インキュベーターで19-20時間の卵の年齢でプレートをしましょう。
注:上記のステップの前に、ハエはステージ17e-f(19-21 h AEL)胚の収集を容易にするために同期されなければならない。これは、新鮮な酵母リンゴジュース寒天プレートでケージにハエを転送することによって達成することができます 12 h (3-4 h ごとに 1 回).制御された概日光環境(LDサイクル)でハエを保つことは、胚の同期集団の収集にも役立ちますが、これは実験では必須ではありませんでした。
2. 胚のコレクション
- 慎重に濡れたペイントブラシで胚を選び、1x PBSで満たされた収集ガラス皿に置きます。
- 気管が空気で満たされた胚を選択します。空気で満たされた気管は、胚がステージ17に達し、その周座筋収縮が始まっていることを示している。気管は空気で満たされるとはっきりと見えるようになり、ステージ17のマーカーとして役立ちます。
- ガラススライドにリンゴジュース寒天スラブを置き、慎重にPBSからスラブに胚を転送します。胚を腹部側に並べて並ます。
注:胚の背部および腹部の側面は卵殻の背部付属品の位置によって区別することができる。 - ワックス ペンを使用して、別のガラススライドに長方形のワックス境界を作成します (「材料の表」を参照)。
- その境界内に両面粘着テープを置き、このスライドを寒天スラブに下げて胚をそっと拾い上げます。優しい圧力をかけて、胚がテープによく貼り付け、後ろ側を上にします。必要に応じて、胚をテープに転がして向きを修正できます。解剖顕微鏡下で胚を監視しながら、すべての操作を行います。
- 筋肉収縮のライブイメージングのための1x PBSで胚をカバーします。
注:上記のいくつかの手順は、多くの研究で使用される基本的なショウジョウバエの技術に関連しています。一般的なショウジョウバエの技術のより詳細な説明は、他の場所で見つけることができます14.
3. 胚の記録
- 10倍の水浸し対物レンズを使用して、タイムラプス機能と適切な発光フィルタを備えたデジタルカメラ(材料の表を参照)を備えたエピフラワースケーゼ顕微鏡に搭載された胚のライブイメージングを行います。
注:ここでは、筋肉にGFPを発現する胚を用いて行った。適切な励起光および発光フィルタセットを有する他の蛍光マーカーも使用することができる(例えば、tdTomato検出のために、それぞれ最適な554 nmおよび581 nmの周りの励起および発光のために設定されたクロマET-561フィルターセットを使用することができる)。 - 4フレーム/秒の取得率で約1〜2時間、適切なソフトウェア(材料の表を参照)を使用して胚のライブビデオ録画を実行します。
注:その殻内の現像胚の転がりを分析するために、蛍光マーカーを発現しない胚を使用することができる。この目的のために、スペクトルフィルタを使用しない定期的な透過光照明を適用して、シェル内の胚の動きを可視化する(Movie 2参照)。
4. 録音の分析
- 記録されたビデオをイメージ J に直接書き出して、さらに分析します(AVI ファイルなど)。
- ImageJ では、各胚の周りにボックスを描画し、[画像> トリミング] をクリックして、個々の胚のサイズにビデオ録画をトリミングします。これにより、解像度に影響を与えずにビデオ ファイルのサイズが大幅に小さくなり、分析が容易になります。
- トリミングされた画像を回転させて、[イメージ>変換> 回転] をクリックして、画面に対する胚の中線の垂直位置を実現します。
注:このプロセス中に[プレビュー]を選択すると、中線の垂直位置を確認するためのグリッド線が表示され、回転に関するガイダンスが提供されます。 - 胚転がりの定量分析:
注:距離解析の場合は、まず画像に縮尺情報が含まれていることを確認します。画像スケールは、[スケールを分析]を選択し、ピクセルから距離への変換(マイクロメートルなど)を入力することで、画像スケールを追加できます。- 後部と前端の中間のポイントで、ビデオの最初のフレーム内の一方または両方の気管の位置をマークします。[分析>ツール> ROIマネージャ] をクリックし、この位置を約 7 μm x 7 μm のボックスを描画し、キーボードにtを入力することで、この位置をスライス数値-y 座標-x 座標として記録します。tを入力するときに、ビデオで対象地域が選択されていることを確認します。または、ROI マネージャの [追加 (t)]タブを選択して、コマンドを入力する代わりに気管の位置を記録します。
注:対象領域は、研究対象の胚領域または発生事象に応じて形状または大きさが異なる場合があります。 - 各蠕虫収縮の後、気管の同じ領域の位置をマークします。各ボックスの中心を接続し、キーボードにmと入力する線を描画して、収縮前の位置から収縮後の位置までの距離を測定します。既知の画像スケールを使用して、距離を μm に変換します。または、[分析>スケールを設定] をクリックして 1 つのステップで μm の距離を測定し、既知のピクセルからミクロンへの変換係数を入力して、ミクロン単位でレポートを生成します。
注:ピクセル単位の距離は、対応する距離と μm で一緒に入力できます。 - 統計的に有意な差を求めて、少なくとも8個の胚における筋肉収縮伝播の方向と各転がりイベントの距離と方向を相関させる。
- 後部と前端の中間のポイントで、ビデオの最初のフレーム内の一方または両方の気管の位置をマークします。[分析>ツール> ROIマネージャ] をクリックし、この位置を約 7 μm x 7 μm のボックスを描画し、キーボードにtを入力することで、この位置をスライス数値-y 座標-x 座標として記録します。tを入力するときに、ビデオで対象地域が選択されていることを確認します。または、ROI マネージャの [追加 (t)]タブを選択して、コマンドを入力する代わりに気管の位置を記録します。
- 胚筋収縮の定量分析:
- 筋肉に蛍光マーカーを発現する胚を使用する(例えば、MヨシンH eavy ChainプロモーターとGFPの融合構造を発現するトランスジェニックハエを用いて、MHC-GFP5と呼ばれる)などの筋肉収縮パラメータを解析した。 収縮振幅。
- 蛍光読み出しの記録を使用し、特定のボディセグメントの筋肉(蛍光マーカーの存在によりはっきりと見える)を中心とした15μm~45μm[HXW]のボックス)を描画し、次の「追加(t)」タブを選択します。roIの位置を記録するためにe ROIマネージャー。ROIマネージャ>測定をクリックして、ビデオの各フレームに選択された各領域の平均蛍光強度を記録します。
- 対象の他のボディセグメントの中心にボックスを移動し、ROIマネージャの[追加(t)]をクリックしてポジションを記録します。これにより、解析されるすべてのボディ セグメントで同じサイズの対象領域が提供されます。少なくとも 1 つの後部セグメント、1 つの中間セグメント、および 1 つの前セグメント (A7、A4、T2 など) をそれぞれ選択します。
- ROIマネージャで、スライス数-y座標-x座標として記録されたすべての対象地域を選択し(例えば、Ctrlを保持したまま選択して)、[その他>マルチメジャー]をクリックして平均蛍光を測定します。ビデオのすべてのフレームに対して関心のある各領域の強度を示し、各測定値を表に報告します。対象の各領域はテーブルの列であり、各フレームは行です。テーブルをスプレッドシート プログラムに転送して、さらに分析します。
- X 軸にフレーム番号を持つグラフをプロットし、Y 軸上の蛍光強度を平均します。フレーム番号は、ビデオのフレームレート(4フレーム/秒)を使用して時間に変換することができます(図1A)。
- ベースラインに対するGFP蛍光強度の増加を推定することにより、筋肉収縮振幅を決定する。筋肉の収縮は、これらの収縮の間により多くの筋肉が引き込まれるにつれて、より多くのGFPを焦点領域の近傍に持ち込むにつれてGFP強度を増加させる(ムービー1)7.収縮波間の平均強度としてベースライン蛍光を確立します。すべてのROI強度値をベースライン強度で除算して、GFP強度をベースラインに正規化します。
注:各プロファイルは、異なる筋肉セグメントで異なる発現レベルがあるかもしれないので、異なるベースライン蛍光を有する。
注:潜在的な合併症の1つは、GFP蛍光が光漂白のために時間の経過とともに変化する可能性があることである。これは、蛍光ベースラインの変化を監視し、波分析に十分なサンプルサイズを使用することで解決できます(通常は10の蛍光波のセットを使用し、それらのピークの平均のみを取ることによってベースラインがほぼ一定であることを確認します)初期ミニマピークに対して蛍光が10%以下減少したベースラインとしてのミニマ)。パルス LED イルミネーションは、その問題16を軽減するために適用することもできます。 - 胚の左右の筋肉の収縮を比較し、同じセグメントの胚の両側のピーク強度を分析します。収縮振幅とピーク強度の時間を使用して、胚の両側に沿って伝播する蠕タル筋収縮波の範囲とタイミングの違いを調べる。
- 筋肉収縮波伝播中の異なるセグメント(例えば、前部、中間および後部領域)におけるGFPの正規化強度を比較し、波が伝播するにつれて収縮の変化を調べる。この分析はまた、波の方向(すなわち、それが胚の前部または後部領域に向かって伝播するかどうか)を決定する。
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Representative Results
正常な蠕動筋収縮は、映画1のWT(野生型、広東-S)胚に示されている。 我々の分析における筋肉収縮の周周波の平均頻度は1時間あたり47収縮であり、平均振幅はWT胚のベースラインを60%上回った。胚の転がりは、ムービー2のWT胚について示され、白い矢印は気管の初期位置を示し、黒い矢印は後部付属品の位置を示す。後部付属器(外側)は動かないが、気管(内部)は、胚が殻の中で転がっていることを示す
筋収縮のパターンの分析では、プロファイルが最初に後部領域で発生するピークを持ち、次に中間および前方領域(前方波)のピークまたはピークを持つプロファイルが続く場合、蠕動性収縮をタイプ1波として指定しました。最初に発生し、後部領域(後方波)に向かって伝播します(図2Aおよびムービー1)。また、タイプ2に指定した別のタイプの波も観測しました。タイプ2波は胚の一方の端(通常は前部)から始まり、中間領域に向かって進み、反対側の端で再始動する波として原点に戻ります(図2Aとムービー1、波4)。POMT変異型胚は、1/2型波発生の異常な相対周波数を示し(図3)、体の姿勢異常、体のねじり(または「回転」)表現型(図4)をもたらす。
図 1Aは、異なる胚セグメント(前部、中間および後部)における正規化されたGFP強度として時間の経過とともに監視される筋肉収縮振幅を示す。165-178 s期間のピークは、単純な前方波(タイプ1)を表します。図 1Bは、胚の左右の振幅(GFP強度として描写)と筋肉収縮の時間に差がないことを示す。
図2は、収縮振幅の尺度としてGFP強度を用いて生成されたタイプ1およびタイプ2筋収縮プロファイルを示す。タイプ1波は、反対側の端に向かって伝播を続ける胚の前端または後端で発生する単一の波である。タイプ2は、波が最初の段階で胚の中央に伝播し、その後、反対側の端で再始動した蠕動収縮として原点に戻る二相波である。各波線は、胚の連続した身体セグメントで検出された正規化されたGFP強度を表し、ピークは筋肉収縮に対応する。ピークの傾斜外観は、筋肉収縮が後部から後部、またはその逆に連続したセグメントに沿って伝播し、したがって、ピークが連続した身体セグメントで連続的に起こることを示しています。
図3は、WTおよびPOMT変異型胚における収縮波系列のグラフを含む。グラフは、タイプ2収縮波がWT胚と比較して、POMT変異体の相対周波数の増加で生成されていることを示しています。WT胚の一連の波(上のグラフ)は、ムービー1に示す収縮を示しています。
図4は、蛍光化結合ファロイジンで染色された筋肉を持つ固定WTおよびPOMT変異胚を示し、胚体の姿勢を強調する。湾曲した破線は、POMT変異体の体姿勢表現型を示す。
ムービー 1: WT 胚の蠕立性筋収縮の例.筋肉収縮は、収縮が起こるときのGFP強度の増加を示すために擬似色形式で示される(ほとんどの明るいピクセルは赤色である)。ビデオは 4 フレーム/秒 (fps) で取得され、20 fps で表示されます。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ムービー2:野生型胚が殻の中を転がっている。白い矢印は気管の初期位置を示し、黒い矢印は後部付属品の位置を示します。胚が転がるにつれて気管の位置は変化するが、後部の付属器は動かないことに注意してください。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
図 1: 筋肉の収縮振幅.(A) GFP強度は、胚の異なる身体セグメントに対して(Y軸)時間(X軸)に対してプロットされる。(B) GFP強度(Y軸)は、収縮胚の同じセグメントの左右の時間に対してプロットされる。フレームレートは両方のグラフで4フレーム/秒です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:タイプ1およびタイプ2の蠕動筋収縮波プロファイル。(A) 個々の線が時間の経過に合った特定のボディセグメントの正規化された GFP 強度を表し、ピークは収縮イベントを示すタイプ 1 波プロファイル。(B) Aと同じ方法でプロットされた二葉間収縮波の例を示すタイプ2波プロファイルは、こちらをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。
図 3:野生型およびPOMT変異型胚によって発生する一連の収縮波。青と赤のバーは、それぞれタイプ 1 とタイプ 2 の波を示しています。POMT変異体は、WTと比較してタイプ2波の増加した割合を生成することに注意してください。WT グラフは、ムービー 1に示す収縮を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: POMT変異体(rt–)およびWT胚を固定し、染色した。POMT変異型胚のボディセグメントの回転は、中線の位置をトレースする破線で強調表示されます。筋肉は、フルオレセイン結合ファロイジンで染色を使用して視覚化されます。前は左に、後ろは上です。スケールバー = 100 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、波周期、振幅、パターン、胚の転がりや姿勢に対する波の影響など、発達中の重要な胚の行動を定量的に解析する方法です。これは、胚発生時にこれらおよび他の行動を調節する際の特定の遺伝子の役割を研究するために、異なる変異体の分析に有用でありうる。我々は、筋肉特異的GFPマーカー強度の変化を使用して、胚における筋肉収縮振幅、周波数および収縮波伝播の方向を分析した。これらのGFP信号の変化は、収縮体セグメントがより多くのGFPをROIと焦点領域の近傍に持ち込むため、収縮の程度を反映する。このアプローチは、解析を大幅に簡素化し、蠕波収縮波のパターンをより視覚的に表現します。
実験では、GFPの筋肉特異的トランスジェニック発現を用いた遺伝子型を用いて、胚発生時の筋肉収縮を詳細に可視化・研究した。他の研究では、クロールや曲げ5、15などの幼虫の動きを分析するために同様のアプローチを使用しました。協調筋収縮を研究する同様の技術は、以前に胚のサンドイッチ調製に適用されたが、これは胚の行動および発達に影響を与える可能性のあるより侵襲的なアプローチである3.対照的に、我々の方法は完全に非侵襲的であり、胚はアッセイ中に不動である。我々のプロトコルは、胚を減衰または逸脱する必要はありません、そして、関心のある生きた胚は、アッセイ後に回収し、さらなる分析のために伝播することができる。
我々の方法は、胚性筋収縮やその他の行動および発達過程に影響を与える変異を分離し、分析するために、高含有量分析(HCA)ベースのスクリーニングのためにさらに開発される可能性がある。この戦略は、例えば、多くの胚の筋肉収縮を同時に記録し、様々な刺激、薬物、または環境変化に対する応答を評価するために使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、国立衛生補助金RO1 NS099409、NS075534、CONACYT 2012-037(S)のVPによって一部支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
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