Summary
यहाँ, हम एक गैर इनवेसिव और विस्तार उन्मुख तरीके से Drosophila भ्रूण में भ्रूण मांसपेशियों के संकुचन रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
समन्वित मांसपेशी संकुचन लयबद्ध व्यवहार का एक रूप है जो ड्रोसोफिला भ्रूण में विकास के दौरान जल्दी देखा जाता है। न्यूरोनल संवेदी प्रतिक्रिया सर्किट इस व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक हैं. संकुचन के लयबद्ध पैटर्न का उत्पादन करने में विफलता तंत्रिका संबंधी असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। हमने पहले पाया है कि प्रोटीन ओ-मैनोसिलेशन में दोष, एक posttranslational प्रोटीन संशोधन, संवेदी न्यूरॉन्स के एक्सॉन आकारिकी को प्रभावित और भ्रूण में असामान्य समन्वित मांसपेशियों में संकुचन में परिणाम. यहाँ, हम रिकॉर्डिंग और देर से चरण भ्रूण के लाइव इमेजिंग द्वारा peristaltic मांसपेशियों के संकुचन के पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि प्रस्तुत करने के लिए hatching के बिंदु तक, जो हम प्रोटीन की मांसपेशियों के संकुचन phenotype की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया हे-मनोसिल्ट्रान्सेस म्यूटेंट्स। इन रिकॉर्डिंग से प्राप्त डेटा आवृत्ति सहित मांसपेशियों में संकुचन तरंगों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रसार की दिशा और विभिन्न शरीर क्षेत्रों में मांसपेशियों के संकुचन के रिश्तेदार आयाम. हम भी शरीर की मुद्रा की जांच की है और एक फ्लोरोसेंट मार्कर मांसपेशियों में विशेष रूप से व्यक्त करने के लिए सही भ्रूण midline की स्थिति का निर्धारण का लाभ उठाया. इसी तरह के दृष्टिकोण भी इस तरह के भ्रूण रोलिंग और hatching के रूप में विकास के दौरान विभिन्न अन्य व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
पेरिस्टेलटिक मांसपेशियों में संकुचन एक लयबद्ध मोटर व्यवहार है जो मनुष्यों में चलने और तैराकी के समान होता है1,2,3. Drosophila देर से चरण भ्रूण में देखा भ्रूण मांसपेशियों में संकुचन इस तरह के एक व्यवहार का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। Drosophila विभिन्न विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है क्योंकि Drosophila में भ्रूण विकास अच्छी तरह से विशेषता है, अपेक्षाकृत कम है, और निगरानी करने के लिए आसान. हमारी विधि के समग्र लक्ष्य को ध्यान से रिकॉर्ड और संकुचन और भ्रूण की मांसपेशियों की छूट की लहर की तरह पैटर्न का विश्लेषण है. हम एक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है कि एक सरल, गैर इनवेसिव दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, रिकॉर्डिंग और मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण. इस विधि को भी संभावित रूप से vivo प्रक्रियाओं में अन्य अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के भ्रूण रोलिंग के रूप में देर से चरण भ्रूण में देखा बस से पहले hatching. पिछले अध्ययनों में भ्रूणीय मांसपेशी के संकुचन का अधिकतर विश्लेषण आवृत्ति तथा दिशा1,2के संदर्भ में किया जाता था . आदेश में संकुचन के सापेक्ष हद तक अनुमान के रूप में वे पूर्वकाल या पीछे की दिशा में शरीर अक्ष के साथ प्रगति, हम विशेष रूप से मांसपेशियों में GFP व्यक्त भ्रूण का इस्तेमाल किया है. यह विश्लेषण मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण करने के लिए और पता चलता है कि कैसे भ्रूण में शरीर की मुद्रा मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों की श्रृंखला के दौरान बनाए रखा है एक अधिक मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है.
Peristaltic मांसपेशियों में संकुचन केंद्रीय पैटर्न जनरेटर (CPG) सर्किट और परिधीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स के बीच संचार द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (पीएनएस), केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), और मांसपेशियों4,5. सामान्य peristaltic मांसपेशियों के संकुचन का उत्पादन करने में विफलता इस तरह के 2 और असामान्य लार्वा चलन6 हैच करने के लिए विफलता के रूप में दोष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और तंत्रिका संबंधी असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। मांसपेशियों के संकुचन और संकुचन phenotypes के विस्तृत विश्लेषण के peristaltic तरंगों के लाइव इमेजिंग मांसपेशियों और चलन में शामिल तंत्रिका सर्किट को प्रभावित आनुवंशिक दोषों के साथ जुड़े रोगजनक तंत्र को उजागर करने में मदद कर सकते हैं। हमने हाल ही में उस दृष्टिकोण का उपयोग ऐसे तंत्रों की जांच करने के लिए किया है जिसके परिणामस्वरूप शरीर की मुद्रा में मरोड़ हो जाता है , पोटिन ओ-एमएनोससिलटीरैनस्फेरेस (पीओएमटी) म्यूटेंट7.
प्रोटीन ओ-मैनोसिलेशन (पोम) एक विशेष प्रकार का पोस्टट्रांसल संशोधन है, जहां एक मैनोस चीनी को स्रावपथप्रोटीन 8,9के सेरीन या थ्रियोनिन अवशेषों में जोड़ा जाता है। पोम में आनुवंशिक दोष के कारण मनुष्यों में जन्मजात पेशीय अपस्थीश (सीएमडी )10,11,12. हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में Drosophila का उपयोग कर इन रोगों के कारक तंत्र की जांच की. हमने पाया कि ड्रोसोफिला प्रोटीन ओ-मैनोसिलट्रांसफरस जीन पोमटी1 और पोमटी2 (उर्फ घुमा हुआ पेट ( आरटी) और मुड़ (ट्वी) में उत्परिवर्तन के साथ भ्रूण एक दिखाते हैं शरीर के खंडों का विस्थापन ("रोटेशन") जिसके परिणामस्वरूप शरीर की असामान्य मुद्रा7होती है। दिलचस्प बात यह है कि यह दोष विकास की अवस्था के साथ हुआ जब peristaltic मांसपेशियों में संकुचन प्रमुख7हो जाते हैं.
चूंकि पोम उत्परिवर्ती भ्रूण में असामान्य शरीर मुद्रा तब उत्पन्न होती है जब पेशी और बाह्य त्वचा पहले से ही बनती है और समन्वित मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों शुरू कर दिया है, हम hypothesized कि असामान्य शरीर मुद्रा असामान्य मांसपेशियों का एक परिणाम हो सकता है संकुचन मांसपेशियों में दोष के बजाय या / और बाह्य आकृति विज्ञान7. सीएमडी असामान्य मांसपेशियों के संकुचन और मुद्रा दोष13के साथ जुड़ा हो सकता है , और इस प्रकार Drosophila POMT उत्परिवर्ती में आसन phenotype के विश्लेषण मांसपेशियों dystrophies के साथ जुड़े रोग तंत्र स्पष्ट कर सकते हैं . आदेश में Drosophila POMT म्यूटेंट और मांसपेशियों में संकुचन के peristaltic तरंगों में संभावित असामान्यताओं के शरीर मुद्रा phenotype के बीच संबंध की जांच करने के लिए, हम एक जीवित का उपयोग कर विस्तार से मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण करने का फैसला किया इमेजिंग दृष्टिकोण.
Drosophila भ्रूण में peristaltic संकुचन तरंगों के हमारे विश्लेषण दो अलग संकुचन मोड, प्रकार 1 और प्रकार के रूप में नामित पता चला 2 तरंगों. प्रकार 1 तरंगों सरल तरंगों पूर्वकाल से पीछे या इसके विपरीत करने के लिए प्रचार कर रहे हैं। प्रकार 2 तरंगों biphasic तरंगों है कि पूर्वकाल के अंत में आरंभ कर रहे हैं, पीछे की दिशा में आधे रास्ते का प्रचार, क्षण भर में रोक, एक अस्थायी स्थिर संकुचन बनाने, और फिर, दूसरे चरण के दौरान, एक peristaltic संकुचन है कि प्रचार द्वारा बह रहे हैं पीछे के अंत से आगे. जंगली प्रकार भ्रूण आम तौर पर संकुचन की एक श्रृंखला है कि लगभग 75% प्रकार के होते हैं उत्पन्न 1 और 25% प्रकार 2 तरंगों. इसके विपरीत, POMT उत्परिवर्ती भ्रूण प्रकार उत्पन्न 1 और टाइप 2 तरंगों लगभग बराबर रिश्तेदार आवृत्तियों पर.
हमारा दृष्टिकोण मांसपेशियों के संकुचन और भ्रूण रोलिंग7के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है . इस दृष्टिकोण को मांसपेशियों में संकुचन से जुड़े अन्य व्यवहारों के विश्लेषण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि हैचिंग और रेंगने।
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Protocol
1. तैयारी
- एक गर्म 25 जी सुई का उपयोग कर एक 100 एमएल क्षमता त्रि-कॉर्नर प्लास्टिक बीकर में लगभग 50 छेद बनाकर एक मक्खी पिंजरे तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- सेब का रस-आगर (3% agar और 30% सेब का रस) के साथ 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करें।
- सूखे खमीर granules और पानी के मिश्रण से ताजा खमीर पेस्ट तैयार करें। अंडे बिछाने को बढ़ाने के लिए सेब की आगर प्लेटों पर खमीर पेस्ट फैलाएं।
- सीओ2 पर लगभग 50-60 मक्खियों (पुरुषों और महिलाओं की लगभग बराबर संख्या का उपयोग करें) के बारे में Anaesthetize और उन्हें मक्खी पिंजरे में डाल दिया।
नोट: महिलाओं के एक बढ़े हुए अनुपात का उपयोग करना (महिलाओं के $2:1 अनुपात तक:पुरुष) कुछ जीनोटाइप के लिए रखी अंडे की मात्रा को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। - मक्खी पिंजरे को कसकर खमीर पेस्ट के साथ एक सेब का रस-आगर पेट्री डिश संलग्न करें और इसे मॉडलिंग मिट्टी के साथ सील करें। सुनिश्चित करें कि यह सभी कोनों पर बंद है.
- रुको जब तक मक्खियों संज्ञाहरण से जाग और फिर पिंजरे ऐसे कि पेट्री पकवान तल पर अब है उलटा. नियंत्रित तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता (60%) के साथ एक इनक्यूबेटर में पिंजरे रखो।
- मक्खियों को 2-3 एच के लिए अंडे देने की अनुमति दें, सेब की प्लेट को एक ताजा के साथ बदलें, और प्लेट को एक इन्क्यूबेटर में 19-20 एच के लिए अंडे की उम्र के साथ दें।
नोट: उपरोक्त चरण से पहले, मक्खियों को चरण 17e-f (19-21 एच एईएल) भ्रूणों के संग्रह को सुविधाजनक बनाने के लिए सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए। यह एक ताजा खमीर-एप्पल रस-आगर प्लेट के साथ एक पिंजरे में मक्खियों को स्थानांतरित करके प्राप्त किया जा सकता है 3-4 बार 12 एच (एक बार हर 3-4 एच) के लिए। नियंत्रित Circadian प्रकाश वातावरण में मक्खियों रखते हुए (एलडी चक्र) भी भ्रूण की एक सिंक्रनाइज़ आबादी इकट्ठा करने के साथ मदद कर सकते हैं, लेकिन यह हमारे प्रयोगों में आवश्यक नहीं था.
2. भ्रूण का संग्रह
- ध्यान से एक गीला तूलिका के साथ भ्रूण लेने और उन्हें 1x पीबीएस से भरा एक संग्रह गिलास पकवान में जगह है।
- उन भ्रूणों का चयन करें जिनमें उनकी श्वासनली हवा से भरी हुई है। हवा से भरे श्वासनली से संकेत मिलता है कि भ्रूण 17 चरण तक पहुँच गए हैं, और उनके peristaltic मांसपेशियों में संकुचन शुरू कर दिया जाना चाहिए था. Tracheae स्पष्ट रूप से दिखाई जब वे हवा से भर रहे हैं, जो चरण 17 के लिए एक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं हो.
- एक गिलास स्लाइड पर एक सेब का रस agar स्लैब प्लेस और ध्यान से पीबीएस से स्लैब के लिए भ्रूण हस्तांतरण। भ्रूण को उनके अधर पक्ष के साथ लाइन अप करें।
नोट: भ्रूण के डोर्सल और अधर पक्षों को अंडे की खोल पर पृष्ठीय उपांगों की स्थिति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। - मोम पेन का उपयोग करके दूसरी काँच की स्लाइड पर आयताकार मोम की सीमा बनाइए (सामग्री की तालिकादेखिए) )
- उस सीमा के भीतर एक दो तरफा चिपचिपा टेप रखें और धीरे से agar स्लैब पर इस स्लाइड को कम करके भ्रूण उठाओ. यह सुनिश्चित करने के लिए कोमल दबाव लागू करें कि भ्रूण टेप से अच्छी तरह से चिपके रहें, उनके पृष्ठीय पक्ष के साथ। यदि आवश्यक हो, भ्रूण टेप पर लुढ़का जा सकता है उनके उन्मुखीकरण को सही करने के लिए. विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे भ्रूणों की निगरानी करते समय सभी जोड़-तोड़ करें।
- मांसपेशियों के संकुचन के लाइव इमेजिंग के लिए 1x पीबीएस के साथ भ्रूण को कवर करें।
नोट: ऊपर वर्णित कुछ प्रक्रियाओं बुनियादी Drosophila कई अध्ययनों में इस्तेमाल तकनीक से संबंधित हैं. आम Drosophila तकनीक का अधिक विस्तृत विवरण कहीं और पाया जा सकताहै 14.
3. भ्रूण की रिकॉर्डिंग
- एक समय चूक समारोह और उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक डिजिटल कैमरा के साथ एक epiflourscence माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार भ्रूण के लाइव इमेजिंग प्रदर्शन (सामग्री की तालिकादेखें) एक 10x पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग कर.
नोट: यहाँ हम मांसपेशियों में GFP व्यक्त भ्रूण का इस्तेमाल किया. उपयुक्त उत्तेजना प्रकाश और उत्सर्जन फिल्टर सेट के साथ अन्य फ्लोरोसेंट मार्करों भी इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, tdTomato का पता लगाने के लिए, एक उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए सेट एक क्रोमा एट-561 फिल्टर का उपयोग कर सकते हैं इष्टतम 554 एनएम और 581 एनएम, क्रमशः) के आसपास. - उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर भ्रूण की लाइव वीडियो रिकॉर्डिंग प्रदर्शन (सामग्री की तालिकादेखें) के बारे में 1-2 ज के लिए 4 फ्रेम /
नोट: अपने खोल के भीतर विकासशील भ्रूण के रोलिंग का विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति के बिना भ्रूण इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अंत करने के लिए, वर्णक्रमीय फिल्टर के बिना नियमित रूप से प्रेषित प्रकाश रोशनी खोल के भीतर भ्रूण गति कल्पना करने के लिए लागू किया जाता है (मूवी 2देखें).
4. रिकॉर्डिंग का विश्लेषण
- आगे विश्लेषण के लिए छवि जम्मू में सीधे दर्ज की गई वीडियो निर्यात (उदाहरण के लिए, AVI फ़ाइलों के रूप में).
- ImageJ में, प्रत्येक भ्रूण के चारों ओर एक बॉक्स ड्राइंग और फिर छवि पर क्लिक करके अलग-अलग भ्रूण के आकार के लिए वीडियो रिकॉर्डिंग फसल। यह बहुत अपने संकल्प को प्रभावित किए बिना वीडियो फ़ाइलों के आकार को कम कर देता है और उनके विश्लेषण की सुविधा.
- छवि पर क्लिक करके, स्क्रीन के सापेक्ष भ्रूण midline की ऊर्ध्वाधर स्थिति को प्राप्त करने के लिए फसली छवियों घुमाएँ ;
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान पूर्वावलोकन का चयन रोटेशन के लिए मार्गदर्शन प्रदान करेगा, मिडलाइन की ऊर्ध्वाधर स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ग्रिडलाइनें दिखा रहा है। - भ्रूण रोलिंग के मात्रात्मक विश्लेषण :
नोट: दूरी विश्लेषण के लिए, पहले पुष्टि करें कि आपकी छवियों पैमाने की जानकारी शामिल है. छवि पैमाने का चयन करके जोड़ा जा सकता है विश्लेषण करें, स्केल सेटकरें, और फिर दूरी के लिए पिक्सेल का रूपांतरण दर्ज, उदा., micrometers- वीडियो के पहले फ्रेम में एक या दोनों ट्रेकिसी की स्थिति को पीछे और पूर्वकाल के अंत के बीच के बीच में एक बिंदु पर चिह्नित करें। विश्लेषण पर क्लिक करें और इसके चारों ओर 7 $m द्वारा और कुंजीपटल पर t टाइपिंग द्वारा टुकड़ा संख्या-y निर्देशांक-x समन्वय के रूप में इस स्थिति को रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि tलिखते समय, वीडियो पर रुचि का कोई क्षेत्र चुना जाता है. वैकल्पिक रूप से, आदेश लिखने के बजाय श्वासनली की स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए ROI प्रबंधक पर जोड़ें (t) टैब का चयन करें.
नोट: भ्रूणीय क्षेत्र या विकासात्मक घटना के आधार पर ब्याज का क्षेत्र आकार या आकार में भिन्न हो सकता है। - प्रत्येक परिस्तिथी संकुचन के बाद श्वासनली के एक ही क्षेत्र की स्थिति को चिह्नित करें। प्रत्येक बॉक्स के केन्द्रों को जोड़ने और कुंजीपटल पर टाइपिंग मीटर को जोड़ने के लिए एक लाइन ड्राइंग द्वारा पोस्ट-संकुचन स्थिति के लिए पूर्व-संकुचन स्थिति से दूरी को मापने। छवियों के ज्ञात पैमाने का उपयोग करके दूरी को $m में कनवर्ट करें। वैकल्पिक रूप से, विश्लेषण पर क्लिक करके एक ही चरण में $m में दूरी को मापें और स्केल सेट करें और माइक्रोन में रिपोर्ट प्राप्त करने के लिए ज्ञात पिक्सेल-से-माइक्रोन रूपांतरण कारक दर्ज करें.
नोट: पिक्सेल में एक दूरी के साथ एक साथ प्रवेश किया जा सकता है इसकी इसी दूरी के साथ में $m. - सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर के लिए कम से कम 8 भ्रूण में मांसपेशियों के संकुचन के प्रचार की दिशा के साथ प्रत्येक रोलिंग घटना की दूरी और दिशा को सहसंबंधित करें।
- वीडियो के पहले फ्रेम में एक या दोनों ट्रेकिसी की स्थिति को पीछे और पूर्वकाल के अंत के बीच के बीच में एक बिंदु पर चिह्नित करें। विश्लेषण पर क्लिक करें और इसके चारों ओर 7 $m द्वारा और कुंजीपटल पर t टाइपिंग द्वारा टुकड़ा संख्या-y निर्देशांक-x समन्वय के रूप में इस स्थिति को रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि tलिखते समय, वीडियो पर रुचि का कोई क्षेत्र चुना जाता है. वैकल्पिक रूप से, आदेश लिखने के बजाय श्वासनली की स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए ROI प्रबंधक पर जोड़ें (t) टैब का चयन करें.
- भ्रूण मांसपेशियों के संकुचन के मात्रात्मक विश्लेषण:
- मांसपेशियों में फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त भ्रूण का प्रयोग करें (जैसे, हम ट्रांसजेनिक मक्खियों का इस्तेमाल किया एमयोसिन एचeavy सीहैन प्रमोटर और GFP बुलाया MHC-GFP5)के एक संलयन निर्माण व्यक्त करने के लिए इस तरह के रूप में मांसपेशियों में संकुचन मानकों का विश्लेषण करने के लिए संकुचन आयाम.
- फ्लोरोसेंट readout की रिकॉर्डिंग का उपयोग करें और ब्याज के एक क्षेत्र आकर्षित (उदा., 15 मीटर से 45 मीटर [HXW]) मांसपेशियों पर केंद्रित का एक बॉक्स (जो स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं फ्लोरोसेंट मार्कर की उपस्थिति के कारण) एक विशेष शरीर खंड के, और का चयन करें जोड़ें (t) टैब वें पर ROI की स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए e ROI प्रबंधक. वीडियो के प्रत्येक फ़्रेम के लिए चयनित रुचि के प्रत्येक क्षेत्र की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता रिकॉर्ड करने के लिए ROI प्रबंधक पर क्लिक करें.
- बॉक्स को रुचि के अन्य मुख्य भागों के केंद्रों में ले जाएँ और अपनी स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए ROI प्रबंधक में जोड़ें (t) पर क्लिक करें. यह विश्लेषण किया जा करने के लिए सभी शरीर क्षेत्रों में समान आकार के ब्याज के क्षेत्रों दे देंगे। कम से कम एक पीछे, एक मध्यस्थ, और एक पूर्वकाल खंड, उदा., A7, A4, और T2, क्रमशः का चयन करें।
- ROI प्रबंधक में, स्लाइस संख्या-y निर्देशांक-x समन्वय के रूप में रिकॉर्ड किए गए सभी क्षेत्रों का चयन करें (उदा., Ctrlधारण करते समय चयन करके) और माध्य फ्लोरोसेंट को मापने के लिए अधिक gt; बहु माप पर क्लिक करें वीडियो के सभी फ्रेम के लिए ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र की तीव्रता, और एक मेज में प्रत्येक माप रिपोर्ट. ब्याज का प्रत्येक क्षेत्र तालिका का एक स्तंभ है, और प्रत्येक फ़्रेम एक पंक्ति है. तालिका को आगे के विश्लेषण के लिए स्प्रैडशीट प्रोग्राम में स्थानांतरित करें.
- x-अक्ष पर फ़्रेम संख्या के साथ ग्राफ़ को प्लॉट करें और y-अक्ष पर फ्लोरोसेंट तीव्रता का अर्थ है. फ़्रेम संख्या को वीडियो की फ़्रेम दर (4 फ़्रेम/s) का उपयोग करके समय में कनवर्ट किया जा सकता है (चित्र 1क) .
- आधार रेखा के सापेक्ष GFP फ्लोरोसेंट तीव्रता में वृद्धि का अनुमान लगाकर मांसपेशी संकुचन आयाम निर्धारित करें। मांसपेशी संकुचन GFP तीव्रता में वृद्धि के रूप में वे फोकल क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में अधिक GFP लाने के रूप में और अधिक मांसपेशियों में इन संकुचन के दौरान खींच लिया (मूवी 1)7. संकुचन तरंगों के बीच औसत तीव्रता के रूप में एक आधारभूत फ्लोरोसेंट की स्थापना. GFP तीव्रता आधार रेखा से प्रत्येक ROI तीव्रता मान आधार रेखा तीव्रता से विभाजित करके आधार रेखा के लिए सामान्य करें।
नोट: प्रत्येक प्रोफ़ाइल एक अलग आधारभूत फ्लोरोसेंट है, के रूप में वहाँ विभिन्न मांसपेशी क्षेत्रों में अलग अभिव्यक्ति का स्तर हो सकता है.
नोट: एक संभावित जटिलता यह है कि GFP फ्लोरोसेंट फोटो विरंजन के कारण समय के साथ बदल सकते हैं. यह फ्लोरोसेंट आधार रेखा में परिवर्तन की निगरानी और लहर विश्लेषण के लिए एक पर्याप्त नमूना आकार का उपयोग करके हल किया जा सकता है (हम आम तौर पर 10 फ्लोरोसेंट तरंगों के सेट का उपयोग करें और पुष्टि करें कि आधार रेखा केवल उन चोटी का एक औसत लेने के द्वारा लगभग स्थिर है आधार रेखा के रूप में minima कि द्वारा फ्लोरोसेंट में कमी आई है 10% या कम प्रारंभिक minima चोटी के सापेक्ष). इस समस्या को कम करने के लिए पल्स-एलईडी रोशनी भी लागू की जा सकतीहै। - भ्रूण के बाईं और दाईं ओर मांसपेशियों के संकुचन की तुलना एक ही खंड के लिए भ्रूण के दोनों ओर शिखर तीव्रता का विश्लेषण करके करें। भ्रूण के दोनों ओर प्रसारित peristaltic मांसपेशियों में संकुचन तरंगों के विस्तार और समय में अंतर की जांच करने के लिए संकुचन आयाम और शिखर तीव्रता के समय का उपयोग करें।
- विभिन्न खंडों में GFP की सामान्यीकृत तीव्रता की तुलना करें (जैसे, पूर्वकाल में, मध्यस्थ और पश्च क्षेत्रों में) मांसपेशियों में संकुचन तरंग संचरण के दौरान, संकुचन में परिवर्तन की जांच करने के लिए के रूप में लहर का प्रचार. यह विश्लेषण तरंग की दिशा भी निर्धारित करता है (अर्थात्, क्या यह भ्रूण के पूर्वकाल या पश्च क्षेत्रों की ओर फैलता है)।
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Representative Results
सामान्य peristaltic मांसपेशियों में संकुचन मूवी 1में एक WT (जंगली प्रकार, कैंटन-एस) भ्रूण में दिखाए जाते हैं। हमारे विश्लेषण में मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों की औसत आवृत्ति प्रति घंटे 47 संकुचन था और औसत आयाम WT भ्रूण के लिए आधार रेखा से ऊपर 60% था. भ्रूण रोलिंग मूवी 2 में एक WT भ्रूण के लिए दिखाया गया है, सफेद तीर एक श्वासनली की प्रारंभिक स्थिति और एक पृष्ठीय उपांग की स्थिति का चित्रण एक काला तीर अंकन के साथ. पृष् ठ उपांग (बाहरी) गति नहीं करता है जबकि श्वासनली (आंतरिक) यह दर्शाती है कि भ्रूण अपने खोल के भीतर लुढ़का हुआ है
मांसपेशियों के संकुचन के पैटर्न के हमारे विश्लेषण में, हम एक प्रकार के रूप में एक peristaltic संकुचन नामित 1 लहर अगर अपनी प्रोफ़ाइल एक चोटी है कि पीछे क्षेत्र में उठता है पहले, मध्य और पूर्वकाल क्षेत्रों में चोटियों के बाद (आगे की लहर) या एक प्रोफ़ाइल जिसमें चोटी पहले पूर्ववर्ती खंडों में उत्पन्न होता है और फिर पश् चवर्ती क्षेत्रों (पश् चवर्ती तरंग) की ओर प्रचारित होता है (चित्र2ए तथा मूवी 1)। हम भी तरंगों का एक और प्रकार है कि हम प्रकार 2 के रूप में नामित मनाया. प्रकार 2 तरंगों भ्रूण के एक छोर पर शुरू (आमतौर पर पूर्वकाल), मध्य क्षेत्रों की ओर आगे बढ़ना है, और फिर एक व्यापक लहर के रूप में अपने मूल पर लौटने के विपरीत छोर पर फिर से शुरू (चित्र2ए और मूवी 1, लहर 4). POMT उत्परिवर्ती भ्रूण प्रकार 1/प्रकार 2 तरंग पीढ़ी की असामान्य सापेक्ष आवृत्ति दिखाते हैं (चित्र 3), जिसके परिणामस्वरूप शरीर की मुद्रा असामान्यता , शरीर मरोड़ (या "रोटेशन") फीनोटाइप (चित्र 4)।
चित्र 1 एक से पता चलता है मांसपेशियों में संकुचन आयाम विभिन्न भ्रूण खंडों पर सामान्यीकृत GFP तीव्रता के रूप में समय के साथ नजर रखी (पूर्वकाल, मध्य और पीछे). 165-178 s समय अवधि के दौरान चोटियों एक सरल आगे की लहर का प्रतिनिधित्व करते हैं (प्रकार 1). चित्र 1 बी से पता चलता है कि आयाम में कोई अंतर नहीं है (GFP तीव्रता के रूप में चित्रित) और भ्रूण के दाईं और बाईं ओर मांसपेशियों के संकुचन के समय.
चित्रा 2 प्रकार से पता चलता है 1 और प्रकार 2 मांसपेशियों संकुचन संकुचन संकुचन आयाम के एक उपाय के रूप में GFP तीव्रता का उपयोग कर उत्पन्न प्रोफाइल. प्रकार 1 तरंग भ्रूण के पूर्ववर्ती या पश्च सिरा पर उत्पन्न एक एकल तरंग है जो विपरीत छोर की ओर संचरण जारी रहती है। प्रकार 2 एक द्वि-स्थितितरंग है जिसमें तरंग पहले चरण के दौरान भ्रूण के मध्य में फैलती है और फिर विपरीत छोर पर फिर से शुरू की गई एक परिस्तिथी संकुचन के रूप में मूल में लौटती है। प्रत्येक लहर लाइन एक भ्रूण के क्रमिक शरीर क्षेत्रों में पता चला सामान्यीकृत GFP तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और चोटियों मांसपेशियों के संकुचन के अनुरूप. चोटियों की तिरछी उपस्थिति दिखाता है कि मांसपेशियों के संकुचन क्रमिक क्षेत्रों के साथ प्रचार, पूर्वकाल से पीछे करने के लिए, या इसके विपरीत, और इस तरह चोटियों लगातार शरीर क्षेत्रों में एक निरंतर तरीके से होते हैं।
चित्रा 3 WT और POMT उत्परिवर्ती भ्रूण में संकुचन लहर श्रृंखला के रेखांकन भी शामिल है. रेखांकन वर्णन है कि प्रकार 2 संकुचन तरंगों POMT उत्परिवर्ती में वृद्धि हुई रिश्तेदार आवृत्ति पर उत्पन्न कर रहे हैं, के रूप में WT भ्रूण की तुलना में. WT भ्रूण (शीर्ष ग्राफ) में तरंगों की श्रृंखला मूवी 1में दिखाए गए संकुचन को दर्शाया गया है।
चित्रा 4 भ्रूण शरीर की मुद्रा को उजागर करने के लिए फ्लोरेसेइन-संयोजित phaloidin के साथ दाग मांसपेशियों के साथ निश्चित डब्ल्यूटी और POMT उत्परिवर्ती भ्रूण से पता चलता है। घुमावदार डैश्ड लाइन एक POMT उत्परिवर्ती के शरीर मुद्रा phenotype दिखाता है.
मूवी 1: एक WT भ्रूण के peristaltic मांसपेशियों के संकुचन का उदाहरण| मांसपेशी संकुचन एक छद्म रंग प्रारूप में दिखाया गया है GFP तीव्रता में वृद्धि वर्णन जब संकुचन होता है (सबसे उज्ज्वल पिक्सल लाल कर रहे हैं). वीडियो 4 फ्रेम /s (fps) पर अधिग्रहण किया गया था और 20 एफपीएस पर दिखाया गया है। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
फिल्म 2: एक जंगली प्रकार भ्रूण अपने खोलके भीतर रोलिंग | सफेद तीर एक श्वासनली की प्रारंभिक स्थिति को इंगित करता है, और काला तीर एक पृष्ठीय उपांग की स्थिति को इंगित करता है। ध्यान दें कि भ्रूण रोल के रूप में, श्वासनली स्थिति में परिवर्तन लेकिन पृष्ठीय उपांग नहीं चलता है, जो दिखाता है कि भ्रूण अपने अंडे के खोल के अंदर रोल. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
चित्र 1 : मांसपेशी संकुचन आयाम| (ए) जीएफपी तीव्रता को भ्रूण के विभिन्न पिज् सों के लिए (य-अक्ष) समय (एक्स-अक्ष) के विरुद्ध प्लॉट किया जाता है। (इ) जीएफपी तीव्रता (वाई- अक्ष) एक संविदात्मक भ्रूण के एक ही खंड के बाएँ और दाएँ भाग के लिए समय के विरुद्ध प्लॉट किया गया है। फ़्रेम दर दोनों रेखांकन के लिए 4 फ्रेम/ कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : प्रकार 1 और प्रकार 2 peristaltic मांसपेशियों संकुचन लहर प्रोफाइल. (क) टाइप 1 तरंग प्रोफाइल जिसमें अलग-अलग लाइनें समय के साथ शरीर के विशेष खंडों की सामान्यीकृत जीएफपी तीव्रता का प्रतिनिधित्व करती हैं, जबकि शिखर संकुचन की घटनाओं को दर्शाती हैं। (बी ) टाइप 2 तरंग प्रोफ़ाइल जो द्वि-पत्र संकुचन तरंग का एक उदाहरण दिखाती है, जिसे उसी प्रकार प्लॉट किया गया है जैसा कि ए में किया गया है, कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्र 3 : संकुचन तरंगों की श्रृंखला जंगली प्रकार और POMT उत्परिवर्ती भ्रूण द्वारा उत्पन्न. नीले और लाल सलाखों के प्रकार 1 और प्रकार 2 तरंगों को दर्शाती है, क्रमशः. ध्यान दें कि POMT उत्परिवर्ती प्रकार 2 तरंगों की एक वृद्धि अनुपात उत्पन्न करता है, के रूप में WT की तुलना में. WT ग्राफ मूवी 1में दिखाए गए संकुचन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : फिक्स्ड और दाग POMT उत्परिवर्ती (आर टी-) और WT भ्रूण. POMT उत्परिवर्ती भ्रूण के शरीर के खंडों में रोटेशन नोट, मिडलाइन की स्थिति अनुरेखण एक डैश्ड लाइन द्वारा प्रकाश डाला. मांसपेशियों fluorescein-संयुग्मी phalloidin के साथ धुंधला का उपयोग कर कल्पना कर रहे हैं. पूर्ववर्ती बाईं ओर है, पृष्ठीय ऊपर है. स्केल बार - 100 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हमारी विधि विकास के दौरान महत्वपूर्ण भ्रूण व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है, जैसे कि तरंग आवर्तता, आयाम और पैटर्न सहित peristaltic मांसपेशियों में संकुचन तरंगों, साथ ही भ्रूण रोलिंग और मुद्रा पर तरंग प्रभाव. यह भ्रूण के विकास के दौरान इन और अन्य व्यवहार को विनियमित करने में विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विभिन्न म्यूटेंट के विश्लेषण में उपयोगी हो सकता है। हम मांसपेशियों में परिवर्तन विशेष GFP मार्कर तीव्रता में परिवर्तन का इस्तेमाल किया है मांसपेशियों में संकुचन आयाम, आवृत्ति और भ्रूण में संकुचन लहर संचरण की दिशा का विश्लेषण. GFP संकेत में ये परिवर्तन संकुचन की हद तक प्रतिबिंबित, के रूप में अनुबंध शरीर क्षेत्रों एक रॉय और फोकल क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में और अधिक GFP लाने. यह दृष्टिकोण काफी विश्लेषण सरल और peristaltic संकुचन तरंगों के पैटर्न का एक बेहतर दृश्य प्रतिनिधित्व देता है.
हमारे प्रयोगों में, हम कल्पना और भ्रूण के विकास के दौरान विस्तार से मांसपेशियों के संकुचन में अध्ययन करने के लिए GFP की मांसपेशियों-विशिष्ट ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ जीनोटाइप का इस्तेमाल किया। अन्य अध्ययनों में लार्वा गति का विश्लेषण करने के लिए भी इसी प्रकार का दृष्टिकोण अपनाया गया जैसे रेंगना और झुकाना5,15. समन्वित मांसपेशियों के संकुचन का अध्ययन करने के लिए इसी तरह की तकनीक पहले भ्रूण की सैंडविच तैयार करने के लिए लागू की गई थी, जो एक अधिक आक्रामक दृष्टिकोण है जो भ्रूण व्यवहार और विकास को प्रभावित कर सकता है3. इसके विपरीत, हमारी विधि पूरी तरह से गैर इनवेसिव है और भ्रूण assays के दौरान unperturbed हैं. हमारे प्रोटोकॉल भ्रूण dechorionated या विचलित होने की आवश्यकता नहीं है, और ब्याज की जीवित भ्रूण परख के बाद बरामद किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए प्रचारित.
हमारी विधि संभवतः एक उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए आगे विकसित किया जा सकता है (HCA) आधारित स्क्रीनिंग को अलग करने और उत्परिवर्तनों कि भ्रूण मांसपेशी संकुचन और अन्य व्यवहार और विकासात्मक प्रक्रियाओं को प्रभावित का विश्लेषण. इस रणनीति, उदाहरण के लिए, एक साथ कई भ्रूण की मांसपेशियों के संकुचन रिकॉर्ड करने के लिए और विभिन्न उत्तेजनाओं, दवाओं, या पर्यावरण परिवर्तन के लिए उनकी प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान आरओ 1 एनएस099409, एनएस075534 और कॉनैसाइट 2012-037(एस) द्वारा वीपी को सहायता प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
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