Her præsenteres en protokol af ex vivo maternel føtal vaskulær perfusion for at muliggøre indgift af en test artikel i maternel vaskulatur og for at evaluere placentaoverførsel af xenobiotiske partikler eller farmakologiske agenser ud over ændringer i placenta fysiologi.
Placenta er et centralt organ under graviditet, der fungerer som en barriere for føtalt xenobiotisk eksponering og formidler udveksling af næringsstoffer til affald. En analyse er beskrevet her for at perfuse en isoleret rotte placenta og vurdere den maternel-til-føtale translokation af xenobiotika ex vivo. Desuden kan vurderingen af fysiologiske processer såsom væske strømning til fosteret og placenta metabolisme udføres med denne metode. Denne teknik er velegnet til evaluering af maternel-til-føtale kinetik hos farmaceutiske kandidater eller miljøforurenende stoffer. I modsætning til de nuværende alternative tilgange gør denne metode det muligt at evaluere den isolerede maternel Foster vaskulatur, idet den systemiske neurale eller immun involvering fjernes, således at eventuelle observerede ændringer i fysiologisk funktion kan skyldes lokale faktorer i det isolerede væv.
Ved at opretholde morfologiske struktur og fysiologiske reaktionsevne har organ perfusion været en accepteret system-eller vævs baseret tilgang til analyse af metabolisk funktion. Disse perfusions teknikker giver mulighed for ex vivo undersøgelse af intakte vævsreaktioner på en række farmakologiske og mekaniske stimuli. Perfusion af human placenta blev oprindeligt beskrevet i 1958 for at identificere de hormonelle virkninger på den metaboliske aktivitet af citronsyrecyklus; tidligere er blevet identificeret i væv homogenater, har troen og Gordon erkendt behovet for at afklare endokrine aktivitet ved hjælp af en ny fysiologisk tilgang1. I samme æra, enkelt-perfusion (maternel-til-føtale eller føtale-til-Moder) strategier blev beskrevet i store2,3 og små4 dyremodeller til at forstå placentaoverførsel af sukker, salte, og antipyrin narkotika. In vivo og ex vivo Dual perfusion (koordineret maternel og føtal perfusion) teknikker blev beskrevet for yderligere at karakterisere placentaoverførsel ved hjælp af in vivo5 og ex vivo6,7,8 metodologier. Teknologiske fremskridt inden for transmission og scanning elektronmikroskopi tillod forskerne at verificere den strukturelle og funktionelle integritet af humane placenta væv efter perfusion9.
Mens perfusion af humane placenta væv og individuelle cotyledonarter er mest relevant, kræver den hurtige udvikling af farmakologiske agenser og miljøforurenende stoffer, at der anvendes en dyre perfusions model til tidlig screening af xenobiotiske over placentabarrieren. Denne placenta perfusion metode giver mulighed for evaluering af overførsel over placenta barriere ved hjælp af lettere opnåelige og fysiologisk relevant rotte placenta. Desuden kan væske strømme over placentabarrieren over en periode efter en eksponering evalueres ved at måle mængden af perfusat kommer fra navle pulsåren. I kraft af at tillade placenta perfusion fra både moder-og føtale cirkulationer, kan denne Dual-flow hele organ tilgang være fordelagtig i forhold til nuværende in vitro og in vivo tilgange. Denne metode gør det muligt at måle en xenobiotisk gennem det maternelle aspekt fra perfusat, som opstår over placenta gennem navlestrengen, eller omvendt. Den protokol, der præsenteres her, vil beskrive overførslen af 20 Nm polystyren (en almindelig nanoplastisk, der anvendes i fødevarer og medicinske produkter) fra moderen livmoder arterien til fostrets rum og et associeret fald i væske strømme over placenta for at illustrere anvendelsen af denne metode i flere fysiologiske, farmakologiske og toksikologiske indstillinger til at vurdere placentaoverførsel, metabolisme og fysiologiske ændringer, der påvirker maternel og/eller føtal flow.
Denne perfusion metode giver mulighed for hurtig vurdering af placenta barriere og fysiologiske funktion af uterin Vaskulaturen og trofoblast lag. Kanylering og perfusion af de proximale til distale ender af moderen livmoder arterie simulerer fysiologi af mødres blodgennemstrømning gennem dette store fartøj er ansvarlig for at sende blod til det udviklende foster. Denne metode giver mulighed for fysiologisk vurdering af den isolerede maternel, placenta og navle karbilical vaskulatur, og derfor kan ændringer i fysiologi identificeres som vaskulær patologi; immun-og neurale innervationer fjernes i ex vivo-proceduren. For at sikre en korrekt evaluering er det derfor vigtigt at kanyle disse fartøjer omhyggeligt for ikke at skabe tårer eller punkteringer i fartøjs væggene og for at fjerne luftbobler. Gas emboli kan forårsage skade på endotel lag af Vaskulaturen eller blokere blodkar. Ved at opretholde de vaskulære forbindelser mellem livmoderen, placenta og foster under Dissection, evaluering af væske og translokation til fosteret kan observeres. Ved administration af en xenobiotisk, i dette tilfælde 20 Nm polystyren, kinetik til den distale ende af livmoder pulsåren og gennem placenta til fostrets rum kan evalueres ved analyse af spildevand over et tidsforløb på 180 minutter.
Mens en dual-perfusion model blev beskrevet, og overførslen af partikler og væske fra moderen til fostrets rum blev overvåget i denne artikel, kan vurderinger også foretages i omvendt fra fosteret til mødres rum. En af metoderne, der er beskrevet her, er, at den distale livmoder vene ikke blev kanyleret eller udtaget. I fremtidige undersøgelser, især dem fokuseret på føtal-til-moderen overførsel, det vil være vigtigt at kanyle og prøve det distale livmoder fartøj. De spildevand, der tages fra dette mock-eksperiment, blev anvendt til at vurdere xenobiotisk overførsel. der kan dog udføres en bred vifte af vurderinger vedrørende endokrine og molekylære placenta funktioner eller føtale ernæring.
Styrkerne i denne protokol opvejer langt de mindre begrænsninger. Præparatet opretholder den fysiologiske struktur og integriteten af et helt organ til at vurdere eksperimentelle forhold. Ex vivo placenta perfusion er en videnskabelig progression fra cellulær baseret in vitro til hele dyrs udsættelse for korrekt at bestemme reproduktiv risikovurdering. Dette kan anses for at være en værdifuld teknik til undersøgelser, der evaluerer placenta farmakologisk narkotika disposition, farmakokinetik, toksikologi, fysiologi, og maternel-føtale medicin.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for miljø sundhed videnskaber (r00-ES024783), Rutgers Center for miljø eksponeringer og sygdom (P30-ES005022), og Rutgers joint Graduate program i toksikologi (T32-ES007148). Vi vil også gerne takke DRs. Michael Goedken, Marianne Polunas, og Pedro Louro for deres tekniske ekspertise og Dr. Adam goodwill for hans hjælp til at designe vores perfusion skematisk (figur 5).
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |