Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kromogen in situ hybridisering SS et verktøy for HPV-relaterte hode og nakke kreftdiagnose

Published: June 14, 2019 doi: 10.3791/59422
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,2
1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

Summary

Human papillomavirus (HPV) RNA kromogen in situ hybridisering anses å være en av gull standardene for aktiv Human papillomavirus infeksjon deteksjon innen svulster. Det gjør at visualisering av HPV E6-E7 mRNA uttrykk med lokalisering og analyse evaluering av sitt signal.

Abstract

Human papillomavirus (HPV) infeksjon er en stor risikofaktor for en under type av orofaryngeal plateepitelkreft (OPSCC), som har en tendens til å være assosiert med et bedre utfall enn alkohol-og tobakk-relaterte OPSCC. Kromogen in situ hybridisering (CISH) av HPV viral RNA kunne tillate analyse evaluering av virale transkripsjoner av kreftfremkallende proteiner E6 og E7 og en in situ visualisering med en god romlig oppløsning. Denne teknikken tillater diagnostisering av en aktiv infeksjon med visualisering av HPV-transkripsjon i tumoral HPV-infiserte celler. En fordel med denne teknikken er å unngå forurensning fra nonneoplastic HPV-infiserte celler ved siden av svulsten. Samlet sett har god diagnose forestillinger det anses å være gullstandarden for aktiv HPV-infeksjon identifikasjon. Siden E6 og E7 viral protein interaksjon med celle proteiner pRb og p53 er obligatorisk for celle transformasjon, er HPV RNA CISH funksjonelt relevant og akutt reflekterer aktiv kreftfremkallende HPV-infeksjon. Denne teknikken er klinisk relevant i tillegg siden "lav" eller "høy" HPV transkripsjon nivåer bidratt til identifisering av to prognose grupper blant HPV-relaterte P16-positive hode og nakke kreftpasienter. Her presenterer vi protokollen for manuell HPV RNA CISH utført på formalin-faste parafin-embedded (FFPE) lysbilder med et kit Hentet fra produsenten. I stedet for kromogen åpenbaring kan RNA in situ-hybridisering også utføres med fluorescerende åpenbaringer (RNA FISH). Det kan også kombineres med konvensjonelle immunostaining.

Introduction

HPV RNA CISH er et kraftig verktøy for påvisning av aktiv HPV-infeksjon, som kan vise seg å være avgjørende i godartet eller ondartede lesjoner på ulike steder som oropharynx eller livmor cervix. Påvisning av en aktiv HPV-infeksjon kan støtte diagnostisering av en HPV-indusert lesjon, og dermed påvirke sin behandling og prognose.

HPV er den hyppigste seksuelt overførbare infeksjonen, og over 100 viral genotyper har blitt beskrevet1. Skjematisk, lav-risk genotyper som genotyper 6 og 11 er kjent for å indusere genital warts, tilbakevendende respiratory papillomatosis, og andre godartet lesjoner, mens høy risiko genotyper som genotyper 16 og også 18 er ansvarlig for de fleste livmorhalskreft og anal kreft og spille en rolle i HNSCC oncogenesis i variable proporsjoner som stod for av regionale epidemiologiske data2.

Flere verktøy er tilgjengelig for påvisning av HPV-infeksjon. Som en høy risiko HPV-infeksjon fører til uttrykk for viral kreftfremkallende proteiner E6 og E73, påvisning av E6 og E7 transkripsjoner er allment sett på som gullstandarden for aktiv HPV-infeksjon identifisering4. HPV RNA CISH kan utføres på FFPE prøver som er ganske lett innhentet fra pasienter som lider av ulike HPV-relaterte sykdommer. Ytelsen har blitt evaluert i plateepitel intraepithelial neoplasi i livmorhalsen, anus, og vagina, og i invasiv plateepitelkreft i livmorhalsen, anus, og den øvre aerodigestive skrift5: Det oppnår en følsomhet på over 98% blant HPV DNA polymerase kjedere reaksjon (PCR)-positive tilfeller. Dette er litt bedre enn P16 immunostaining (93%) og HPV DNA in situ hybridisering (DNA ISH: 97%), som er mer vanlig brukt. I en annen kohort av 57 pasienter med plateepitelkreft (SCC) som oppstår fra hodet og nakken regionen, genital regionen, huden, og urinveiene, sammenlignet med HPV DNA ISH, HPV RNA CISH oppnådde bedre følsomhet (100% versus 88%) og spesifisitet (87% versus 74%)6.

P16 immunostaining er en indirekte markør som reflekterer celle syklus forstyrrelser som kan være forårsaket (men ikke utelukkende) av HPV-infeksjon4,7. Denne kostnadseffektive testen har god følsomhet og en negativ prediktiv verdi og anbefales som et surrogat merke med høy risiko for HPV-infeksjon i oropharynx kreft (OPC) ved College of American patologer (CAP) og av Union for International Kreft Control (UICC)8.

Selv om dette papiret utelukkende fokuserer på påvisning av HPV i HNSCC, er HPV RNA CISH klinisk relevant i ulike andre forhold som involverer HPV-infeksjon. For eksempel kan denne teknikken forbedre nøyaktigheten av diagnosen lav kvalitet plateepitel intraepithelial lesjoner i livmorhalsen (LSIL, tidligere kjent som cervical intraepithelial neoplasi, Grade 1 [CIN1]) for morfologisk tvetydige tilfeller9. Når det gjelder orofaryngeal SCC, HPV RNA CISH tillater identifisering av HPV-relaterte SCC, merket som skiller fra HPV-urelaterte orofaryngeal SCC i den siste åttende utgaven av TNM klassifisering av hode og nakke Cancer (av Union for International Cancer Kontroll [UICC])10. Siden HPV-relaterte SCC utstillinger en bedre prognose med lengre overlevelse og forbedret strålebehandling og kjemoterapi følsomhet enn HPV-urelaterte SCC11,12,13, påvisning av HPV-infeksjon kan påvirke pasientbehandling14,15. Dessuten kan HPV RNA CISH brukes for diagnostisering av HPV-relaterte multiphenotypic sinonasal kreft med et høyere signal enn HPV DNA CISH16. Flere multivariabel analyser tyder på at påvisning av E6 og E7 transkripsjoner er korrelert med en bedre prognose i orofaryngeal SCC totalt7,15,17,18 og i undergruppe av P16-positive orofaryngeal SCC19,20.

Her presenterer vi protokollen for manuell HPV RNA CISH utført på FFPE lysbilder med et kit Hentet fra produsenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen følger etiske retningslinjer og ble godkjent av etisk komité (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. utarbeidelse av materialene

  1. Tilberedning av 1x vaskebuffer
    1. Forbered 3 L av 1x vaskebuffer ved å legge til 2,94 L av destillert vann og en flaske (60 mL) av vaskebuffer (50x) (se tabell over materialer) til en stor carboy. Bland godt.
      Merk: 1x vaskebuffer kan tilberedes på forhånd og oppbevares i romtemperatur i opptil 1 måned.
  2. Tilberedning av counterstaining reagenser
    1. Klargjør 50% hematoksylin.
      1. I en avtrekksvifte, tilsett 100 mL av Gill ' s hematoksylin i (se tabell over materialer) til 100 ml destillert vann i en farge rett.
        Merk: 50% hematoksylin farge oppløsning kan gjenbrukes i opptil 1 uke.
    2. Forbered 0,02% (w/v) ammoniakk vann (bluing reagens).
    3. I avtrekks panseret, tilsett 1,43 mL 1 N ammonium natriumhydroksid til 250 mL destillert vann i en gradert sylinder eller en annen container. Forsegle sylinderen med para fin film. Bland innholdet godt for 3x – 5x.
      Merk: for analysen kvantifisering, er det viktig å bruke ammonium natriumhydroksid. Reagensene kan forberedes på forhånd. Sørg for at alle beholdere forblir tildekket.
  3. Fremstilling av 1x mål henting av reagens
    1. I et stort beger, tilsett 70 mL av 10x mål henting reagens (se tabell over materialer) til 630 ml destillert vann.
    2. Plasser begeret på en varmeplate med en magnetisk rører. Dekk den med aluminiumsfolie.
    3. Kok innholdet ved 100 ° c i 10 – 15 min.
      Merk: ikke la det koke i mer enn 30 min.
  4. Reagens likevekts
    1. Sørg for at hybridisering ovnen er på og ved 40 ° c. Plasser vått fukte papir nederst i skuffen.
      Merk: en hybridisering ovn (se tabell over materialer) er nødvendig for trinn 3,4 til 4,2.
    2. Fjern forsterknings reagensene (AMP1 – AMP6, se materialfortegnelsen) fra kjøleskapet og oppbevar dem ved romtemperatur, minst 30 min før det relevante inkubasjons trinnet.
    3. Før hver bruk, varm målet og/eller kontroll sonder i minst 10 min ved 40 ° c i ovnen eller i et vannbad eller inkubator.

2. vedheft øker og deparaffinization i avtrekks panseret

Merk: Start protokollen med 3 – 5 μm-tykke histologiske prøver montert på unstained lysbilder.

  1. For å forbedre vedheft, bake lysbildene ved 60 ° c for 1 t eller ved 40 ° c over natten i ovnen.
  2. Lad opp objektglasstativet med unstained histologiske lysbilder. Senk skyve stativet i 5 minutter i friske xylen som finnes i en farge rett, med sporadiske agitasjon. Gjenta med friskt xylen.
  3. Dypp skyve stativet i 3 minutter i fersk 100% etanol i en farge rett, med konstant omrøring. Gjenta med fersk 100% etanol.
  4. La lysbildene tørke i 2 minutter ved romtemperatur.
    Merk: ikke gjenbruk deparaffinization reagenser for dehydrering av lysbildene etter analysen.

3. vev forbehandling

Merk: disse trinnene følger "standard" forbehandling anbefaling i henhold til produsentens instruksjoner for hode-og nakke prøver. Timingen av seksjoner 3,1 og 3,2 må kanskje justeres avhengig av manipulert vev.

  1. Blokade av peroksidase aktivitet
    1. Tilsett 4 – 6 dråper hydrogen peroxide (se tabell over materialer) til hvert lysbilde og ruge dem i 10 min ved romtemperatur.
    2. Vask lysbildene 2x i 2 min i destillert vann ved romtemperatur.
  2. Brudd på RNA/vevs grenser
    1. Med en klo fjerner du aluminiumsfolie fra det kokende 1x målet gjenfinning reagens (TTR1x) fra § 1,3 og stoppe omrøring. Dypp skyve stativet sakte og forsiktig i 15 min. dekk begeret igjen med aluminiumsfolie.
      Merk: koking må vedvare i løpet av dette trinnet.
      FORSIKTIG: Bruk klo å manipulere aluminiumsfolie og skyv rack for å unngå brannskader. Sørg for å bruke riktig personlig verneutstyr, som hansker og Laboratoriefrakk.
    2. Med klo, umiddelbart overføre Hot Slide rack til en destillert vannbad og vask den i 2 min.
      Merk: Pass på at prøvene ikke kjøles ned i TTR1x.
    3. Vask lysbildene i fersk 100% etanol i 2 min.
    4. La lysbildene tørke i romtemperatur i 2 minutter.
  3. Opprettelse av barriere
    1. Med en hydrofobe barriere penn (se tabell over materialer), tegner en barriere rundt prøven. La det tørke ut på minst 5 min.
      Merk: La barrieren virkelig tørke ut. Hvis det slites ut under inngrepet, ikke nøl med å tegne det igjen. Unngå å berøre vevet med pennen. Protokollen kan settes på pause over natten her.
  4. Protease fordøyelse
    1. Plasser lysbildene på lysbilde stativet, og Legg til ~ 4 dråper med protease Plus per prøve (se tabell over materialer).
    2. Dekk til luft fuktighets kontroll brettet med lokk og sett det inn i den hybridisering ovnen i 30 minutter ved 40 ° c.
      Merk: for å unngå fordamping, sørg for at dreie knotten er helt vendt til låse posisjonen.
    3. Fjern skuffen fra ovnen og fjern objektglasstativet.
    4. Ett lysbilde om gangen, Fjern raskt overflødig væske og plasser lysbildet i et lysbilde stativ nedsenket i en farge rett fylt med destillert vann.
    5. Vask lysbildene 2x i 2 min i destillert vann ved romtemperatur. Agitere hele tiden.

4. kjøre analysen

Merk: ikke la seksjoner tørke ut mellom de inkubasjons trinnene.

  1. Hybridisering av HPV-sonde
    Merk: Sørg for at sonder er prewarmed for å oppløse enhver utfelling før bruk. For dette trinnet, i stedet for HPV-sonde, peptidyl-prolyl isomerase B (PPIB) for positiv kontroll eller dihydrodipicolinate REDUKTASE (DAPB) for negativ kontroll (se tabell over materialer) kan også brukes.
    1. Trykk og/eller knips på lysbildene for å fjerne overflødig væske, og plasser dem i objektglasstativet. Tilsett ~ 4 dråper HPV-sonde for å dekke helt hver del.
    2. Dekk til skuffen med et lokk og sett den inn i ovnen i 2 timer ved 40 ° c.
      Merk: for å unngå fordamping, sørg for at sving Nob er helt vendt til låse posisjonen.
    3. Fjern skuffen fra ovnen og fjern objektglasstativet.
    4. Ett lysbilde om gangen, Fjern raskt overflødig væske og plasser lysbildet i et lysbilde stativ nedsenket i en farge rett fylt med 1x vaskebuffer.
    5. Vask lysbildene i 1x vaskebuffer i 2 minutter ved romtemperatur med konstant omrøring. Gjenta dette med en fersk 1x vaskebuffer.
  2. Hybridisering av AMP1, AMP2, AMP3 og AMP4
    Merk: disse trinnene inkluderer hybridisering i hybridisering ovnen og AMP1 – AMP4 fra det innkjøpte settet (se tabell over materialer).
    1. Trykk og/eller sveip for å fjerne overflødig væske fra lysbildene og plassere dem i lysbilde stativet. Legg ~ 4 dråper AMP1 å helt dekke hver del.
    2. Dekk til skuffen med et lokk og sett den inn i ovnen i 30 min ved 40 ° c.
    3. Fjern skuffen fra ovnen og fjern objektglasstativet.
    4. Ett lysbilde om gangen, Fjern raskt overflødig væske og plasser lysbildet i et lysbilde stativ nedsenket i en farge rett fylt med 1x vaskebuffer.
    5. Vask lysbildene i 1x vaskebuffer i 2 minutter ved romtemperatur med konstant omrøring. Gjenta dette med en fersk 1x vaskebuffer.
    6. Gjenta trinn 4.2.1 – 4.2.5, men bruk ~ 4 dråper AMP2 istedenfor AMP1 og ruge i 15 min ved 40 ° c. Vask lysbildene 2x i 2 min, begge ganger i frisk vask buffer.
    7. Gjenta trinn 4.2.1 – 4.2.5, men bruk ~ 4 dråper AMP3 istedenfor AMP1 og ruge i 30 min ved 40 ° c. Vask lysbildene 2x i 2 min, begge ganger i frisk vask buffer.
    8. Gjenta trinn 4.2.1 – 4.2.5, men bruk ~ 4 dråper AMP4 istedenfor AMP1 og ruge i 15 min ved 40 ° c. Vask lysbildene 2x i 2 min, begge ganger i frisk vask buffer.
  3. Hybridisering av AMP5 og AMP6
    Merk: disse trinnene inkluderer ikke hybridisering i ovnen, men hybridisering ved romtemperatur. AMP5 og AMP6 kommer fra det kjøpte settet (se tabell over materialer).
    1. Trykk og/eller knips på lysbildene for å fjerne overflødig væske, og plasser dem i objektglasstativet. Legg ~ 4 dråper AMP5 å helt dekke hver del.
    2. Dekk til skuffen med lokk og ruge i 30 min ved romtemperatur.
    3. Ett lysbilde om gangen, raskt fjerne overflødig væske og legg den i et lysbilde rack nedsenket i en farge rett fylt med 1x vaskebuffer.
    4. Vask lysbildene i 1x vaskebuffer i 2 minutter ved romtemperatur med konstant omrøring. Gjenta dette med en fersk 1x vaskebuffer.
    5. Gjenta trinn 4.3.1-4.3.4, men bruk ~ 4 dråper AMP6 i stedet for AMP5 og ruge i 15 min ved romtemperatur. Vask lysbildene 2x i 2 min, begge ganger i frisk vask buffer.

5. signal deteksjon med 3, 3 '-diaminobenzidine

FORSIKTIG: Diaminobenzidine (DAB) er giftig. Følg egnede forholdsregler og sikkerhetsretningslinjer ved avhending og håndtering av dette stoffet.

  1. Bland like volumer av DAB-A og DAB-B (se tabell over materialer) i et rør med riktig størrelse ved å fordele det samme antall dråper av hver løsning. Lag ~ 120 μL av DAB substrat per seksjon (~ 2 dråper av hver reagens/totalt 4). Bland det godt for 3x-5x.
  2. Ta hvert lysbilde, én om gangen, fra lysbilde stativet og trykk og/eller knips for å fjerne overflødig væske før du plasserer den i objektglasstativet.
  3. Pipetter ~ 120 μL av DAB på hver vevs seksjon. Sørg for at seksjonene er tildekket og ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
  4. Kast den gjenværende DAB-en i henhold til lokale forskrifter, og sett inn lysbildet i et lysbilde stativ nedsenket i en farge rett fylt med vann fra springen.

6. Counterstaining

  1. Flytt lysbilde stativet til en farge rett som inneholder 50% hematoksylin farge løsning, la den hvile i 30 s ved romtemperatur. Legg merke til at lysbildene blir lilla.
  2. Overfør umiddelbart lysbilde stativet tilbake til en farge rett som inneholder vann fra springen, og vask lysbildene 3x – 5x ved å flytte stativet opp og ned.
  3. Fortsett å gjenta vaske trinnet med friskt vann fra springen til lysbildene er klare, mens inndelingene forblir lilla.
  4. Skift vann fra springen i farging parabolen med 0,02% ammoniakk vann. Beveg stativet opp og ned 2x – 3x. Legg merke til at vevs delen skal bli blå.
  5. Erstatt ammoniakk vann med vann fra springen. Vask lysbildene 3x – 5x.

7. dehydrering

  1. Flytt lysbilde stativet til en farge rett som inneholder 70% etanol i avtrekks panseret og la den hvile i 2 minutter med sporadiske agitasjon.
  2. Flytt lysbildet rack til en første farging parabolen inneholder 100% etanol og la den hvile i 2 min med sporadiske agitasjon.
  3. Flytt lysbildet rack til en annen farging parabolen inneholder 100% etanol og la den hvile i 2 minutter med sporadiske agitasjon.
  4. Flytt lysbilde stativet til en farge rett som inneholder xylen og la den hvile i 5 minutter med sporadiske agitasjon.

8. Skyv montering

  1. Fjern lysbildene fra objektglasstativet og legg dem flatt med delene vendt opp i avtrekks panseret.
  2. Monter ett lysbilde om gangen ved å legge til 1 dråpe av en xylen-basert festemiddel til hvert lysbilde og nøye plassere en 24 mm x 50 mm dekkglass overdelen. Unngå overtrykk av luftbobler.
  3. Lufttørke lysbildene i ≥ 5 min.

9. prøve evaluering

  1. Undersøk vevs seksjonene under et standard brightfield mikroskop ved 20x – 40x forstørrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrevet her, i hode og nakke plateepitelkreft, en sak kan betraktes som positive i nærvær av brune punctiform farging i cytoplasma eller i kjerner av tumorceller. I de fleste studier, er signalet betraktes som enten "positiv" eller "ikke oppdaget"14. Metoder for semiquantification av signalet er rapportert, men mangler standardisering mellom lag. For eksempel, i noen studier, ble signalene scoret som 1 + med 1 – 3 prikker per tumor celle, 2 + med 4 – 9 prikker per tumor celle, eller 3 + med 10 prikker eller mer per tumor celle6; i post hoc analyser, bare 2 + og 3 + signaler, som var lettere å tolke, ble tatt hensyn til. I en annen studie ble resultatene delt inn i to poengsummer: RNA CISH "high" og RNA CISH "Low". RNA CISH "høy" score ble definert av mer enn 50% av fargede kreftceller, eller ved flekker som dekker mer enn 80% av celleoverflaten (nucleus og cytoplasma) i minst 30% av kreftcellene, som observert med en 20x objektiv (figur 1)21.

Når det gjelder positive kontroller, bør PPIB-signalet være synlig som punktat prikker i cellekjerner ved 20x – 40x forstørrelse. Som for negative kontroll lysbilder, en prikk til hver 10 celler som viser bakgrunnen DAB farging per 20x mikroskop feltet er akseptabelt.

Figure 1
Figur 1: eksempler på "lav" og "høy" RNA CISH farging. (A og B) RNA CISH "lav" score farging i orofaryngeal plateepitel celle kreftsvulster. Farging er observert i under 50% av tumorceller og dekker mindre enn 80% av celleoverflaten. (C og D) RNA CISH "høy" score farging i orofaryngeal plateepitel celle kreftsvulster. Farging er observert i mer enn 50% av tumorceller, og i dette tilfellet er farging overflaten overstiger 80% i mer enn 30% av tumorceller. Dette tallet er endret fra Augustin et al.21Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPV RNA CISH utført med en kjøpt Kit er et kraftig verktøy for påvisning av viral transkripsjoner og det indikerer aktiv HPV-infeksjon. Utføres manuelt, trinnene i protokollen er generelle enkle å følge, og den kjøpte Kit er praktisk. Denne teknikken gjør at farging av 19 histologiske prøver pluss en kontroll lysbilde på en gang, og analysen varer rundt 8 h. Det er viktig å ikke la prøvene tørke ut mellom trinn med mindre annet er nevnt. Forbehandling tilstand må kanskje justeres avhengig av manipulert vev.

HPV E6-E7 mRNA uttrykk signal oppdages med en presis romlig oppløsning, og dermed utelukker eventuelle forurensning fra HPV-infiserte nonneoplastic celler ved siden av svulsten. Påvisning av HPV E6 og E7 RNA er funksjonelt relevant siden disse transkripsjoner er nødvendig for HPV-indusert celle transformasjon gjennom deres interaksjon med mobilnettet p53 og pRb proteiner4. Derfor, i forstadier lesjoner i livmor cervix, kan HPV RNA CISH bidra til å diskriminere lav-grade intraepithelial lesjoner (LSIL) fra høyverdig intraepithelial lesjoner (HSIL) i henhold til lokalisering av signalet: i de fleste tilfeller av LSIL, rikelig diffust farget kjerner er merket gjennom hele epitel tykkelsen, noe som indikerer en produktiv fase. HSIL utstillingen enten rikelig diffust farget cellekjerner i overfladisk lag, coexisting med sterke kjernefysiske og cytoplasmatiske bryter signaler i nedre lag (i lesjoner tidligere kjent som CIN2), eller sterke kjernefysiske flekker med cytoplasmatiske prikker gjennom hele tykkelsen av epitel, indikerer den bearbeidet fase av HPV-infeksjon (i lesjoner tidligere kjent som CIN3)22.

Selv om det er foreløpig ingen standard anbefaling for analyse evaluering av signalet, noen forfattere rapporterer en klinisk relevans siden analyse evaluering av HPV E6 og E7 transkripsjoner har tillatt identifisering av to Prognostisk grupper blant HPV-relaterte HNSCC-pasienter21. Det har vært postulert at påvisning av HPV DNA uten E6 og E7 transkripsjoner eller med bare lave nivåer av E6 og E7 transkripsjoner ville være funksjonelt irrelevant, og at slike pasienter bør samles med HPV-negative kreftpasienter21, 23på.

Når det gjelder begrensninger i denne prosedyren, er det postulert at noen få ikke-spesifikke kryss hybridizations kan skje i noen tilfeller, ettersom hypotetisk gjennomsnitt av Dreyer et al.23 RNA CISH kanskje ikke egner seg for diskriminering mellom E6/E7 RNA-transkripsjoner og virale DNA, som protokollen inkluderer en 100 ° c varmebehandling trinn, som er mistenkt for å tillate viral DNA denaturering23. Dette er støttet av observasjon av to typer signaler i positive tilfeller, nemlig sterk farging hovedsakelig lokalisert i tumor cellekjerner, samt en finkornet signal i cytoplasma. Som sonden som brukes i denne protokollen spesifikt binder HPV genotyper 16 og 18, som er involvert i et stort flertall av HPV-relaterte HNSCC4, sporadiske HPV-assosierte tilfeller kan bli savnet av RNA CISH, enten på grunn av visse HPV-genotyper som ikke er inkludert i sonden, eller på grunn av mutasjoner eller slettinger av primer bindende områder. Til slutt krever denne metoden kostbare reagenser og enheter, og er ikke lett tilgjengelig i rutinemessig praksis.

For hver prøve, totalt tre seksjoner er nødvendig: en til å utføre HPV-analysen, en for positiv kontroll, og en for negativ kontroll. Som RNA er et sårbart molekyl og kan svekkes over tid i FFPE prøver, må kvaliteten på transkripsjoner sjekkes for hver prøve, ved hjelp av positive kontroll sonder som PPIB, DNA-regissert RNA polymerase II delenhet RPB1 (Polr2a), eller polyubiquitin-C (UBC) , som er menneskelig housekeeping gener. Videre, når det er en analyse tilnærming, må signalet bli normalisert til housekeeping gen kontroll sonde21. Anbefalt positiv kontroll for hvert vev kan finnes i produsentens instruksjoner. Men en fersk studie bekrefter at mRNA uttrykk kan robust studert både i potensielle og retrospektiv prøver, viser sammenlignbare mRNA nivåer mellom prøvene fra 2004 og fra 2008. Dette er i favør av den relative integriteten til mRNA over tid24. Den anbefalte negative kontroll sonden brukes for å unngå løs farging er bakteriell genet koding for DAPB.

Her beskrives kromogen in situ hybridisering av HPV RNA som utført manuelt. Denne teknikken kan også utføres med fluorescerende merking og/eller kombinert med konvensjonelle immunostaining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: boards, seminarer: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche

Acknowledgments

Forfatterne takker avdelingen for patologi av Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, og Gisèle Legall); den histologi plattform av PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark for språk redigering; Alexandra Elbakyan for hennes bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).

Tags

Genetikk kromogen in situ hybridisering HPV transkripsjon analyse analyse hode og nakke kreft E6 E7 RNA plateepitel kreft
Kromogen in situ hybridisering SS et verktøy for HPV-relaterte hode og nakke kreftdiagnose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J.,… More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter