Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV

doi: 10.3791/59422 Published: June 14, 2019

Summary

A hibridação in situ cromogênico do RNA do papilomavírus humano (HPV) é considerada ser um dos padrões do ouro para a deteção humana ativa da infecção do papilomavírus dentro dos tumores. Permite a visualização da expressão de mRNA de HPV E6-E7 com localização e avaliação semiquantitativa de seu sinal.

Abstract

A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é um fator de risco importante para um subtipo de carcinoma epidermóide orofaríngeo (OPSCC), que tende a estar associado a um melhor desfecho do que o OPSCC relacionado ao álcool e ao tabaco. A hibridação in situ chromogenic (cish) do RNA viral de HPV poderia permitir a avaliação semiquantitativa de transcritos virais das proteínas oncogênico E6 e E7 e de um visualização in situ com uma boa definição espacial. Essa técnica permite o diagnóstico de uma infecção ativa com a visualização da transcrição do HPV nas células tumorais infectadas pelo HPV. Uma vantagem desta técnica é a vacância da contaminação das pilhas HPV-infectadas nonneoplastic adjacentes ao tumor. Globalmente, seus desempenhos bons do diagnóstico têm-no considerado ser o padrão do ouro para a identificação ativa da infecção de HPV. Desde que a interação viral da proteína E6 e E7 com proteínas da pilha PRB e p53 é obrigatória para a transformação da pilha, o RNA cish de HPV é funcional relevante e reflete agudamente a infecção oncogênico ativa de HPV. Esta técnica é clinicamente relevante, bem como os níveis de transcrição do HPV "baixo" ou "alto" ajudaram na identificação de dois grupos de prognóstico entre os pacientes com câncer de cabeça e pescoço P16-positivos relacionados ao HPV. Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças parafina-encaixadas formalin-fixadas (FFPE) com um jogo obtido do fabricante. Em vez de revelação cromogênica, a hibridação in situ de RNA também pode ser realizada com revelação fluorescente (RNA FISH). Também pode ser combinada com imunocoloração convencional.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O RNA cish de HPV é uma ferramenta poderosa para a deteção da infecção ativa de HPV, que pode provar crucial em lesões benignas ou malignos em vários locais tais como o orofaringe ou o colo uterino. A detecção de uma infecção ativa por HPV pode apoiar o diagnóstico de uma lesão induzida pelo HPV e, assim, influenciar seu tratamento e prognóstico.

O HPV é a infecção sexualmente transmissível mais frequente, e mais de 100 genótipos virais foram descritos1. De forma esquemática, genótipos de baixo risco, como os genótipos 6 e 11, são conhecidos por induzir verrugas genitais, papilomatose respiratória recorrente e outras lesões benignas, enquanto genótipos de alto risco, como genótipos 16 e também 18, são responsáveis pela maioria dos cânceres cervicais e cânceres Anais e desempenham um papel na oncogênese da HNSCC em proporções variáveis como contabilizadas por dados epidemiológicos regionais2.

Várias ferramentas estão disponíveis para a detecção de infecção por HPV. Como uma infecção por HPV de alto risco leva à expressão de proteínas oncogênicas virais E6 e E73, a detecção de transcritos E6 e E7 é amplamente vista como o padrão-ouro para a identificação ativa da infecção pelo HPV4. O RNA CISH de HPV pode ser executado em amostras de FFPE que são obtidas completamente facilmente dos pacientes que sofrem de várias doenças HPV-relacionadas. Seu desempenho tem sido avaliado em neoplasia intraepitelial escamosa no colo do útero, no ânus e na vagina, e no carcinoma epidermóide invasivo no colo do útero, no ânus e no trato aerodigestivo superior5: atinge uma sensibilidade de mais de 98% entre os casos positivos da reacção em cadeia do polymerase do ADN de HPV (PCR). Isto é ligeiramente melhor do que a imunomarcação P16 (93%) e a hibridação in situ do ADN de HPV (ADN ISH: 97%), que são mais de uso geral. Em outra coorte de 57 pacientes com carcinoma epidermóide (CEC) decorrente da região da cabeça e pescoço, da região genital, da pele e do trato urinário, comparado ao DNA do HPV, o ARN do HPV CISH obteve melhor sensibilidade (100% versus 88%) e especificidade (87% versus 74%)6.

A imunocoloração P16 é um marcador indireto refletindo o rompimento do ciclo celular que pode ser causado (mas não exclusivamente) pela infecção pelo HPV4,7. Este teste rentável possui boa sensibilidade e um valor preditivo negativo e é recomendado como um marcador substituto de infecção por HPV de alto risco no câncer de orofaringe (OPC) pelo Colégio de patologistas americanos (PAC) e pela União para o internacional Controle do câncer (UICC)8.

Embora este papel focalize unicamente na deteção do HPV em HNSCC, o RNA CISH de HPV é clinicamente relevante em várias outras circunstâncias que envolvem a infecção de HPV. Por exemplo, essa técnica pode melhorar a acurácia do diagnóstico de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau do colo do útero (LSIL, anteriormente conhecida como neoplasia intraepitelial cervical, grau 1 [NIC1]) para casos morfologicamente ambíguos9. Em relação ao CEC orofaríngeo, o ARN do HPV CISH permite a identificação do CEC relacionado ao HPV, rotulado como distinto do SCC orofaríngeo não relacionado ao HPV na recente oitava edição da classificação TNM do câncer de cabeça e pescoço (da União para câncer internacional Controle [UICC])10. Desde que o SCC HPV-relacionado apresenta um prognóstico melhor com sobrevivência mais longa e sensibilidade aumentada da radioterapia e da quimioterapia do que o SCC-não relacionado HPV11,12,13, a deteção da infecção de HPV pode impactar gerência paciente14,15. Adicionalmente, o RNA CISH de HPV pode ser usado para o diagnóstico da carcinoma sinonasal multiphenotypic HPV-relacionada com um sinal mais elevado do que o ADN CISH16de HPV. Várias análises multivariadas sugerem que a detecção de transcritos E6 e E7 está correlacionada com um melhor prognóstico em CEC orofaríngea global7,15,17,18 e no subgrupo de SCC orofaríngea P16-positivo19,20.

Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças de FFPE com um jogo obtido do fabricante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O protocolo segue as diretrizes éticas e foi aprovado pelo Comitê de ética (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. preparação dos materiais

  1. Preparação do tampão de lavagem 1X
    1. Prepare 3 L de tampão de lavagem 1X adicionando 2,94 L de água destilada e um frasco (60 mL) de tampão de lavagem (50x) (veja a tabela de materiais) a um grande carboy. Misture bem.
      Nota: o tampão de lavagem 1X pode ser preparado antes do tempo e armazenado à temperatura ambiente por até 1 mês.
  2. Preparação de reagentes de contrcoloração
    1. Prepare 50% de hematoxilina.
      1. Em uma capa de fumaça, adicione 100 mL de hematoxilina de Gill I (ver a tabela de materiais) para 100 ml de água destilada em um prato de coloração.
        Nota: a solução de coloração de hematoxilina a 50% pode ser reutilizada por até 1 semana.
    2. Prepare 0, 2% (p/v) de água de amônia (reagente bluing).
    3. Na capa de fumos, adicione 1,43 mL de 1 N de hidróxido de amônio a 250 mL de água destilada em um cilindro graduado ou outro recipiente. Selar o cilindro com filme de parafina. Misture bem o seu conteúdo para 3X – 5X.
      Nota: para a quantificação do ensaio, é fundamental o uso de hidróxido de amónio. Os reagentes podem ser preparados antes do tempo. Assegure-se de que todos os contêineres permaneçam cobertos.
  3. Preparação do reagente de recuperação do alvo 1x
    1. Em uma taça grande, adicione 70 mL de reagente de recuperação alvo de 10x (ver a tabela de materiais) a 630 ml de água destilada.
    2. Coloque a taça sobre uma placa de aquecimento com um agitador magnético. Cubra-o com folha de alumínio.
    3. Ferver o seu conteúdo a 100 ° c por 10 – 15 min.
      Nota: não deixe ferver por mais de 30 min.
  4. Equilibração do reagente
    1. Assegure-se de que o forno de hibridação está ligado e a 40 ° c. Coloque o papel umidificação molhado na parte inferior da bandeja.
      Nota: um forno de hibridação (ver a tabela de materiais) é necessário para os passos 3,4 a 4,2.
    2. Retire os reagentes de amplificação (AMP1 – AMP6, consulte a tabela de materiais) do frigorífico e mantenha-os à temperatura ambiente, pelo menos 30 minutos antes da etapa de incubação pertinente.
    3. Antes de cada utilização, aqueça as sondas alvo e/ou de controlo durante, pelo menos, 10 min a 40 ° c no forno ou num banho de água ou numa incubadora.

2. reforço da aderência e desparaffinization na capa das emanações

Nota: iniciar o protocolo com amostras histológicas de 3 – 5 μm de espessura montadas em lâminas não manchadas.

  1. A fim de aumentar a aderência, assar as lâminas a 60 ° c por 1 h ou a 40 ° c durante a noite em um forno.
  2. Carregue o rack de slides com lâminas histológicas não manchadas. Mergulhe o rack de slides por 5 min em xileno fresco contido em um prato de coloração, com agitação ocasional. Repita com xileno fresco.
  3. Mergulhe o rack de slides por 3 min em fresco 100% etanol contido em um prato de coloração, com agitação constante. Repita com o etanol fresco de 100%.
  4. Deixe as lâminas secar por 2 min à temperatura ambiente.
    Nota: não reutilizar reagentes de desparaffinização para desidratação das lâminas após o ensaio.

3. pré-tratamento de tecidos

Nota: estas etapas seguem a recomendação de pré-tratamento "padrão" de acordo com as instruções do fabricante para amostras de cabeça e pescoço. O sincronismo das seções 3,1 e 3,2 pode precisar de ser ajustado dependendo do tecido manipulado.

  1. Bloqueio da atividade da peroxidase
    1. Adicionar 4 – 6 gotas de peróxido de hidrogênio (ver a tabela de materiais) para cada slide e incubar-los por 10 min à temperatura ambiente.
    2. Lave as lâminas 2x durante 2 min em água destilada à temperatura ambiente.
  2. Ruptura dos limites do RNA/tecido
    1. Com uma garra, retire a folha de alumínio do reagente de recuperação do alvo de ebulição 1x (TTR1x) da seção 1,3 e pare de mexer. Mergulhe o rack de slides lentamente e com muito cuidado por 15 min. Cubra a taça novamente com a folha de alumínio.
      Nota: simmering tem de persistir durante esta etapa.
      Cuidado: Use a garra para manipular a folha de alumínio e a cremalheira de corrediça para evitar ferimentos da queimadura. Certifique-se de usar equipamento de proteção pessoal adequado, como luvas e um jaleco.
    2. Com a garra, transfira imediatamente a cremalheira quente da corrediça a um banho de água destilada e lave-a por 2 minutos.
      Nota: Certifique-se de que as amostras não esfriam no TTR1x.
    3. Lave as lâminas em etanol fresco 100% por 2 min.
    4. Deixe as lâminas secar à temperatura ambiente durante 2 min.
  3. Criação de barreira
    1. Com uma caneta de barreira hidrofóbica (veja a tabela de materiais), desenhe uma barreira em torno da amostra. Deixe secar por pelo menos 5 min.
      Nota: permitir que a barreira para realmente secar. Se ele se desgasta durante o procedimento, não hesite em desenhá-lo novamente. Evite tocar o tecido com a caneta. O protocolo pode ser pausado durante a noite aqui.
  4. Digestão da protease
    1. Coloque os slides no rack de slides e adicione ~ 4 gotas de protease Plus por amostra (consulte a tabela de materiais).
    2. Cubra a bandeja de controle de umidade com uma tampa e insira-a no forno de hibridação por 30 min a 40 ° c.
      Nota: para evitar a evaporação, certifique-se de que o manípulo de volta está completamente virado para a posição de bloqueio.
    3. Retire a bandeja do forno e retire o rack de slides.
    4. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com água destilada.
    5. Lave as lâminas 2x durante 2 min em água destilada à temperatura ambiente. Agitam constantemente.

4. executar o ensaio

Nota: não deixe secar as secções entre as etapas de incubação.

  1. Hibridação da sonda de HPV
    Nota: Assegure-se de que as pontas de prova estejam pré-aqueceu para dissolver toda a precipitação antes do uso. Para este passo, em vez de sonda de HPV, peptidil-prolyl isomerase B (PPIB) para controle positivo ou diidrodipicolinate redutase (dapb) para controle negativo (ver a tabela de materiais) também pode ser usado.
    1. Toque e/ou deslize os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os no rack de slides. Adicionar ~ 4 gotas de sonda de HPV para cobrir inteiramente cada seção.
    2. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno por 2 h a 40 ° c.
      Nota: para evitar a evaporação, certifique-se de que o Nob de turno está completamente virado para a posição de bloqueio.
    3. Retire a bandeja do forno e retire o rack de slides.
    4. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com 1x tampão de lavagem.
    5. Lave as lâminas no tampão de lavagem 1X durante 2 min à temperatura ambiente com agitação constante. Repita isto com o tampão de lavagem 1X fresco.
  2. Hibridação de AMP1, AMP2, AMP3 e AMP4
    Nota: estas etapas incluem a hibridação no forno da hibridação e o AMP1-AMP4 do jogo comprado (veja a tabela dos materiais).
    1. Toque e/ou deslize o dedo para remover qualquer excesso de líquido dos slides e coloque-os no rack de slides. Adicionar ~ 4 gotas de AMP1 para cobrir inteiramente cada seção.
    2. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno por 30 min a 40 ° c.
    3. Retire a bandeja do forno e retire o rack de slides.
    4. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com 1x tampão de lavagem.
    5. Lave as lâminas no tampão de lavagem 1X durante 2 min à temperatura ambiente com agitação constante. Repita isto com o tampão de lavagem 1X fresco.
    6. Repita os passos 4.2.1 – 4.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP2 em vez de AMP1 e incubar por 15 min a 40 ° c. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.
    7. Repita os passos 4.2.1 – 4.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP3 em vez de AMP1 e incubar por 30 min a 40 ° c. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.
    8. Repita os passos 4.2.1 – 4.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP4 em vez de AMP1 e incubar por 15 min a 40 ° c. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.
  3. Hibridação de AMP5 e AMP6
    Nota: estas etapas não incluem a hibridação no forno mas a hibridação na temperatura ambiente. AMP5 e AMP6 vêm do kit comprado (veja a tabela de materiais).
    1. Toque e/ou deslize os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os no rack de slides. Adicionar ~ 4 gotas de AMP5 para cobrir inteiramente cada seção.
    2. Cubra a bandeja com uma tampa e incubar por 30 min à temperaturaambiente.
    3. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e colocá-lo em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com 1x tampão de lavagem.
    4. Lave as lâminas no tampão de lavagem 1X durante 2 min à temperatura ambiente com agitação constante. Repita isto com o tampão de lavagem 1X fresco.
    5. Repita os passos 4.3.1 – 4.3.4, mas use ~ 4 gotas de AMP6 em vez de AMP5 e incubar por 15 min à temperatura ambiente. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.

5. detecção de sinal com 3, 3 '-diaminobenzidina

PRECAUÇÃO: a diaminobenzidina (DAB) é tóxica. Siga as precauções apropriadas e as diretrizes de segurança ao descartar e manusear este produto químico.

  1. Misture volumes iguais de DAB-A e DAB-B (ver a tabela de materiais) em um tubo de tamanho adequado, dispensando o mesmo número de gotas de cada solução. Fazer ~ 120 μL de substrato DAB por secção (~ 2 gotas de cada reagente/total de 4). Misture bem para 3X – 5X.
  2. Pegue cada slide, um de cada vez, do rack de slides e toque e/ou mexa a tela para remover o excesso de líquido antes de colocá-lo no rack de slides.
  3. Pipeta ~ 120 μL de DAB para cada secção de tecido. Assegure-se de que as secções estão cobertas e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
  4. Descarte o DAB restante de acordo com a regulação local e insira o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com água da torneira.

6. contrcoloração

  1. Mova o rack de slides para um prato de coloração contendo 50% de solução de coloração de hematoxilina deixe descansar por 30 s à temperatura ambiente. Observe que os slides se tornarão roxos.
  2. Transfira imediatamente o rack de slides de volta para um prato de coloração contendo água da torneira, e lave os slides 3X – 5X movendo o rack para cima e para baixo.
  3. Continue repetindo a etapa de lavagem com água da torneira fresca até que as corrediças estejam desobstruídas, quando as seções permanecerem roxas.
  4. Substitua a água da torneira no prato de coloração com água de amônia de 0, 2%. Mova o rack para cima e para baixo 2x – 3x. Observe que a seção de tecido deve se tornar azul.
  5. Substitua a água da amônia com água da torneira. Lave as lâminas 3X – 5X.

7. desidratação

  1. Mova o rack de slides para um prato de coloração contendo 70% de etanol na capa de fumaça e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
  2. Mova o rack de slides para um primeiro prato de coloração contendo 100% de etanol e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
  3. Mova o rack de slides para um segundo prato de coloração contendo 100% de etanol e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
  4. Mova o rack de slides para um prato de coloração contendo xileno e deixe descansar por 5 min com agitação ocasional.

8. montagem da corrediça

  1. Remova os slides do rack de slides e coloque-os horizontalmente com as seções voltadas para cima na capa de fumaça.
  2. Monte um slide de cada vez, adicionando 1 gota de um meio de montagem à base de xileno a cada slide e colocando cuidadosamente um lamela de 24 mm x 50 mm sobre a seção. Evite prender quaisquer bolhas de ar.
  3. Seque as lâminas durante ≥ 5 min.

9. avaliação da amostra

  1. Examine as seções do tecido um microscópio padrão do brightfield na ampliação 20x-40x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Como descrito aqui, no cancro de pilha Squamous da cabeça e da garganta, um caso pode ser considerado positivo na presença de mancha punctiforme marrom no citoplasma ou nos núcleos de pilhas do tumor. Na maioria dos estudos, o sinal é considerado como "positivo" ou "não detectado"14. Métodos de semiquantificação do sinal foram relatados, mas falta de padronização entre as equipes. Por exemplo, em alguns estudos, os sinais foram marcados como 1 + com 1 – 3 pontos por célula tumoral, 2 + com 4 – 9 pontos por célula tumoral, ou 3 + com 10 pontos ou mais por célula tumoral6; em análises post hoc, foram levados em consideração apenas os sinais de 2 + e 3 +, que eram mais fáceis de interpretar. Em outro estudo, os resultados foram divididos em dois escores: RNA CISH "alto" e RNA CISH "baixo". O escore de RNA CISH "alto" foi definido por mais de 50% das células cancerosas manchadas, ou pela coloração cobrindo mais de 80% da superfície celular (núcleo e citoplasma) em pelo menos 30% das células cancerosas, como observado com um objetivo de 20x (Figura 1)21.

Em relação aos controles positivos, o sinal PPIB deve ser visível como pontos punctados dentro de núcleos celulares a uma ampliação de 20x – 40x. Quanto aos slides de controle negativo, um ponto para cada 10 células exibindo fundo DAB coloração por 20x microscópio campo é aceitável.

Figure 1
Figura 1: exemplos de coloração "baixa" e "alta" de RNA CISH. (A e B) Escore "baixo" do RNA cish que mancha em carcinomas de pilha Squamous orofaríngea. A coloração é observada em 50% das células tumorais e cobre menos de 80% da superfície celular. (C e D) escore de RNA cish "High" em carcinomas de células escamosas orofaríngeas. A coloração é observada em mais de 50% das células tumorais e, neste caso, a superfície de coloração excede 80% em mais de 30% das células tumorais. Este número foi modificado de Augustin et al.21por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O RNA CISH de HPV executado com um jogo comprado é uma ferramenta poderosa para a deteção de transcritos virais e indica a infecção ativa de HPV. Executado manualmente, as etapas do protocolo são gerais fáceis de seguir, e o kit comprado é conveniente. Esta técnica permite a coloração de 19 amostras histológicas mais uma corrediça do controle de uma vez, e o ensaio dura ao redor 8 h. É crítico não deixar as amostras secar entre as etapas a menos que mencionado de outra maneira. A condição do pré-tratamento pode precisar de ser ajustada dependendo do tecido manipulado.

O sinal da expressão de HPV E6-E7 mRNA é detectado com uma definição espacial precisa, assim descartando toda a contaminação das pilhas nonneoplastic HPV-infectadas adjacentes ao tumor. A detecção do RNA E6 e E7 do HPV é funcionalmente relevante, uma vez que essas transcrições são necessárias para a transformação celular induzida pelo HPV através de sua interação com as proteínas celulares p53 e pRb4. Portanto, em lesões pré-cancerosas do colo uterino, o RNA CISH do HPV pode ajudar a discriminar lesões intraepiteliais de baixo grau (LSIL) de lesões intraepiteliais de alto grau (HSIL) de acordo com a localização do sinal: na maioria dos casos de LSIL, abundante núcleos de coloração difusa são rotulados em toda a espessura epitelial, indicando uma fase produtiva. HSIL exibem núcleos diffusamente manchados abundantes da pilha na camada superficial, coexistindo com sinais pontuate nucleares e cytoplasmic fortes na camada mais baixa (nas lesões conhecidas anteriormente como CIN2), ou a mancha nuclear forte com pontos cytoplasmic ao longo da espessura do epitélio, indicando a fase transformadora da infecção pelo HPV (em lesões anteriormente conhecidas como NIC3)22.

Embora ainda não exista recomendação padrão para a avaliação semiquantitativa do sinal, alguns autores relatam uma relevância clínica, uma vez que a avaliação semiquantitativa das transcrições do HPV E6 e E7 permitiu a identificação de dois fatores prognósticos grupos de doentes com HNSCC relacionados com o HPV21. Tem sido postulado que a detecção de DNA de HPV sem transcritos E6 e E7 ou com apenas baixos níveis de transcritos E6 e E7 seria funcionalmente irrelevante e que tais pacientes devem ser agrupados com pacientes com câncer HPV-negativos21, a 23.

Em relação às limitações deste procedimento, é postulado que algumas hibridizações cruzadas não específicas podem acontecer em alguns casos, como a hipótese de Dreyer et al.23 o RNA cish pode não ser adequado para discriminação entre TRANSCRITOS de RNA E6/E7 e viral ADN, como o protocolo inclui uma etapa do tratamento térmico de 100 ° c, que seja suspeitada para permitir a desnaturação viral23do ADN. Isto é apoiado pela observação de dois tipos de sinais nos casos positivos, a saber a mancha forte localizou-se principalmente em núcleos da pilha do tumor, assim como um sinal granulado fino no citoplasma. Como a sonda utilizada neste protocolo vincula especificamente os genótipos 16 e 18 do HPV, que estão envolvidos em uma grande maioria de HNSCC4relacionado ao HPV, casos ocasionais associados ao HPV podem ser perdidos pelo RNA cish, seja por causa de certos genótipos de HPV que não são incluídos na sonda, ou por causa de mutações ou deleções de sítios de encadernação de primer. Finalmente, este método exige reagentes e dispositivos caros e não é facilmente acessível na prática rotineira.

Para cada amostra, um total de três seções são necessários: um para executar o teste de HPV, um para o controle positivo, e um para o controle negativo. Como o RNA é uma molécula frágil e pode deteriorar-se ao longo do tempo em amostras de FFPE, a qualidade das transcrições tem de ser verificada para cada amostra, utilizando sondas de controlo positivas tais como PPIB, ADN-dirigida RNA polimerase II subunidade RPB1 (Polr2a), ou polyubiquitin-C (UBC) , que são genes de limpeza humana. Além disso, quando há uma aproximação semiquantitativa, o sinal deve ser normalizado à ponta de prova21do controle do gene da limpeza. O controlo positivo recomendado para cada tecido pode ser encontrado nas instruções do fabricante. Entretanto, um estudo recente confirma que a expressão do mRNA pode ser estudada robustamente em amostras prospectivas e retrospectivas, mostrando níveis de mRNA comparáveis entre as amostras de 2004 e de 2008. Isto é a favor da integridade relativa do mRNA ao longo do tempo24. A sonda de controle negativa recomendada usada para evitar manchas inespecíficas é a codificação genética bacteriana para DAPB.

Aqui a hibridação in situ cromogênico do RNA de HPV é descrita como executada manualmente. Esta técnica também pode ser realizada com rotulagem fluorescente e/ou combinada com imunocoloração convencional.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: conselhos, seminários: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche

Acknowledgments

Os autores agradecem ao departamento de patologia de Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle legall); a plataforma de histologia do PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para edição de idioma; Alexandra Elbakyan por sua contribuição.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5, (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24, (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21, (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15, (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41, (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142, (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42, (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363, (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73, (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28, (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36, (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27, (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21, (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126, (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9, (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462, (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. (2017).
Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter