Summary
一种泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应已开发出来, 专门检测所有已知的溶酶病毒。利用不同动物物种的狂犬病脑样本进行验证, 表明该方法具有与金标准荧光抗体检测相当的敏感性和特异性, 可用于常规狂犬病诊断。
Abstract
为了检测狂犬病毒和其他品种的独状病毒在Rhabdoviridae家族中, 开发了泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应 (嵌套 rt-pcr) 来检测保守区域裂解病毒的核蛋白 (N) 基因。该方法应用逆转录酶 (RT) 作为模板, 寡核苷酸 (dT) 15 和随机六分体为引物, 合成病毒互补 DT (cdna)。然后, 病毒 cDNA 被用作模板, 在第一轮 PCR 中使用外部引物扩增 845 bpn 基因片段, 然后采用第二轮嵌套 PCR, 使用内引物扩增最终 371 bp 片段。这种方法可以检测狂犬病病毒 (RABIES) 的不同遗传障碍。该方法在中国10年的临床狂犬病诊断和监测中, 使用了8种家畜的 9, 624个大脑标本, 结果表明, 与直接荧光相比, 该方法具有100% 的敏感性和99.97 的特异性。抗体检测 (FAT), 这是世界卫生组织 (世卫组织) 和世界动物卫生组织 (OIE) 推荐的金标准方法。此外, 该方法还可以具体放大国际病毒分类委员会 (ICTV) 第十次报告中其他15个已批准的和两个新的裂解病毒物种的靶向 n 基因片段, 并通过对合成的模拟检测进行评估。所有裂解病毒的 n 基因质粒。该方法为 FAT 狂犬病诊断提供了一种方便的替代方法, 并已被批准为中国国家标准 (GB/T36789-2018)。
Introduction
狂犬病是一种世界性的人畜共患疾病,由 Lyssavirus1属内的病毒引起。Lyssaviruses ( Rhabdoviridae家族) 是单基因链 rna 病毒, 基因组约为 12 kb, 编码五种蛋白质: n、磷蛋白 (p)、基质蛋白 (m)、糖蛋白 (g) 和大蛋白质或聚合酶 (l)。根据 N 基因的核苷酸序列、遗传距离和抗原模式, lyssaviruses 被划分为16个物种, 包括经典狂犬病病毒 (RABIES) 和狂犬病相关病毒 (RRV): 拉各斯蝙蝠病毒 (LBV)、Duvenhage 病毒 (DUVV))、Ikoma 病毒 (IKOMA)、欧洲蝙蝠裂解病毒 1 (EBLV-1)、欧洲蝙蝠裂解病毒 2 (EBLV-2)、澳大利亚蝙蝠裂解病毒 (ABLV)、Aravan 病毒 (ARAV)、Ikoma 病毒 (IKOV)、Bokeloh 蝙蝠 lyssavirus (BBLV)、Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV)、Ikoma 病毒 (IKOMA),Khujand 病毒 (KHUV)、西亚蝙蝠病毒 (WCBV)、Shimoni 蝙蝠病毒 (SHIBV) 和 Lleida 蝙蝠裂解病毒 (LYSSAVIRUS)2。最近又发现了两种溶酶病毒: 2017年在芬兰从勃兰特蝙蝠 (Myotis brandtii) 中分离出的 kotalahti 蝙蝠溶酶病毒 (kblv) 3 和从日本管状物中分离出的台湾蝙蝠溶酶病毒 (twblv) (2016年至2017年在中国台湾的 pipistrellus abramus) 4。
所有哺乳动物都容易患狂犬病;然而, 没有严重的病原学病变或特定的临床体征允许其识别, 诊断只能在实验室5。狂犬病诊断最广泛使用的方法是 fat, 世卫组织和国际兽疫局5、6、6都将其视为金本位。然而, FAT 可以产生不可靠的结果降解/自溶脑组织样本。此外, 它不能用于检测生物液体标本, 如脑脊液 (CSF), 唾液和尿液, 从而在很大程度上排除了它在前肿瘤诊断7。替代常规诊断测试, 如狂犬病组织培养感染测试 (RTCIT) 和小鼠接种测试 (MIT), 需要几天6, 一个主要的缺点, 当快速诊断是必不可少的。
各种分子诊断测试 (例如, 通过 RT-PCR 检测病毒 rna、PCR-酶联免疫吸附法 [PCR-ELISA]、原位杂交和实时 PCR) 被用作狂犬病诊断的快速和敏感技术8。RT-PCR 现在被国际兽疫局推荐用于常规狂犬病诊断, 并且在《兽生动物诊断测试和疫苗手册》中描述了一种半检测 (hn) PCR, 以检测所有的溶酶病毒 5。在这里, 我们描述了一个泛裂解病毒嵌套的 RT-PCR, 它允许特定和敏感地检测所有18种裂解病毒, 类似于或超过 FAT 获得的。该方法的原理是将目标 RNA (裂解病毒 N 基因的保守区域) rt 转化为 cDNA, 然后通过两轮 PCR 扩增 cdna。CDNA 通过第一轮 PCR 与外部引物, 以扩增 845 bp 片段;然后, 第二轮 PCR 使用第一轮 PCR 产物作为模板, 用内引物扩增 371 bp 片段。两轮 PCR 显著提高了检测的灵敏度。
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Protocol
该议定书中对小鼠的使用得到了中国军事医学科学院动物福利管理委员会的批准 (实验动物护理和使用委员会授权, 许可证编号 jsy-dw-2010-02)。所有关于护理和使用实验动物的机构和国家准则都得到了遵守。
1. RNA 提取
- 使用鸟苷异硫氰酸酯-苯-氯仿提取方法或市售的病毒 rna 提取试剂盒, 从狂犬病疑似脑组织、皮肤活检、唾液或脑脊液或感染 rabv 的细胞培养中提取 RNA。立即使用准备好的 RNA, 或将其存放在-80°c, 直到需要为止。
2. 病毒 RNA 的反向转录
- 从冰柜中取出表1 中列出的 rt 试剂, 将其放在冰上, 并在使用前将其解冻和涡旋。
- 用表 1中列出的试剂在 0.2 ML PCR 管中制备 12ΜL rt 反应混合物。通过准备至少比要求的一个反应尺寸大的主混合量, 允许移液变化。
- 在模板室的 PCR 工作站内的 RT 反应混合物中添加8μl 样本、阳性控制 RNA 或阴性对照。RT 阳性对照是从感染固定 RABV 株 CVS-11 (挑战病毒标准 11) 的细胞培养中提取的 RNA, 并存储在-80°c。负控制包含无 rnase 的 Ddh2o.
- 通过涡流混合 RT 管的内容;然后, 离心机短暂。
- 将反应管加载到热循环器中。设置 cDNA 合成程序, 条件如下: 42°c 90分钟, 95°c 5分钟, 4°c 保持。将反应体积设置为 20μl. 开始 RT 运行。
3. 第一轮 PCR
- 将表 2中列出的 PCR 试剂放在洁净室的冰上, 直至使用;然后, 解冻和涡旋他们。
- 用表 2中列出的试剂在 0.2 ML PCR 管中制备第一轮 PCR 混合物。
- 在模板室的 PCR 工作站内的第一轮 PCR 混合物中加入2Μl 的 cdna 或质粒样本。PCR 阳性对照是为上述 RT 方法准备的第2.3 步中提到的 CVS-11 cDNA。PCR 阴性对照为 Ddh2o.
- 使用表 3中列出的参数将密封管转移到 PCR 热循环器和循环。
4. 第二轮 PCR
- 使用表 4中列出的试剂在 0.2 ML PCR 管中制备第二轮 PCR 混合物。
- 在第二轮 PCR 混合物中加入2μl 的第一轮 PCR 产物。此外, 包括 Ddh2o作为第二轮 PCR 的负控制。
- 使用步骤3.4 中给出的相同参数执行 PCR 热循环。
5. 琼脂糖凝胶电泳技术对 PCR 产物的分析
- 将1.5 克琼脂糖加入100毫升的醋酸酯 edta (TAE), 制备1.5% 琼脂糖凝胶, 并在微波炉中加热将其彻底溶解。
- 添加溴化乙酯 (EB) (最终浓度为 0.01%)或其他商业 EB 替代。将凝胶倒进模具中, 让其在环境温度下凝固至少30分钟。
- 将每个 PCR 产品的5μl 与6x 的负载缓冲液混合, 准备加载样品。
- 分别将样品和合适的 DNA 标记加载到井中, 并在 120 V 下运行凝胶约 30-45, 直到染料线在凝胶下大约 75%-80%。
- 关闭电源, 断开电极与电源的连接, 然后小心地从凝胶盒中取出凝胶。
- 使用 UV 凝胶记录设备来可视化和拍摄 DNA 片段。
6. 嵌套 RT-PCR 的表征
-
6.1. 检测 18 种溶酶病毒质粒的特异性和敏感性
- 为 PCR 订购18个商业质粒, 其中含有每个裂解病毒 (16 种 ICTV 物种和2个新物种) 的完整 N 基因。
- 使用 Avogadro 的编号 (n a) 和以下公式计算质粒的复制编号。
[(g/μL 质粒 DNA)/(质粒长度为 bp x 660)] x 6.0 22 x10 23 = 分子数μl - 准备 Ddh2o 中所有18种质粒的库存溶液 (2.24 x10 9 分子.
- 对 ddH2o 中的所有18个质粒进行 9次10倍系列稀释, 同时对每个质粒库存进行9μl 的稀释, 并对其进行90Μl 的ddh2o. 涡旋和离心机。
- 如第3-5 节所述, 进行 PCR 扩增。
- 通过检测一系列溶酶病毒质粒, 分析嵌套 PCR 的特异性和敏感性。
-
D 的确定埃特切l.伊米特
- 将狂犬病毒株 CVS-11 细胞培养的滴度调整为 105.5 tcid 50/ml (根据《国际兽疫局手册》确定的病毒滴度)5.
- 如步骤6.1.4 所述, 对 CVS-11 (库存溶液为 105.5 tcid 50/ml) 进行 5次10倍串行稀释。
- 执行 rna 提取和嵌套的 RT-PCR 扩增程序的所有病毒稀释, 如第1-5 节所述。
-
康帕尔里松的中.嵌套 RT-PCR与 "金本位" fat
- 用嵌套 RT-PCR 对所有临床样品进行检测, 然后用 FAT5和 n 基因测序9证实结果.
- 使用规范化数据对 SAS 9.1 进行统计分析。使用 kappa 测试和 McNemar 的卡方测试对诊断测试进行统计比较 (SAS 命令: proc freq; table/同意)。计算假设异常分布的置信区间。
-
降解样品检测效果的评价
- 在37°c 条件下, 公开两个确诊的狂犬病犬临床脑组织样本。
- 用嵌套的 RT-PCR、FAT 和 MIT5对在37°c 下暴露的每一天的两个样本进行检测。
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Representative Results
嵌套 RT-PCR 检测18种裂解病毒的结果如图 1所示。所有 PCR 阳性对照显示, 在第二轮扩增中, 第一和 371 bp 的预期 845 bp, 在负对照中没有带带。所有18种裂解病毒产生了预期的845和/或 371 bp 波段, 这表明嵌套的 RT-PCR 检测到了所有18种 lyssaviruses。16种裂解病毒质粒在两轮 PCR 中具有有效扩增作用, 但在第一轮或第二轮 PCR 中, 有两种裂解病毒质粒具有扩增作用。该方法在检测不同的裂解病毒质粒时的灵敏度各不相同, 范围从 2.24 x10 0 到 2.24 x10 5 分子, 如表 6所示。这些差异可归因于由于病毒序列多样性导致引物和模板之间的不匹配。此外, 在细胞培养中检测狂犬病毒 CVS-11 的敏感性为 102.5 tcid 50/。
用嵌套 RT-PCR 对临床标本中的 9, 624个脑组织进行了检测, 结果在表 7中进行了总结, 结果显示嵌套 RT-PCR 具有100% 的敏感性 (ci, 97.75% 至 100%)和99.97 的特异性 (CI, 99.97 到 99.97)。两种方法的一致性为99.07%。嵌套 RT-PCR 检测呈阳性, fat 检测结果呈阴性, 均为高度衰变的临床资料。通过 N 基因测序, 这三个标本被证实为 RABV 阳性。
对在 37°c (协议步骤 6.4.1) 孵育的两个脑标本的检测性能进行比较, 表明嵌套的 RT-PCR 可以在降解后至少17天内有效地检测腐烂脑组织中的病毒。较长的时间, 而不是只有7天的 FAT, 甚至没有1天的麻省理工学院。结果表明, 嵌套 RT-PCR 在检测降解样品方面比 FAT 和 MIT 更敏感。
为了进一步验证嵌套的 RT-PCR, 中国邀请了10个狂犬病实验室对一组标本进行测试。其中, 8个实验室从我们的实验室获得了一套10个失明的动物大脑组织, 包括 RABV 阳性和阴性标本。另外两个实验室使用了自己的标本。所有标本都已存档, 并得到 FAT 先前的确认。所有10个实验室均采用嵌套 RT-PCR 获得100% 与 FAT 一致的结果, 没有假阴性或假阳性 (表 8), 表明嵌套 RT-PCR 具有较高的特异性和重现性。
| 组件 | 每反应的体积 (μL) |
| Dntp (2.5 mM) | 4个 |
| 随机底漆 (50μm) | 1。5 |
| 奥利戈 (dT) 15 (50μm) | 0。5 |
| M-MLV 缓冲器 (5倍) | 4个 |
| M-MLV 逆转录酶 (200 Iu/l) | 1 |
| RNasin (40 uuμl) | 1 |
| 总成交量 | 12 |
表 1:试剂类用于 cDNA 合成的逆转录酶.
| 组件 | 每反应的体积 (μL) |
| Dntp (10 mM) | 1 |
| 前 taq (5 ueμl) | 0。3 |
| Taq 缓冲器 (10倍) | 5 |
| N127 (20μm) | 1 |
| N829 (20μm) | 1 |
| dd H2o | 39。7 |
| 总成交量 | 48 |
表 2:试剂类的第一轮 PCR.
| 温度 | 时间 | 周期 |
| 94°c | 2分钟 | 1 |
| 94°c | 30秒 | 35 |
| 56°c | 30秒 | 35 |
| 72°c | 40秒 | 35 |
| 72°c | 10分钟 | 1 |
| 4°c | ∞ |
表 3:C的循环参数.的第一(2)第二轮 PCR.
| 组件 | 每反应的体积 (μL) |
| Dntp (10 mM) | 1 |
| 前 taq (5 ueμl) | 0。3 |
| Taq 缓冲器 (10倍) | 5 |
| N371F (20μm) | 1 |
| N371R (20μm) | 1 |
| dd H2o | 39。7 |
| 总成交量 | 48 |
表 4:试剂类的第二轮 PCR.
| 底漆名称 | 细节 | 方向 | 序列 (5 '-3 ') | 核苷酸位置 | 产品尺寸 | |
| N127 | 第一轮 PCR | 向前 | ATTAACOCTCATATG | -19 ~ 0 | 845bp | |
| N829 | 第一轮 PCR | 反向 | GCCCTGTGCGGAACATTCT | 807 ~ 807 | 845bp | |
| N371F | 第二轮 PCR | 向前 | ACAAGAGAKKCT GACAARATG | -6 ~ 15 | 371bp | |
| N371R | 第二轮 PCR | 反向 | CCTGYGCCTVTCETC | 345 ~ 367 | 371bp | |
表 5:底漆 s等的第一(2)第二轮Pcr. 退化碱基: N (a/t/c过来)、K (g/t)、R (a)、Y (C/2)、WV (G/ac)。
| 裂解病毒种类 | 应变 | 模板质粒 (分子/μl) |
| RABV | GQ918139。1 | 2.24 x 101 |
| LBV | 欧盟 29331 10。1 | 2.24 x 102 |
| MOKV | KF155005。1 | 2.24 x 101 |
| DUVV | 29311一例 | 2.24 x 101 |
| EBLV-1 | EF157976。1 | 2.24 x 101 |
| EBLV-2 | KF155004。1 | 2.24 x 101 |
| ABLV | GU992312。1 | 2.24 x 100 |
| IRKV | NC_020809.1 | 2.24 x 101 |
| WCBV | NC_025377.1 | 2.24 x 101 |
| KHUV | NC_025385.1 | 2.24 x 103 |
| ARAV | NC_020808.1 | 2.24 x 102 |
| SHIBV | NC_025365.1 | 2.24 x 101 |
| BBLV | NC_025251.1 | 2.24 x 101 |
| IKOV | NC_018629.1 | 2.24 x 105 |
| LLEBV | NC_031955.1 | 2.24 x 103 |
| GBLV | NC_031988.1 | 2.24 x 105 |
| KBLV | MF960865。1 | 2.24 x 101 |
| TWBLV | MF472710。1 | 2.24 x 101 |
表 6:检测限制嵌套 RT-PCR不, 不, 不f 18 升萨病毒等.
| 标准方法和结果 | RT-nPCR 积极 |
RT-nPCR 负 |
相关性 (%) | |
| 脂肪 | 积极 负 |
162 3个 |
0 9459 |
99.07 |
表 7:之间的相关性嵌套 RT-PCR和 fat中.临床标本中的 Rabv 检测.
表 8:嵌套 RT-PCR 的验证结果.10个实验室.
图 1: 检测 18溶酶病毒叶斯通过嵌套的 RT-PCR.(A) 第一轮 PCR 的结果。(B) 第二轮 PCR 的结果。M = DL 2000 DNA 标记。4–18通道 = RABV, LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、IKOV、bblv、GBLV、IRKV、khuv、llebv、SHIBV、WCBV、KBLV 和 TWBLV 分别。车道 19 = PCR 阳性控制;车道 20 = 第一轮 PCR 的负控制;车道 21 = 第二轮 PCR 的负控制。一个阳性的 PCR 结果显示, 第一轮的带为 845 bp, 第二轮 PCR 为 371 bp。ARAV 的放大器在第一轮中不可见, 但在第二轮 PCR (第8车道) 中可见, 而 IKOV 的放大器在第一轮中可见, 但在第二轮 PCR (第9车道) 中不可见。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 与引物序列的比较显示, 18个裂解病毒物种的引物区存在差异核苷酸.N127 和 N829 是外部引物, N371F 和 N371F 是内引物。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
目前, RABIES 是一种主要的裂解病毒, 对中国以及其他国家几乎所有的人类和动物狂犬病负有责任。此外, 2012年10年, 在中国东北吉林省的murina 白球蝙蝠身上首次发现了 irkv 变种, 据报道, 该变种在2017年在辽宁省造成一只狗死亡11。最近, 2017年, 在中国台湾, 从日本的一种管状蝙蝠身上发现了一种新型的溶酶病毒 TWBLV。这些结果表明, 有效检测其他裂解病毒对于防止蝙蝠传播的裂解病毒溢出也很重要。在这方面, 泛裂解病毒嵌套的 RT-PCR 针对最保守的 N 基因区域是一个非常有用的工具, 研究结果表明, 它能够有效地检测到所有16个经 ictv 批准的病毒和迄今发现的两种新的裂解病毒物种, 包括中国的基因差异的 Rabv 和 IRKV (没有显示 IRKV 菌株的数据)。然而, 也值得注意的是, 仅通过第二轮 PCR 引物检测到了 ARAV, 而 IKOV 仅通过第一轮 PCR 引物检测到 (图 1)。为了研究这种差异的原因, 对四个引物区域内的所有18种裂解病毒进行了序列比较, 结果表明, 在第一轮 PCR 中, 外部引物 N829 的 3 ' 端核苷酸 T 和 3 ' 的第二核苷酸 T第二轮 PCR 中内引物 N371F 的末端与 ARAV (G) 和 IKOV (A) 的相应位置不一致 (图 2)。一旦引物 N829 的 T 改为 ARAV 的 G, 引物 N371F 的 T 改为 IKOV 的 A, 这两种病毒在 PCR 中都被成功检测 (数据未显示)。这一结果表明了引物的 3 ' 端核苷酸或近端核苷酸在目标区域的成功扩增中的关键作用。
为了评价该方法在临床诊断和监测中检测狂犬病毒的敏感性和特异性, 在过去10年中, 用 FAT 和嵌套 RT-PCR 对 9, 624个动物脑组织样本进行了平行检测。在用嵌套 RT-PCR 检测狂犬病阳性的165个样本中, 162个被 FAT 检测为阳性;因此, 这两种方法显示99.07% 的一致性。在这165个样本中检测到的 rapv 可分为亚洲、拱形和宇宙中的12、13种不同的谱系, 这表明嵌套的 rt-pcr 可以覆盖 rabv 的各种遗传块。用嵌套 RT-PCR 检测出三个高度腐烂的临床标本呈阳性, 但 FAT 检测呈阴性。这一结果与对两个降解样本的有效性的评估是一致的, 如代表性结果部分所示, 表明嵌套 RT-PCR 在检测高度腐烂样本中的病毒方面比 FAT 更敏感。
参加由法国食品、环境和职业健康 & 安全局的欧盟狂犬病参考实验室组织的国际实验室比较试验 (ILCT) 进一步证实了嵌套 RT-PCR 的性能 (ANSES), 2010年, 使用一组12个样品 (一个为 RABV、EBV-1、EBLV-2 和 ABLV 作为正对照, 1个负对照, 7个盲图样本)。在测试中, 嵌套 RT-PCR 成功地识别了所有具有100% 一致性的溶酶病毒。2018年, 该方法被国家动物卫生标准化委员会批准为国家狂犬病诊断标准 (GB/T36789-2018)。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家关键研究和发展计划 (2016号 YFD0500401 赠款) 和中国国家自然科学基金 (第31302043赠款) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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