Summary
Ett Pan-lyssavirus kapslade omvänd transkription polymeras kedje reaktion har utvecklats för att upptäcka specifikt alla kända lyssaviruses. Validering med hjälp av rabieshjärnprover av olika djur arter visade att denna metod har en känslighet och specificitet som motsvarar den guldmynt standard fluorescerande anti kropps test och kan användas för rutinmässig rabies diagnos.
Abstract
För att upptäcka rabiesvirus och andra medlems arter av släktet lyssavirus inom familjen Rhabdoviridae, utvecklades Pan-lyssavirus kapslade omvänd transkription polymeras kedje reaktion (kapslade RT-PCR) för att upptäcka den bevarade regionen av nukleoproteingenen (N) hos lyssaviruses. Metoden tillämpar omvänd transkription (RT) med hjälp av viral RNA som mall och oligo (DT)15 och slumpmässiga multihexamererna som primers för att syntetisera viral kompletterande DNA (cDNA). Sedan, den Viral cDNA används som en mall för att förstärka en 845 BP N genfragment i första omgången PCR med yttre primers, följt av andra omgången kapslade PCR att förstärka den slutliga 371 BP fragment med inre primers. Denna metod kan detektera olika genetiska klader av rabiesvirus (RABV). Valideringen, med hjälp av 9 624 hjärnprover från åtta inhemska djur arter i 10 år av kliniska rabies diagnoser och övervakning i Kina, visade att metoden har 100% känslighet och 99,97% specificitet i jämförelse med den direkta fluorescerande anti kropps test (FAT), den guldmynt standard metod som rekommenderas av Världshälso organisationen (WHO) och världs organisationen för djur hälsa (OIE). Dessutom kan metoden också specifikt förstärka riktade N genfragment av 15 andra godkända och två nya lyssavirus arter i den 10: e rapporten från internationella kommittén för taxonomi av virus (ICTV) som utvärderats av en härma upptäckt av syntetiserade N-genplasmider av alla lyssaviruses. Metoden ger ett bekvämt alternativ till FAT för rabies diagnos och har godkänts som en nationell standard (GB/T36789-2018) i Kina.
Introduction
Rabies är en världs omspännande zoonotisk sjukdom orsakad av virus inom släktet lyssavirus1. Lyssaviruses (familjen Rhabdoviridae) är Single-negativa-Stranded RNA-virus med en cirka 12 KB genom att kodar fem proteiner: N, fosfoprotein (P), Matrix protein (M), glykoprotein (G), och det stora proteinet eller polymeras (L). Baserat på nukleotidsekvenser av N-genen, genetiska avstånd och antigena mönster har lyssaviruserna delats in i 16 arter, bestående av klassisk rabiesvirus (RABV) och rabiesrelaterade virus (RRV): Lagos bat-virus (LBV), Duvenhage-virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), australisk fladdermuslyssavirus (ABLV), Aravan-virus (ARAV), Ikoma-virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut-virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), West kaukasiska bat virus (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), och Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Nyligen har ytterligare två lyssaviruser identifierats: kotalahti bat lyssavirus (kblv) som Isoler ATS från en Brandt fladdermus (Myotis brandti) i Finland 20173 och taiwanesiska bat lyssavirus (twblv) isolerade från en japansk pipistrelle ( Pipistrellus abramus) i Taiwan, Kina 2016 – 20174.
Alla däggdjur är mottagliga för rabies; emellertid, inga grova patognomonic lesioner eller specifika kliniska tecken tillåter dess identifiering, och diagnos kan endast göras i laboratoriet5. Den mest använda metoden för rabies diagnos är fettet, som anses vara den gyllene standarden av både WHO och OIE5,6. Ändå kan FAT producera opålitliga resultat på degraderad/autolyzed hjärn vävnad prover. Dessutom, det kan inte användas för att assay biologiska vätske preparat såsom cerebrospinalvätska (CSF), saliv, och urin, vilket i hög grad utesluter sin anställning i veterinärbesiktning diagnos7. Alternativa konventionella diagnostiska tester, såsom rabies vävnads odling infektion test (RTCIT) och musen inympnings test (MIT), kräver flera dagar6, en stor nackdel när en snabb diagnos är viktigt.
Olika molekyl ära diagnostiska tester (t. ex. detektion av viral RNA med RT-PCR, PCR-enzymlänkade immunsorbent assay [PCR-ELISA], in situ hybridisering och realtids-PCR) används som snabba och känsliga tekniker för rabiesdiagnostik8. RT-PCR rekommenderas nu av OIE för rutinmässig rabiesdiagnostik, och en heminested (HN) PCR beskrivs i OIE: s manual för diagnostiska tester och vacciner för land levande djur för att detektera alla lyssaviruser5. Här beskrivs en kapslad RT-PCR med Pan-lyssavirus, som möjliggör en specifik och känslig detektion av alla 18 lyssaviruter som är jämförbara med eller överträffar den som erhålls genom FAT. Principen för metoden är en RT av mål-RNA (bevaras region av lyssavirus N genen) i cDNA, följt av amplifiering av cDNA med två omgångar av PCR. CDNA genomgår den första omgången PCR med yttre primers att förstärka en 845 BP fragment; sedan, den andra omgången PCR använder den första omgången PCR-produkt som en mall för att förstärka en 371 BP fragment med inre primers. De två omgångarna av PCR ökar signifikant känsligheten hos analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av möss i detta protokoll godkändes av administrativa kommittén för djurens välbefinnande vid Institutet för militär veterinär medicin, akademin för militära medicinska vetenskaper, Kina (laboratorium djur vård och användning kommitté bemyndigande, tillstånd antal JSY-DW-2010-02). Alla institutionella och nationella rikt linjer för skötsel och användning av försöks djur följdes.
1. RNA-extraktion
- Extrahera RNA från rabies-misstänkt hjärn vävnad, hudbiopsier, saliv, eller CSF eller från RABV-infekterad cell kultur, med guanidinium Isotiocyanat-fenol-kloroformbaserade extraktionsmetoder eller kommersiellt tillgängliga virala RNA-extraktionssatser. Använd det beredda RNA omedelbart eller förvara det vid-80 ° c tills det behövs.
2. omvänd transkription av viral RNA
- Ta bort de RT-reagenser som listas i tabell 1 från frysen, förvara dem på isen och Tina dem före användning.
- Bered 12 μL RT-reaktionsblandning i ett 0,2 mL PCR-rör med de reagenser som anges i tabell 1. Tillåt pipettering av variationer genom att förbereda en volym Master mix minst en reaktions storlek större än vad som krävs.
- Tillsätt 8 μL prov, positivt KONTROLLRNA eller negativ kontroll till RT-reaktionsmixen inom en PCR-arbetsstation i ett mallrum. RT-positiva kontrollen är RNA extraheras från cell kulturen infekterade med fasta RABV stam CVS-11 (Challenge virus standard-11) och lagras vid-80 ° c. Den negativa kontrollen innehåller RNase-Free ddH2O.
- Blanda innehållet i RT rören genom vortexing; Centrifugera sedan en kort stund.
- Sätt in reaktions rören i en termisk cykler. Ställ in cDNA-syntes programmet med följande villkor: 42 ° c för 90 min, 95 ° c i 5 min och 4 ° c på håll. Ställ in reaktions volymen på 20 μL. Starta RT-körningen.
3. första omgången PCR
- Förvara de PCR-reagenser som anges i tabell 2 på is i ett rent rum tills de används. sedan Tina och vortexera dem.
- Bered den första omgången PCR-blandningen i ett 0,2 mL PCR-rör med de reagenser som anges i tabell 2.
- Tillsätt ett 2 μL prov av cDNA eller Plasmid i den första omgången PCR-blandningen inom en PCR-arbetsstation i ett mallrum. PCR-positiv kontroll är CVS-11 cDNA som har förberetts som nämns i steg 2,3 för ovanstående RT-metod. PCR-negativa kontrollen är ddH2O.
- Överför de förseglade rören till en PCR-termocykler och cykla med de parametrar som anges i tabell 3.
4. andra omgången PCR
- Bered den andra omgången PCR-blandningen i ett 0,2 mL PCR-rör med hjälp av de reagenser som anges i tabell 4.
- Tillsätt 2 μL av den första omgången PCR-produkt i den andra omgången PCR-mix. Dessutom inkluderar ddH2O som en negativ kontroll av den andra omgången PCR.
- Utför PCR-termisk cykling med samma parametrar som anges i steg 3,4.
5. analys av PCR-produkter genom Electrophoresis på agarose gels
- Förbered en 1,5% AGA ros gel genom att tillsätta 1,5 g AGA Ros till 100 ml av tris-acetat-EDTA (Tae) och upplösa den grundligt genom att värma den i en mikrovågsugn.
- Tillsätt etidiumbromid (EB) (vid en slutlig koncentration på 0,01%) eller annan kommersiell EB-substitution. Häll gelen i formen och låt den stelna vid rums temperatur i minst 30 min.
- Förbered lastproverna genom att blanda 5 μL av varje PCR-produkt med 1 μL 6x lastbuffert.
- Ladda proverna och lämplig DNA-markör separat i brunnarna och kör gelen för ca 30-45 min vid 120 V tills färg linjen är cirka 75%-80% ner gelen.
- Stäng av strömmen, koppla bort elektroderna från ström källan och ta sedan försiktigt bort gelen från gel boxen.
- Använd en UV-Gel dokumentera enhet för att visualisera och fotografera DNA-fragment.
6. karakterisering av kapslade RT-PCR
-
6,1. specificitet och känslighet för detektion av 18 lyssaviruseplasmider
- Beställ 18 kommersiella plasmider som innehåller hela N genen för varje lyssavirus (16 ICTV arter och två nya arter) för PCR.
- Beräkna plasmidets kopie nummer med hjälp av Avogadros nummer (Na) och följande formel.
[(g/μL plasmid DNA)/(Plasmid längd i BP x 660)] x 6,022 x 1023 = antal molekyler/μl - Förbered lager lösningar (2,24 x 109 molekyler/μl) av alla 18 plasmider i DDH2O.
- Utför 9 10-faldigt seriella utspädningar av alla 18 plasmider i ddH2o. Späd 10 μl av varje Plasmid-lager med 90 ΜL DDH2o. vortexoch Centrifugera en kort stund.
- Utför PCR-amplifiering enligt beskrivningen i avsnitten 3-5.
- Analysera specificiteten och känsligheten hos den kapslade PCR-analysen genom att detektera en serie lyssaviruplasmider.
-
Bestämning av d och etik l IMIT
- Justera titern för rabiesvirusets stam CVS-11 cell kultur till 105,5 tcid50/ml (virus TITER bestäms enligt OIE manual)5.
- Utför 5 10-faldigt seriella utspädningar av CVS-11 (stam lösning är 105,5 tcid50/ml) enligt beskrivningen i steg 6.1.4.
- Utför RNA-extraktion och kapslade RT-PCR-amplifieringsprocedurer för alla virala utspädningar som beskrivs i avsnitten 1-5.
-
Compar Ison av de KAPSLAD RT-PCR med "Gold Standard" fett
- Testa alla kliniska prover med nästlade RT-PCR och bekräfta sedan resultaten med FAT5 och N-genen sekvensering9.
- Använd normaliserade data för en statistisk analys med SAS 9,1. Använd kappa test och McNemar Chi-fyrkant test för en statistisk jämförelse av diagnostiska tester (SAS kommando: PROC freq; tabell/agree). Beräkna KONFIDENS intervall som antar abinomialfördelning.
-
Utvärdering av effekten vid testning av nedbrutna prover
- Exponera två bekräftade kliniska hjärnvävnadsprover av rabiat hundar vid 37 ° c.
- Assay de två proverna på varje dag av exponeringen vid 37 ° c genom nästlade RT-PCR, FAT, och MIT5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat av kapslad RT-PCR för att detektera 18 lyssavirusarter visas i figur 1. Alla PCR-positiva kontroller visade den förväntade 845 BP i första-och 371 BP i den andra omgången amplifikationer utan band i den negativa kontrollen. Alla 18 Lyssavirusen producerade de förväntade 845 och/eller 371 BP band, vilket indikerar att den kapslade RT-PCR upptäckte alla 18 Lyssavirusen. Sexton Lyssavirusen plasmider hade effektiv förstärkning i två omgångar av PCR, men två, nämligen arav och ikov, hade amplifiering i antingen första-eller andra omgången PCR. Metodens känslighet varierade vid detektion av olika lyssaviruplasmider, med gränser från 2,24 x 100 till 2,24 x 105 molekyler/μl, som visas i tabell 6. Dessa skillnader kan hänföras till Miss matchningar mellan primers och mallar på grund av viral sekvens mångfald. Dessutom var känsligheten för detektion av rabiesvirus CVS-11 i cell kultur 102,5 tcid50/ml.
Totalt 9 624 hjärn vävnader från kliniska prover testades med kapslade RT-PCR i jämförelse med FAT och resultaten sammanfattas i tabell 7, som visar att kapslade RT-PCR hade en 100% känslighet (CI, 97,75% till 100%) och en 99,97% specificitet (CI, 99,91% till 99,99%). Överensstämmelse mellan de två metoderna var 99,07%. Tre tester som var positiva med kapslade RT-PCR men negativa av fat var av mycket skämda kliniskt material. Dessa tre prover bekräftades som RABV positiva av N gen sekvensering.
Jämförelse av test prestandan vid detektion av de två hjärn prov som inkuberats vid 37 ° c (steg 6.4.1 i protokollet) indikerade att den kapslade RT-PCR effektivt kunde detektera virus i förskämda hjärn vävnader under minst 17 dagar efter nedbrytning, vilket är längre tid jämfört med endast 7 dagar av FAT och inte ens 1 dag av MIT. Detta resultat visar att kapslade RT-PCR är känsligare vid detektering av degraderade prover än FAT och MIT.
För att ytterligare validera den kapslade RT-PCR, 10 rabieslaboratorier i Kina uppmanades att genomföra tester på en uppsättning av prover. Av dessa tillhandahölls åtta laboratorier en uppsättning av 10 blindade djur hjärn vävnader från vårt laboratorium, inklusive RABV positiva och negativa prover. De andra två laboratorierna använde sina egna prover. Alla exemplar hade arkiverats och bekräftats av FAT tidigare. Alla 10 laboratorier erhållna resultat av kapslade RT-PCR i 100% enlighet med FAT, utan falskt negativ eller falskt positiva (tabell 8), vilket indikerar att den kapslade RT-PCR hade en hög specificitet och reproducerbarhet.
| Komponenter | Volym per reaktion (μL) |
| dNTPs (2,5 mM) | 4 |
| Slumpmässig primer (50 μM) | 1,5 |
| Oligo (dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| M-MLV-buffert (5x) | 4 |
| Omvänd transkriptas av M-MLV (200 IE/μL) | 1 |
| RNasin (40 IE/μL) | 1 |
| Total volym | 12 |
I tabell 1: Reagenser av omvänd transkription för cDNA-syntes .
| Komponenter | Volym per reaktion (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Taq buffert (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Total volym | 48 |
Tabell 2: Reagenser av att den första OMGÅNGEN PCR.
| Temperatur | Tid | Cykler |
| 94 ° c | 2 minuter | 1 |
| 94 ° c | 30 s | 35 |
| 56 ° c | 30 s | 35 |
| 72 ° c | 40 s | 35 |
| 72 ° c | 10 min | 1 |
| 4 ° c | ∞ |
I tabell 3: C ycling-parametrar för den första samt andra OMGÅNGEN PCR.
| Komponenter | Volym per reaktion (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Taq buffert (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Total volym | 48 |
I tabell 4: Reagenser av att den andra OMGÅNGEN PCR.
| Primer namn | Detaljer | Riktning | Sekvens (5 '-3 ') | Nukleotid position | Produktens storlek | |
| N127 | Den första omgången PCR | Framåt | ATGTAACNCCTCTACAATGG | -19 ~ 0 | 845bp | |
| N829 | Den första omgången PCR | Omvänd | Mer från GCCCTGGTTCGAACATTCT | 807 ~ 825 | 845bp | |
| N371F | Den andra omgången PCR | Framåt | Mer från ACAATGGAKKCTGACAARATTG | -6 ~ 15 | 371bp | |
| N371R | Den andra omgången PCR | Omvänd | CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC | 345 ~ 367 | 371bp | |
I tabell 5: Primer s equences av den första samt andra omgången PCR . Degenererade baser: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).
| Lyssavirus arter | Stam | Mallplasmid (molekyler/μL) |
| Mer från RABV | GQ 918139.1 | 2,24 x 101 |
| LBV | EU-293110.1 | 2,24 x 102 |
| Mer från MOKV | KF 155005.1 | 2,24 x 101 |
| Mer från DUVV | EU-293119.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-1 | EF 157976.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-2 | KF 155004.1 | 2,24 x 101 |
| ABLV | GU 992312.1 | 2,24 x 100 |
| IRKV och | NC_020809.1 | 2,24 x 101 |
| Mer från WCBV | NC_025377.1 | 2,24 x 101 |
| Mer från KHUV | NC_025385.1 | 2,24 x 103 |
| ARAV | NC_020808.1 | 2,24 x 102 |
| Mer från SHIBV | NC_025365.1 | 2,24 x 101 |
| BBLV | NC_025251.1 | 2,24 x 101 |
| IKOV | NC_018629.1 | 2,24 x 105 |
| Mer från LLEBV | NC_031955.1 | 2,24 x 103 |
| Mer från GBLV | NC_031988.1 | 2,24 x 105 |
| Mer från KBLV | MF 960865.1 | 2,24 x 101 |
| Mer från TWBLV | MF 472710.1 | 2,24 x 101 |
I tabell 6: Detektions gränsen för KAPSLAD RT-PCR o f 18 l yssavirus er.
| Standard metod och resultat | RT-nPCR- Positiva |
RT-nPCR- Negativa |
Korrelation (%) | |
| Fett | Positiva Negativa |
162 3 |
0 9459 |
99,07 |
I tabell 7: Sambandet mellan KAPSLAD RT-PCR och fat i den detektion av Rabv i kliniska prover.
Tabell 8: Validerings resultat av KAPSLADE RT-PCR genom 10 laboratorier.
Figur 1 : Detektering av 18 lyssavirus ar genom KAPSLADE RT-PCR. (A) resultatet av den första omgången PCR. (B) resultatet av den andra omgången PCR. M = DL 2000 DNA-markör. Kör fält 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV och TWBLV, respektive. Lane 19 = PCR-positiv kontroll; Lane 20 = negativ kontroll för den första omgången PCR; Lane 21 = negativ kontroll för den andra omgången PCR. Ett positivt PCR-resultat visar ett band vid 845 BP i den första omgången och 371 BP i den andra omgången PCR. Den amplikon av arav syns inte i den första omgången, men syns i den andra omgången PCR (Lane 8), medan amplikon av ikov är synlig i den första omgången, men inte synlig i den andra omgången PCR (Lane 9). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Jämförelse med primer sekvenser visar differential nukleotider i primer regioner 18 lyssavirus arter. N127 och N829 var yttre primers, N371F och N371R var inre primers. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För närvarande är RABV en stor lyssavirus som ansvarar för nästan alla människor och djur rabies i Kina, liksom i andra länder. Dessutom identifierades en IRKV-variant först från en Murina leucogaster bat i Jilin-provinsen i nordöstra Kina i 201210, och det har rapporter ATS orsaka en hunds död i Liaoning-provinsen i 201711. Senast, en roman lyssavirus, TWBLV, identifierades också från en japansk pipistrelle bat i Taiwan, Kina i 2017. Dessa resultat tyder på att den effektiva upptäckten av andra lyssaviruser är också viktigt för att förhindra spill-over av bat-burna Lyssavirusen. I detta avseende är Pan-lyssavirus kapslade RT-PCR inriktning den mest bevarade N gen regionen ett mycket användbart verktyg, och resultaten har visat att det effektivt kan upptäcka alla 16 ICTV-godkända och två nya lyssavirus arter identifierats hittills, inklusive genetiskt divergerande RABVs och IRKV i Kina (data på IRKV-stam som inte visas). Det är dock också intressant att notera att ARAV endast upptäcktes av den andra omgången PCR primers, medan IKOV upptäcktes endast av första omgången PCR primers (figur 1). För att undersöka orsaken till denna avvikelse, genomfördes sekvensjämförelse av alla 18 lyssaviruser inom de fyra primerområdena, med resultaten som visar att 3 ' End nukleotid t av yttre primer N829 i första omgången PCR och den andra nukleotid t vid 3 ' slutet av inre primer N371F i den andra omgången PCR var inte identiska med motsvarande positioner av ARAV (G) och IKOV (A) (figur 2). När T av primer N829 ändrades till G av ARAV och T av primer N371F ändrats till A av IKOV, båda virusen upptäcktes framgångs rikt i PCR (data visas inte). Detta resultat visar den kritiska roll som 3 ' End eller nära-end nukleotider av primers i den framgångs rika förstärkning av mål regionen.
För att utvärdera känsligheten och specificiteten hos metoden vid detektion av rabiesvirus för klinisk diagnostik och övervakning, testades 9 624 djur hjärn vävnads prov under de senaste 10 åren av FAT och nästlade RT-PCR parallellt. Av de 165 prover som testades rabies positivt av kapslade RT-PCR, 162 upptäcktes som positiva av FAT; Därför visar de två metoderna 99,07% i enlighet med detta. De rabv som upptäcktes i dessa 165 prover kunde delas in i olika linjer i asiatiska, arktiska-relaterade, och Cosmopolitan klader12,13, vilket tyder på att kapslade RT-PCR kan täcka olika genetiska klader av rabvs. Tre mycket skämda kliniska prover testades positivt av kapslade RT-PCR men negativt av fat. Detta resultat är förenligt med utvärderingen av effekten vid testning av två nedbrutna prover som visas i avsnittet representativa resultat, som visar att kapslade RT-PCR är känsligare än FAT vid detektion av virus i mycket förfallna prover.
Prestandan hos kapslade RT-PCR bekräftades ytterligare genom deltagandet i det internationella laboratorie jämförelse testet (ILCT) som anordnades av EU: s referenslaboratorium för rabies vid den franska myndigheten för livsmedels-, miljö-och arbets hälso & säkerhet ( Anses) i 2010, med hjälp av en uppsättning av 12 prover (en vardera av RABV, EBLV-1, EBLV-2, och ABLV som positiva kontroller, en negativ kontroll, och sju blindade prover). I testet identifierade kapslade RT-PCR framgångs rikt alla Lyssavirusen med en 100% konsistens. I 2018, metoden godkändes som en nationell standard för rabies diagnoser (GB/T36789-2018) av den nationella tekniska standardiserings kommittén för djur hälsa i Kina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av den nationella centrala forsknings-och utvecklings planen (Grant No. 2016YFD0500401) och Kinas nationella Naturvetenskaps stiftelse (Grant No. 31302043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
