Summary
Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.
Abstract
Pour détecter le virus de la rage et d’autres espèces membres du genre lyssavirus au sein de la famille des Rhabdoviridae, la réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-LYSSAVIRUS (RT-PCR imbriquée) a été développée pour détecter la région conservée du gène nucléoprotéique (N) des lyssavirus. La méthode applique la transcription inversée (RT) en utilisant l’ARN viral comme modèle et oligo (DT)15 et les hexamères aléatoires comme amorces pour synthétiser l’ADN complémentaire viral (CDNA). Ensuite, l’ADNc viral est utilisé comme un modèle pour amplifier un fragment de gène de BP N de 845 dans la PCR de première ronde utilisant des amorces externes, suivi par la PCR imbriquée de deuxième ronde pour amplifier le fragment final de BP de 371 utilisant des amorces internes. Cette méthode peut détecter différents clades génétiques des virus de la rage (RABV). La validation, en utilisant 9 624 échantillons de cerveau de huit espèces animales domestiques dans 10 ans de diagnostics cliniques de rage et de surveillance en Chine, a montré que la méthode a 100% de sensibilité et 99,97% de spécificité par rapport à la fluorescence directe test d’anticorps (FAT), la méthode étalon-or recommandée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE). En outre, la méthode pourrait également amplifier spécifiquement le fragment de gène N ciblé de 15 autres espèces de lyssavirus approuvées et deux nouvelles, dans le 10e rapport du Comité international sur la taxonomie des virus (ICTV), tel qu’évalué par une détection mimique de N plasmides génétiques de tous les lyssavirus. La méthode fournit une alternative pratique au FAT pour le diagnostic de la rage et a été approuvée en tant que norme nationale (GB/T36789) de la Chine.
Introduction
La rage est une maladie zoonotique mondiale causée par des virus dans le genre lyssavirus1. Les lyssavirus (famille Rhabdoviridae) sont des virus à ARN monocaténaires avec un génome d’environ 12 kb qui encode cinq protéines: N, phosphoprotéine (P), protéine matricielle (M), glycoprotéine (G), et la grande protéine ou polymérase (L). À partir des séquences nucléotidiques du gène N, de la distance génétique et des schémas antigéniques, les lyssavirus ont été divisés en 16 espèces, comprenant le virus de la rage classique (RABV) et les virus liés à la rage (RRV): le virus de la chauve-souris de Lagos (LBV), le virus Duvenhage (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), virus de la chauve-souris du Caucase occidental (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), et Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Récemment, deux lyssavirus supplémentaires ont été identifiés: kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolé de la chauve-souris de Brandt (Myotis murin) en Finlande en 20173 et Taiwan bat lyssavirus (twblv) isolé d’un Pipistrelle japonais ( Pipistrellus abramus) à Taiwan, Chine en 2016 – 20174.
Tous les mammifères sont sensibles à la rage; Cependant, aucune lésion pathognomonique brute ou aucun signe clinique spécifique ne permet son identification, et le diagnostic ne peut être effectué que dans le laboratoire5. La méthode la plus couramment utilisée pour le diagnostic de la rage est la graisse, qui est considérée comme la norme de l’or par l’OMS et l’OIE5,6. Néanmoins, le FAT peut produire des résultats peu fiables sur des échantillons de tissus cérébraux dégradés/autolysés. En outre, il ne peut pas être utilisé pour le dosage des échantillons de fluides biologiques tels que le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et l’urine, ce qui exclut largement son emploi dans le diagnostic antemortem7. Les tests diagnostiques conventionnels alternatifs, tels que le test d’infection de la culture tissulaire de la rage (RTCIT) et le test d’inoculation de la souris (MIT), nécessitent plusieurs jours6, un inconvénient majeur lorsqu’un diagnostic rapide est essentiel.
Divers tests de diagnostic moléculaire (p. ex., la détection de l’ARN viral par RT-PCR, le test d’immunosorbant PCR – enzyme-linked [PCR-ELISA], l’hybridation in situ et la PCR en temps réel) sont utilisés comme techniques rapides et sensibles pour le diagnostic de la rage8. La RT-PCR est maintenant recommandée par l’OIE pour le diagnostic de routine de la rage, et une PCR heminested (HN) est décrite dans le manuel des tests diagnostiques et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE pour détecter tous les lyssavirus5. Ici, nous décrivons un pan-lyssavirus imbriqué RT-PCR, qui permet la détection spécifique et sensible de l’ensemble des 18 espèces de lyssavirus comparables ou supérieures à celle obtenue par la graisse. Le principe de la méthode est un RT de l’ARN cible (région conservée du gène du lyssavirus N) dans l’ADNc, suivi de l’amplification de l’ADNc par deux cycles de PCR. L’ADNc subit la PCR de première ronde avec des amorces externes pour amplifier un fragment de BP de 845; Ensuite, la PCR de deuxième cycle utilise le premier produit d’ACP comme modèle pour amplifier un fragment de BP 371 avec des amorces internes. Les deux cycles de PCR augmentent significativement la sensibilité du dosage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L’utilisation de souris dans ce protocole a été approuvée par le Comité administratif sur le bien-être des animaux de l’Institut de médecine vétérinaire militaire, l’Académie des sciences médicales militaires, Chine (autorisation du Comité d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire, permis numéro JSY-DW-2010-02). Toutes les directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.
1. extraction d’ARN
- Extraire l’ARN des tissus cérébraux soupçonnés de rage, des biopsies cutanées, de la salive ou du LCR ou de la culture cellulaire infectée par le RABV, en utilisant des méthodes d’extraction à base d’isothiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium ou des kits d’extraction d’ARN viral disponibles dans le commerce. Utilisez l’ARN préparé immédiatement ou stockez-le à-80 ° c jusqu’à ce que nécessaire.
2. transcription inversée de l’ARN viral
- Retirez les réactifs RT énumérés dans le tableau 1 du congélateur, conservez-les sur la glace, puis Décongelez-les et vortex-les avant utilisation.
- Préparer 12 μL de mélange réactionnel RT dans un tube PCR de 0,2 mL avec les réactifs énumérés dans le tableau 1. Permettre des variations de pipetage en préparant un volume de mélange principal au moins une taille de réaction supérieure à la quantité requise.
- Ajouter 8 μL d’échantillon, d’ARN témoin positif ou de contrôle négatif au mélange de réaction RT dans une station de travail PCR dans une salle de modèle. Le contrôle positif RT est un ARN extrait de la culture cellulaire infectée par la souche fixe de RABV CVS-11 (Challenge virus standard-11) et stocké à-80 ° c. Le contrôle négatif contient la RNase-Free ddH2O.
- Mélanger le contenu des tubes RT par vortexing; puis, Centrifugez brièvement.
- Chargez les tubes de réaction dans un thermocycleur. Mettre en place le programme de synthèse du cDNA avec les conditions suivantes: 42 ° c pour 90 min, 95 ° c pendant 5 min et 4 ° c en attente. Réglez le volume de réaction à 20 μL. Démarrez la course RT.
3. PCR de première ronde
- Conserver les réactifs de PCR énumérés dans le tableau 2 sur la glace dans une salle blanche jusqu’à leur utilisation; puis les décongeler et les tourbillonner.
- Préparer le mélange PCR de première ronde dans un tube PCR de 0,2 mL avec les réactifs énumérés dans le tableau 2.
- Ajouter un échantillon de 2 μL d’ADNc ou de plasmide dans le mélange PCR de première ronde dans une station de travail PCR dans une pièce de gabarit. Le contrôle positif de la PCR est l’ADNc CVS-11 préparé comme mentionné à l’étape 2,3 pour la méthode RT ci-dessus. Le contrôle négatif PCR est FD2O.
- Transférer les tubes scellés à un thermocycleur PCR et à un cycle en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3.
4. PCR de deuxième cycle
- Préparer le mélange PCR de deuxième cycle dans un tube PCR de 0,2 mL à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4.
- Ajouter 2 μL de produit PCR de première ronde dans le mélange PCR de deuxième cycle. En outre, inclure ddH2O comme un contrôle négatif de la PCR de deuxième cycle.
- Effectuer le cycle thermique PCR en utilisant les mêmes paramètres que ceux donnés à l’étape 3,4.
5. analyse des produits PCR par électrophorèse sur gels d’agarose
- Préparez un gel d’d’agarose à 1,5% en ajoutant 1,5 g d’d’agarose à 100 mL de tris-acétate-EDTA (TAE) et en le dérésolvant à fond en le chauffant dans un four à micro-ondes.
- Ajouter le bromure d’éthidium (EB) (à une concentration finale de 0,01%) ou une autre substitution commerciale EB. Verser le gel dans le moule et le laisser solidifier à température ambiante pendant au moins 30 min.
- Préparez les échantillons de chargement en mélangeant 5 μL de chaque produit PCR avec 1 μL de tampon de chargement 6x.
- Chargez les échantillons et le marqueur d’ADN approprié séparément dans les puits et exécutez le gel pendant environ 30-45 min à 120 V jusqu’à ce que la ligne de colorant soit approximativement 75%-80% vers le bas du gel.
- Éteignez l’alimentation, débranchez les électrodes de la source d’alimentation, puis, retirez délicatement le gel de la boîte de gel.
- Utilisez un dispositif de documentation de gel UV pour visualiser et photographier les fragments d’ADN.
6. caractérisation de la RT-PCR imbriquée
-
6,1. spécificité et sensibilité pour la détection de 18 lyssavirus plasmides
- Commander 18 plasmides commerciaux contenant le gène N complet de chaque lyssavirus (16 espèces d’ICTV et deux espèces nouvelles) pour la PCR.
- Calculez le numéro de copie du plasmide à l’aide du numéro d’Avogadro (Na) et de la formule suivante.
[(g/μL d’ADN plasmidique)/(longueur du plasmide en BP x 660)] x 6,022 x 1023 = nombre de molécules/μl - Préparer des solutions de stock (2,24 x 109 molécules/μl) des 18 plasmides dans le ddH2O.
- Effectuer des dilutions sérielles de 9 10 de tous les 18 plasmides dans le ddH2o. Diluer 10 μl de chaque bouillon de plasmide avec 90 ΜL de FD2o. vortex et centrifuger brièvement.
- Effectuer l’amplification PCR comme décrit aux sections 3-5.
- Analysez la spécificité et la sensibilité de la PCR imbriquée en détectant une série de plasmides de lyssavirus.
-
Détermination du d détection l imit
- Ajuster le titre de la souche du virus de la rage CVS-11 culture cellulaire à 105,5 tcid50/ml (le titre du virus est déterminé selon le manuel de l’OIE)5.
- Effectuer des dilutions série 5 10 de CVS-11 (la solution de stock est 105,5 tcid50/ml) comme décrit à l’étape 6.1.4.
- Effectuer l’extraction de l’ARN et les procédures d’amplification RT-PCR imbriquées de toutes les dilutions virales, comme décrit dans les sections 1-5.
-
Le compar ison de le RT-PCR imbriquée avec le "Gold standard" Fat
- Testez tous les échantillons cliniques par RT-PCR imbriquée, puis confirmez les résultats avec le séquençage9du gène Fat5 et N.
- Utilisez les données normalisées pour une analyse statistique avec SAS 9,1. Utilisez le test Kappa et le test chi-squared de McNemar pour une comparaison statistique des tests diagnostiques (commande SAS: proc FREQ; table/agree). Calculez les intervalles de confiance en supposant une distribution abinomale.
-
Évaluation de l’efficacité dans le test des échantillons dégradés
- Exposer deux échantillons de tissu cérébral clinique confirmés de chiens enragés à 37 ° c.
- Dosage des deux échantillons chaque jour d’exposition à 37 ° c par RT-PCR imbriquée, le FAT et le MIT5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les résultats de la RT-PCR imbriquée pour détecter 18 espèces de lyssavirus sont présentés dans la figure 1. Tous les contrôles positifs de PCR ont montré les 845 BP attendus dans le premier et le 371 BP dans les amplifications de deuxième cycle sans bande dans le contrôle négatif. Tous les 18 lyssavirus ont produit les bandes de 845 et/ou de 371 BP attendues, ce qui indique que la RT-PCR imbriquée a détecté tous les 18 lyssavirus. Seize plasmides de lyssavirus avaient une amplification efficace dans deux cycles de PCR, mais deux, à savoir ARAV et IKOV, avaient une amplification dans la PCR de première ou deuxième ronde. La sensibilité de la méthode a varié dans la détection de différents plasmides de lyssavirus, avec des limites allant de 2,24 x 100 à 2,24 x 105 molécules/μl, comme indiqué dans le tableau 6. Ces différences peuvent être attribuées aux écarts entre les amorces et les modèles en raison de la diversité des séquences virales. De plus, la sensibilité de la détection du virus de la rage CVS-11 dans la culture cellulaire était de 102,5 tcid50/ml.
Un total de 9 624 tissus cérébraux provenant de spécimens cliniques ont été testés par RT-PCR imbriquée en comparaison avec le FAT et les résultats sont résumés dans le tableau 7, qui montre que la RT-PCR imbriquée avait une sensibilité de 100% (ic, 97,75% à 100%) et une spécificité de 99,97% (IC, 99,91% à 99,99%). La conformité entre les deux méthodes était de 99,07%. Trois tests positifs par la RT-PCR imbriquée, mais négatifs par le FAT, étaient des matériaux cliniques fortement délisés. Ces trois spécimens ont été confirmés en tant que RABV positif par séquençage du gène N.
La comparaison de la performance d’essai dans la détection des deux échantillons de cerveau incubés à 37 ° c (étape 6.4.1 du protocole) a indiqué que la RT-PCR imbriquée pourrait détecter efficacement le virus dans les tissus du cerveau en décomposition pendant moins de 17 jours après la dégradation, ce qui est pour un plus longue période de temps par rapport à seulement 7 jours par le FAT et pas même 1 jour par le MIT. Ce résultat montre que la RT-PCR imbriquée est plus sensible dans la détection des échantillons dégradés que le FAT et le MIT.
Pour valider davantage la RT-PCR imbriquée, 10 laboratoires de la rage en Chine ont été invités à effectuer des tests sur un ensemble de spécimens. Parmi ceux-ci, huit laboratoires ont été fournis un ensemble de 10 tissus de cerveau animal aveuglé de notre laboratoire, y compris les spécimens positifs et négatifs du RABV. Les deux autres laboratoires utilisaient leurs propres spécimens. Tous les spécimens avaient été archivés et confirmés par le FAT précédemment. Les 10 laboratoires ont obtenu des résultats par RT-PCR imbriqué en 100% selon le FAT, sans faux-négatifs ou faux-positifs (tableau 8), ce qui indique que la RT-PCR imbriquée a une spécificité et une reproductibilité élevées.
| Composants | Volume par réaction (μL) |
| dNTPs (2,5 mM) | 4 |
| Amorce aléatoire (50 μM) | 1,5 |
| Oligo (dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| Tampon M-MLV (5x) | 4 |
| Transcriptase inverse M-MLV (200 UI/μL) | 1 |
| RNasin (40 UI/μL) | 1 |
| Volume total | 12 |
Tableau 1: Réactifs de transcription inversée pour la synthèse d’ADNc .
| Composants | Volume par réaction (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampon Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Volume total | 48 |
Tableau 2: Réactifs de la PCR de première ronde.
| température | temps | Cycles |
| 94 ° c | 2 min | 1 |
| 94 ° c | 30 s | 35 |
| 56 ° c | 30 s | 35 |
| 72 ° c | 40 s | 35 |
| 72 ° c | 1, 5 min | 1 |
| à 4 ° c | ∞ |
Tableau 3: C paramètres de la première et PCR de deuxième cycle.
| Composants | Volume par réaction (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampon Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Volume total | 48 |
Tableau 4: Réactifs de la PCR de deuxième cycle.
| Nom de l’amorce | Détails | direction | Séquence (5 '-3 ') | Position des nucléotides | Taille du produit | |
| N127 | La première PCR ronde | en avant | (Le PATEGE) | -19 ~ 0 | le 845bp | |
| N829 | La première PCR ronde | revenir sur | GCCCTGGTTCGAACATTCT | 807 ~ 825 | le 845bp | |
| N371F | La deuxième PCR ronde | en avant | (La guelle) | -6 ~ 15 | le 371BP | |
| N371R | La deuxième PCR ronde | revenir sur | Le CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC | 345 ~ 367 | le 371BP | |
Tableau 5: Primer s equences de la première et deuxième tour PCR . Bases dégénérées: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).
| Espèces de lyssavirus | tension | Plasmide de gabarit (molécules/μL) |
| VIRUS RABIQUE | GQ 918139.1 | 2,24 x 101 |
| Lbv | 293110.1 de l’UE | 2,24 x 102 |
| Le MOKV | 155005.1 KF | 2,24 x 101 |
| Le DUVV | 293119.1 de l’UE | 2,24 x 101 |
| EBLV-1 | 157976.1 EF | 2,24 x 101 |
| EBLV-2 | 155004.1 KF | 2,24 x 101 |
| ABLV | 992312.1 GU | 2,24 x 100 |
| L’IRKV | NC_020809.1 | 2,24 x 101 |
| WCBV | NC_025377.1 | 2,24 x 101 |
| Le KHUV | NC_025385.1 | 2,24 x 103 |
| Arav | NC_020808.1 | 2,24 x 102 |
| Le SHIBV | NC_025365.1 | 2,24 x 101 |
| BBLV | NC_025251.1 | 2,24 x 101 |
| IKOV | NC_018629.1 | 2,24 x 105 |
| De la LLEBV | NC_031955.1 | 2,24 x 103 |
| Le GBLV | NC_031988.1 | 2,24 x 105 |
| KBLV | 960865.1 MF | 2,24 x 101 |
| Le TWBLV | 472710.1 MF | 2,24 x 101 |
Tableau 6: Limite de détection de RT-PCR imbriquée o f 18 l yssavirus es.
| Méthode et résultat standard | RT-nPCR positif |
RT-nPCR négative |
Corrélation (%) | |
| ce serait étonnant | positif négative |
162 3 |
0 9459 |
99,07 |
Tableau 7: Corrélation entre RT-PCR imbriquée et le FAT dans le détection de RABVs dans des spécimens cliniques.
Tableau 8: Résultats de validation du RT-PCR imbriqué par 10 laboratoires.
Figure 1 : Détection de 18 lyssavirus es par RT-PCR imbriquée. (A) le résultat de la PCR du premier tour. B) le résultat de la PCR de deuxième cycle. M = DL 2000 marqueur ADN. Voies 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, et TWBLV, respectivement. Voie 19 = contrôle positif de la PCR; voie 20 = contrôle négatif pour la PCR de première ronde; Lane 21 = contrôle négatif pour la PCR de deuxième cycle. Un résultat positif de PCR montre une bande à 845 BP au premier tour et 371 BP dans le deuxième tour PCR. L’amplicon de l’ARAV n’est pas visible au premier tour, mais visible dans la deuxième ronde PCR (voie 8), tandis que l’amplicon de l’IKOV est visible au premier tour, mais pas visible dans la deuxième ronde PCR (voie 9). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : La comparaison avec les séquences d’amorce montre les nucléotides différentiels dans les régions d’amorce de 18 espèces de lyssavirus. N127 et n829 étaient des amorces externes, N371F et N371R étaient des amorces internes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Actuellement, le RABV est un lyssavirus majeur responsable de la quasi-totalité de la rage humaine et animale en Chine, ainsi que dans d’autres pays. En outre, une variante de l’IRKV a été identifiée pour la première fois à partir d’une chauve-sourisurina leucogaster de Mdans la province de Jilin, dans le nord-est de la Chine, en 2012, et il a été rapporté que la mort d’un chien dans la province du Liaoning était de 201711. Plus récemment, un nouveau lyssavirus, TWBLV, a également été identifié à partir d’une chauve-souris japonaise Pipistrelle à Taiwan, en Chine, en 2017. Ces résultats suggèrent que la détection efficace d’autres lyssavirus est également importante pour prévenir le déversement des lyssavirus portés par les chauves-souris. À cet égard, la RT-PCR imbriquée de Pan-lyssavirus ciblant la région du gène N la plus conservée est un outil très utile, et les résultats ont montré qu’il peut détecter efficacement les 16 espèces de lyssavirus approuvées par l’ICTV et les deux nouveaux qui ont été identifiés jusqu’à présent, y compris les RABVs génétiquement divergents et l’IRKV en Chine (données sur la souche IRKV non montrée). Cependant, il est également intéressant de noter que l’ARAV n’a été détecté que par les amorces de PCR de deuxième cycle, alors que l’IKOV n’a été détecté que par des amorces PCR de première ronde (figure 1). Pour étudier la cause de cet écart, on a procédé à une comparaison des séquences de tous les 18 lyssavirus dans les quatre régions d’amorce, avec les résultats montrant que le nucléotide T de 3 'd’extrémité de l’amorce externe n829 dans la PCR de première ronde et le deuxième nucléotide T à la 3 ' la fin de l’amorce interne N371F dans la PCR de deuxième cycle n’étaient pas identiques aux positions correspondantes de l’ARAV (G) et de l’IKOV (A) (figure 2). Une fois que le T de l’apprêt n829 a été changé en G d’ARAV et que le T d’apprêt N371F a été modifié en A de IKOV, les deux virus ont été détectés avec succès dans la PCR (données non affichées). Ce résultat démontre le rôle crucial des nucléotides de l’extrémité ou de l’extrémité de 3 'des amorces dans l’amplification réussie de la région cible.
Pour évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode dans la détection du virus de la rage pour le diagnostic et la surveillance cliniques, 9 624 échantillons de tissus cérébraux animaux ont été testés au cours des 10 dernières années par la FAT et la RT-PCR imbriquée en parallèle. Des échantillons 165 qui ont testé la rage positive par RT-PCR imbriquée, 162 ont été détectés comme positifs par le FAT; par conséquent, les deux méthodes montrent 99,07% de conformité. Les rabv détectés dans ces 165 échantillons pourraient être classés en lignées différentes dans les clades de l’Asie, de l’Arctique et du cosmopolitain12,13, ce qui indique que la RT-PCR imbriquée peut couvrir les divers clades génétiques des rabvs. Trois spécimens cliniques fortement délisés ont été testés positifs par RT-PCR imbriquée mais négatifs par le FAT. Ce résultat est cohérent avec l’évaluation de l’efficacité dans le test de deux échantillons dégradés, comme indiqué dans la section des résultats représentatifs, indiquant que la RT-PCR imbriquée est plus sensible que la FAT dans la détection des virus dans les spécimens fortement dégraissés.
La performance de la RT-PCR imbriquée a été confirmée par la participation à l’essai international de comparaison de laboratoire (ILCT) organisé par le laboratoire de référence de l’UE pour la rage à l’Agence Français pour l’alimentation, l’environnement et la santé au travail & sécurité ( ANSES) en 2010, en utilisant un ensemble de 12 échantillons (un chacun de RABV, EBLV-1, EBLV-2, et ABLV comme témoins positifs, un contrôle négatif, et sept échantillons aveuglés). Dans le test, la RT-PCR imbriquée a réussi à identifier tous les lyssavirus avec une consistance de 100%. En 2018, la méthode a été approuvée en tant que norme nationale de diagnostic de la rage (GB/T36789) par le Comité national de normalisation technique de la santé animale de la Chine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été appuyée par le plan national de recherche et de développement (Grant no 2016YFD0500401) et la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (Grant No. 31302043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
