Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله للكشف عن جميع الفيروسات المعروفة علي وجه التحديد. وأظهرت المصادقة باستخدام عينات الدماغ من داء المخ للأنواع الحيوانية المختلفة ان هذه الطريقة لها حساسية وخصوصية مكافئه لاختبار الأجسام المضادة الفلورية القياسية الذهبية ويمكن استخدامها للتشخيص الروتيني لداء البشر.

Abstract

للكشف عن فيروس داء البشر والأنواع الأخرى من الأعضاء من جنس lyssavirus داخل الاسره Rhabdoviridae, وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله (المتداخلة RT-PCR) للكشف عن المنطقة المحفوظة من الجينات النونوبروتين (N) من الليسيفيروسات. ويطبق الأسلوب النسخ العكسي (RT) باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي كقالب و اليغو (dT)15 و hexamers عشوائية كما الإشعال لتوليف الفيروسية المتكاملة DNA (cdna). ثم ، يتم استخدام cDNA الفيروسية كقالب لتضخيم 845 bp N الجينات جزء في PCR الجولة الاولي باستخدام الإشعال الخارجي ، تليها الجولة الثانية PCR المتداخلة لتضخيم النهائية 371 bp جزء باستخدام الإشعال الداخلية. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن الشقوق الوراثية المختلفة من فيروسات داء القد (RABV). وأظهرت المصادقة ، باستخدام عينات الدماغ 9,624 من ثمانيه أنواع الحيوانية المحلية في 10 سنوات من تشخيص داء البشر السريرية والمراقبة في الصين ، ان الطريقة لديها 100 ٪ حساسية و 99.97 ٪ خصوصية بالمقارنة مع الفلورسنت المباشر اختبار الأجسام المضادة (FAT) ، وهي الطريقة القياسية الذهبية التي أوصت بها منظمه الصحة العالمية والمنظمة العالمية لصحة الماشية. الاضافه إلى ذلك ، فان الطريقة يمكن أيضا تضخيم علي وجه التحديد جزء الجينات N المستهدفة من 15 الأخرى المعتمدة واثنين من الأنواع lyssavirus الرواية في التقرير العاشر للجنة الدولية لتصنيف الفيروسات (ICTV) كما تم تقييمها من قبل الكشف عن تقليد توليف N مورثه البلازميدات من كل [ليسسفيروس]. يوفر الأسلوب بديلا مناسبا للدهون لتشخيص داء السرطان وقد تمت الموافقة عليه كمعيار وطني (GB/T36789) من الصين.

Introduction

داء الإنفلونزا هو مرض حيواني في جميع انحاء العالم تسببه الفيروسات داخل جنس Lyssavirus1. Lyssavirusesات (الاسره Rhabdoviridae) هي واحده سالبه-التي تقطعت بهم السبل الفيروسات RNA مع ما يقرب من 12 كيلو بايت الجينوم ان ترميز خمسه بروتينات: N, فوسفوبروتين (P), مصفوفة البروتين (M), بروتين سكري (G), والبروتين الكبير أو البوليميريز (L). استنادا إلى متواليات النيوكليوتيد من جين N ، والمسافة الجينية ، وأنماط انتيغينيك ، وقد تم تقسيم الفيروسات إلى 16 نوعا ، والتي تتالف من فيروس الداء الكلاسيكي (RABV) والفيروسات المرتبطة بداء البشر (RRV): فيروس الخفافيش لاغوس (LBV) ، وفيروس Duvenhage ), [موتولا] حمي ([موكف]), اوروبيه خفاش [ليسسفيروس] 1 ([ايبلف-1]), الاوروبيه الخفافيش lyssavirus 2 (EBLV-2), الاستراليه الخفافيش lyssavirus (ABLV), الفيروس Aravan (ARAVAN), فيروس Ikoma (IKOV), Bokeloh بات lyssavirus (BBLV), Gannoruwa بات lyssavirus (GBLV), Irkut الفيروسات (IRKUT), [خوجند] حمي ([خوف]), غربيه قوقازية خفاش حمي ([وكبف]), [شيموني] خفاش حمي ([شبف]), و [ليدا] خفاش [ليسسفيروس] ([ليبف])2. وفي الاونه الاخيره ، تم التعرف علي فيروسين إضافيين هما: كوتالاهتي بات ليسسوفيروس (KBLV) معزولة عن مضرب براندت (MyotisBrandistti) في فنلندا في 20173 وتايوان الخفافيش LYSSAVIRUSES (twblv) معزولة عن بييستوريل اليابانية ( Pipistrellus ابراكوس) في تايوان ، الصين في 2016-20174.

جميع الثدييات عرضه لداء المرض. ومع ذلك ، لا آلافات المرضية الاجماليه أو العلامات السريرية المحددة تسمح بتحديدها ، ويمكن اجراء التشخيص فقط في المختبر5. الأسلوب الأكثر استخداما لتشخيص داء السرطان هو الدهون ، والتي تعتبر معيار الذهب من قبل كل من منظمه الصحة الرسمية و5،6. ومع ذلك ، يمكن ان تنتج FAT نتائج غير موثوق بها علي عينات الانسجه الدماغية المتدهورة/الاوتوزيد. بالاضافه إلى ذلك ، فانه لا يمكن استخدامها لفحص عينات السوائل البيولوجية مثل السائل الدماغي الشوكي ، واللعاب ، والبول ، التالي إلى حد كبير الحيلولة دون توظيفها في التشخيص قبل وفات7. الاختبارات التشخيصية التقليدية البديلة ، مثل اختبار العدوى الثقافة الانسجه داء الجلد (رتجيت) واختبار التلقيح الماوس (MIT) ، تتطلب عده أيام6، وهو العيب الرئيسي عندما التشخيص السريع أمر ضروري.

الاختبارات التشخيصية الجزيئية المختلفة (علي سبيل المثال ، الكشف عن الحمض الريبي الفيروسي عن طريق RT-PCR ، الفحص المناعي المرتبط بالانزيم PCR [PCR-ELISA] ، في التهجين الموضعي ، وفي الوقت الحقيقي PCR) تستخدم كتقنيات سريعة وحساسة لتشخيص داء السرطان8. ويوصي الآن RT-PCR من قبل المعهد البيطري لتشخيص داء السرطان الروتيني ، ويوصف PCR (hn) في دليل الاختبارات التشخيصية واللقاحات للحيوانات البرية للكشف عن جميع الفيروسات المضادة للفيروسات5. هنا نحن وصف لعموم lyssavirus المتداخلة RT-PCR ، الذي يسمح الكشف المحددة والحساسة لجميع أنواع الفيروسات الثمانية عشره مقارنه أو تتجاوز التي حصلت عليها FAT. المبدا من الأسلوب [رت] من الهدف [رنا] (يحفظ منطقه من ال [ليسسفيروس] ن مورثه) داخل [كدنا], يتبع بالتضخيم من ال [كدنا] باثنان جولات [بكر]. يخضع cDNA الجولة الاولي PCR مع الإشعال الخارجي لتضخيم جزء bp 845; ثم ، يستخدم PCR الجولة الثانية المنتج PCR الجولة الاولي كقالب لتضخيم جزء bp 371 مع الإشعال الداخلية. الطلقتين من PCR زيادة كبيره في حساسية الفحص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة علي استخدام الفئران في هذا البروتوكول من قبل اللجنة الاداريه لرعاية الماشية التابعة لمعهد الطب البيطري العسكري ، واكاديميه العلوم الطبية العسكرية ، والصين (ترخيص لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المختبري ، والسماح عدد JSY-DW-2010-02). واتبعت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية.

1. استخراج RNA

  1. استخراج الحمض الريبي النيبالي من الدماغ-يشتبه في انسجه المخ, الخزعات الجلد, اللعاب, أو السائل الدماغي الشوكي أو من الخلايا المصابة RABV الثقافة, باستخدام guanidinium ايزوثيسيانات-الفينول-كلوروفورم-القائم علي طرق الاستخراج أو الفيروسية المتاحة تجاريا مجموعات استخراج. استخدام الجيش الريبي النيبالي استعداد علي الفور أو تخزينه في-80 درجه مئوية حتى المطلوبة.

2. عكس النسخ من RNA الفيروسية

  1. أزاله الكواشف RT المدرجة في الجدول 1 من الفريزر ، والاحتفاظ بها علي الجليد ، وذوبان والدوامة لهم قبل الاستخدام.
  2. اعداد 12 μL من مزيج رد فعل RT في أنبوب PCR 0.2 mL مع الكواشف المدرجة في الجدول 1. السماح بالتغييرات التي يتم وضعها بالأنابيب من خلال اعداد حجم المزج الرئيسي بحجم تفاعل واحد علي الأقل أكبر من المطلوب.
  3. أضافه 8 μL عينه ، السيطرة الايجابيه RNA أو السيطرة السلبية لمزيج رد فعل RT داخل محطه عمل PCR في غرفه قالب. ال [رت] تحكم ايجابيه [رنا] يستخرج من الخلية ثقافة يعدي مع ثابته [ربف] سلاله سيره ذاتية-11 (تحدي حمي معيار-11) ويخزن في-80 [ك.]. السيطرة السلبية يحتوي علي RNase خاليه ddH2س.
  4. خلط محتويات أنابيب RT بواسطة vortexing; ثم ، الطرد المركزي لفتره وجيزة.
  5. حمل أنابيب التفاعل إلى التدوير الحراري. اعداد برنامج التوليف cDNA مع الشروط التالية: 42 درجه مئوية ل 90 دقيقه ، 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، و 4 درجه مئوية علي الانتظار. تعيين حجم رد الفعل إلى 20 μL. بدء تشغيل RT.

3-الجولة الاولي من PCR

  1. الحفاظ علي الكواشف PCR المدرجة في الجدول 2 علي الجليد في غرفه نظيفه حتى استخدام; ثم ، ذوبان والدوامة لهم.
  2. اعداد مزيج PCR الجولة الاولي في أنبوب PCR 0.2 mL مع الكواشف المدرجة في الجدول 2.
  3. أضافه 2 μl عينه من cdna أو البلازميد في مزيج pcr الجولة الاولي داخل محطه عمل pcr في غرفه قالب. السيطرة الايجابيه PCR هو السيرة الذاتية-11 cDNA أعدت علي النحو المذكور في الخطوة 2.3 لأسلوب RT أعلاه. السيطرة السلبية PCR هو ddH2O.
  4. نقل أنابيب مختومه إلى الدورية الحرارية PCR ودوره باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 3.

4-الجولة الثانية PCR

  1. اعداد مزيج PCR الجولة الثانية في أنبوب PCR 0.2 mL باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 4.
  2. أضافه 2 μL من المنتج PCR الجولة الاولي في مزيج PCR الجولة الثانية. الاضافه إلى ذلك ، وتشمل ddH2O كعنصر تحكم سلبي من PCR الجولة الثانية.
  3. أداء الدراجات الحرارية PCR باستخدام نفس المعلمات كما هو معطي في الخطوة 3.4.

5. تحليل المنتجات PCR من قبل الكهربائي علي اجبرز الهلام

  1. اعداد هلام الاغاروز 1.5 ٪ عن طريق أضافه 1.5 غرام من اجنشا إلى 100 مل من تريس-خلات-أدتا (تاي) وحلها بدقه عن طريق تسخينه في فرن الميكروويف.
  2. أضافه بروميد ايثيديوم (EB) (بتركيز نهائي 0.01%) أو بديل آخر للمجلس التنفيذي التجاري. اسكبي الجل في القالب واتركيه ليصلب عند درجه الحرارة المحيطة لمده 30 دقيقه علي الأقل.
  3. اعداد عينات التحميل عن طريق خلط 5 μL من كل منتج PCR مع 1 μL من 6x المخزن المؤقت التحميل.
  4. تحميل العينات ومناسبه الحمض النووي علامة علي حده في الآبار وتشغيل هلام لحوالي 30-45 دقيقه في 120 V حتى خط صبغ ما يقرب من 75 ٪-80 ٪ أسفل الهلام.
  5. إيقاف الطاقة ، وقطع الأقطاب الكهربائية من مصدر الطاقة ، ومن ثم ، بعناية أزاله هلام من مربع هلام.
  6. استخدام هلام الاشعه فوق البنفسجية توثيق الجهاز لتصور وتصوير شظايا الحمض النووي.

6. توصيف المتداخلة RT-PCR

  1. 6.1 الخصوصية والحساسية للكشف عن 18 lyssaviruses
    1. النظام 18 البلازميدات التجارية التي تحتوي علي جين كامل من كل lyssavirus (16 الأنواع ICTV واثنين من الأنواع الجديدة) لل PCR.
    2. حساب رقم النسخة من البلازميد باستخدام رقم avogadro (NA) والصيغة التالية.
      [(g/μl البلازميد الحمض النووي)/(بلازميد طول في bp x 660)] × 6.022 × 1023 = عدد الجزيئات/μl
    3. اعداد حلول الأسهم (2.24 × 109 جزيئات/μl) من جميع البلازميدات 18 في ddh2O.
    4. أداء البلازميدات التسلسلي اضعاف 9 10 كل 18 في ddh2س. تمييع 10 μl من كل الأسهم البلازميد مع 90 μl من ddh2س. دوامه والطرد المركزي لفتره وجيزة.
    5. اجراء تضخيم PCR كما هو موضح في الأقسام 3-5.
    6. تحليل خصوصية وحساسية PCR المتداخلة عن طريق الكشف عن سلسله من البلازميدات lyssavirus.
  2. تحديد الرتبة د ايكتيون ل نهائي
    1. ضبط عيار من سلاله فيروس داء السل السيرة الذاتية-11 خليه ثقافة إلى 105.5 tcid50/ml (فيروس عيار تحدد وفقا لدليل التربية الحيوانية)5.
    2. أداء التخفيفات التسلسلية 5 10 اضعاف من CVS-11 (الحل الأسهم هو 105.5 tcid50/ml) كما هو موضح في الخطوة 6.1.4.
    3. اجراء استخراج RNA والمتداخلة RT-PCR إجراءات التضخيم لجميع التخفيفات الفيروسية كما هو موضح في الأقسام 1-5.
  3. يقارن ison من ال المتداخلة RT-PCR مع "معيار الذهب" الدهون
    1. اختبار جميع العينات السريرية المتداخلة RT-PCR ، ومن ثم ، تاكيد النتائج مع FAT5 و N التسلسل الجيني9.
    2. استخدم البيانات التي تم تطبيعها للتحليل الإحصائي مع SAS 9.1. استخدم اختبار كابا واختبار التربيع التربيعي ل McNemar للمقارنة الاحصائيه للاختبارات التشخيصية (الأمر SAS: proc freq; الجدول/الموافقة). حساب الفواصل الزمنيه للثقة علي افتراض التوزيع السري.
  4. تقييم الفعالية في اختبار العينات المتدهورة
    1. كشف اثنين من العينات السريرية الدماغ المؤكدة من النقانق المسعورة في 37 درجه مئوية.
    2. فحص عينات اثنين في كل يوم من التعرض في 37 درجه مئوية من قبل المتداخلة RT-PCR ، والدهون ، ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وترد نتائج المتداخلة RT-PCR للكشف عن 18 أنواع lyssavirus في الشكل 1. وأظهرت جميع الضوابط الايجابيه PCR 845 bp المتوقع في الأول-و 371 bp في التكبير الجولة الثانية مع عدم وجود فرقه في السيطرة السلبية. جميع الفيروسات 18 أنتجت المتوقع 845 و/أو العصابات bp 371 ، مشيرا إلى ان المتداخلة RT-PCR الكشف عن جميع الفيروسات 18. وكان سته عشر الفيروسات lyssaviruses التضخيم كفاءه في جولتين من PCR, ولكن اثنين, وهما ARAV و IKOV, وكان التضخيم في اما الاولي أو الثانية الجولة PCR. وتباينت حساسية الأسلوب في الكشف عن البلازميدات الفيروسات المختلفة ، مع حدود تتراوح بين 2.24 × 100 إلى 2.24 × 105 جزيئات/μl ، كما هو مبين في الجدول 6. ويمكن عزو هذه الاختلافات إلى أوجه التفاوت بين الإشعال والقوالب بسبب تنوع التسلسل الفيروسي. وعلاوة علي ذلك ، فان حساسية الكشف عن فيروس داء السل السيرة الذاتية-11 في ثقافة الخلية كان 102.5 tcid50/ml.

وقد تم اختبار ما مجموعه 9,624 انسجه المخ من العينات السريرية من قبل المتداخلة RT-PCR بالمقارنة مع FAT ويتم تلخيص النتائج في الجدول 7، مما يدل علي ان المتداخلة RT-pcr كان 100 ٪ حساسية (CI ، 97.75 ٪ إلى 100 ٪) وخصوصية 99.97 ٪ (CI ، 99.91 ٪ إلى 99.99 ٪). وكان التوافق بين الطريقتين 99.07 في المائة. كانت ثلاثه الاختبارات التي كانت ايجابيه من قبل المتداخلة RT-PCR ولكن السلبية من الدهون من المواد السريرية التهاوي للغاية. أكدت هذا ثلاثه عينات ك [ربف] ايجابيه ب ن مورثه تسلسل.

وأشارت مقارنه أداء الاختبار في الكشف عن عينات الدماغ اثنين المحتضنة في 37 درجه مئوية (الخطوة 6.4.1 من البروتوكول) ان المتداخلة RT-PCR يمكن الكشف عن الفيروس بشكل فعال في انسجه المخ التهاوي لمده 17 يوما علي الأقل بعد التحلل ، وهو فتره أطول من الوقت بالمقارنة مع فقط 7 أيام من قبل الدهون وليس حتى 1 يوم من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. تظهر هذه النتيجة ان المتداخلة RT-PCR أكثر حساسية في الكشف عن العينات المتدهورة من FAT و MIT.

ولزيادة التحقق من صحة المجموعة المتداخلة ، دعيت 10 مختبرات لداء المرض في الصين إلى اجراء الاختبارات علي العينات. ومن بين هذه المختبرات ، تم تزويد ثمانيه معامل بمجموعه من 10 انسجه من المخ الحيواني الأعمى من مختبرنا ، بما في ذلك العينات الايجابيه والسلبية من RABV. المختبرين الآخرين استخدما عيناتهما الخاصة. وقد تم حفظ جميع العينات وتاكيدها من قبل FAT سابقا. جميع المختبرات 10 الحصول علي نتائج من قبل المتداخلة RT-PCR في 100 ٪ وفقا لل FAT ، مع عدم وجود السلبيات كاذبه أو كاذبه-إيجابيات (الجدول 8) ، مشيرا إلى ان المتداخلة RT-pcr كان لها خصوصية عاليه و استنساخ.

مكونات حجم لكل رد فعل (μL)
dNTPs (2.5 mM) 4
التمهيدي عشوائي (50 μM) 1.5
Oligo (dT) 15 (50 μM) 0.5
M-MLV العازلة (5x) 4
M-MLV النسخ العكسي (200 وحده دوليه/μL) 1
RNasin (40 وحده دوليه/μL) 1
الحجم الإجمالي 12

الجدول 1: الكواشف من النسخ العكسي لتوليف cDNA .

مكونات حجم لكل رد فعل (μL)
dNTPs (10 ملم) 1
السابقة (5 U/μL) 0.3
العازلة المؤقتة (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
dd H2O 39.7
الحجم الإجمالي 48

الجدول 2: الكواشف من ال الجولة الاولي PCR.

درجه الحراره الوقت دورات
94 درجه مئوية 2 دقيقه 1
94 درجه مئوية 30 ثانيه 35
56 درجه مئوية 30 ثانيه 35
72 درجه مئوية 40 s 35
72 درجه مئوية 10 دقائق 1
4 درجه مئوية

الجدول 3: ج المعلمات ycling من الأول و الجولة الثانية PCR.

مكونات حجم لكل رد فعل (μL)
dNTPs (10 ملم) 1
السابقة (5 U/μL) 0.3
العازلة المؤقتة (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
dd H2O 39.7
الحجم الإجمالي 48

الجدول 4: الكواشف من ال الجولة الثانية PCR.

اسم التمهيدي التفاصيل الاتجاه تسلسل (5 '-3 ') موقف النوكليوتيد حجم المنتج
N127 الجولة الاولي PCR الي الامام في الانجليزيه -19 ~ 0 845bp
N829 الجولة الاولي PCR عكس في الانجليزيه 807 ~ 825 845bp
N371F الجولة الثانية PCR الي الامام الحب والعطاء -6 ~ 15 371bp
N371R الجولة الثانية PCR عكس الصندوق الاستئماني للتدريب المهني 345 ~ 367 371bp

الجدول 5: التمهيدي s التعادل من الأول و الجولة الثانية PCR . القواعد المنحطة: N (A/T/C/G) ، K (G/T) ، R (A/G) ، Y (C/T) ، WV (G/A/C).

أنواع الليسفيروس سلاله قالب البلازميد (جزيئات/μl)
RABV GQ 918139.1 2.24 x 101
LBV الاتحاد الأوروبي 293110.1 2.24 x 102
MOKV KF 155005.1 2.24 x 101
DUVV الاتحاد الأوروبي 293119.1 2.24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2.24 x 101
EBLV-2 KF 155004.1 2.24 x 101
ABLV GU 992312.1 2.24 x 100
IRKV NC_ 020809.1 2.24 x 101
WCBV NC_ 025377.1 2.24 x 101
في الخامسة NC_ 025385.1 2.24 x 103
ARAV NC_ 020808.1 2.24 x 102
شبف NC_ 025365.1 2.24 x 101
BBLV NC_ 025251.1 2.24 x 101
IKOV NC_ 018629.1 2.24 x 105
في الآن NC_ 031955.1 2.24 x 103
GBLV NC_ 031988.1 2.24 x 105
KBLV MF 960865.1 2.24 x 101
TWBLV MF 472710.1 2.24 x 101

الجدول 6: حد الكشف عن المتداخلة RT-PCR س f 18 l yssavirus es.

الطريقة القياسية والنتيجة [رت-نبكر]
ايجابيه
[رت-نبكر]
السلبيه
الارتباط (%)
الدهون ايجابيه
السلبيه
162
3
0
9459
99.07

الجدول 7: ارتباط بين المتداخلة RT-PCR والدهون في ال الكشف عن RABVs في العينات السريرية.

Table 8
الجدول 8: نتائج التحقق من الصحة المتداخلة RT-PCR بواسطة 10 مختبرات.

Figure 1
الشكل 1 : الكشف عن 18 lyssavirus es بواسطة المتداخلة RT-PCR. (ا) نتيجة الجولة الاولي من PCR. (ب) نتيجة الجولة الثانية من PCR. M = DL 2000 الحمض النووي علامة. الممرات 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LBV, شبف, WCBV, KBLV, و TWBLV, علي التوالي. حاره 19 = [بكر] تحكم ايجابيه; لين 20 = السيطرة السلبية لل PCR الجولة الاولي ؛ لين 21 = السيطرة السلبية للجولة الثانية PCR. نتيجة ايجابيه PCR يظهر الفرقة في 845 bp في الجولة الاولي و 371 bp في PCR الجولة الثانية. ولا يظهر الرمز البارز لل ARAV في الجولة الاولي ، ولكنه مرئي في الجولة الثانية من PCR (حاره 8) ، في حين ان الرمز البارز لل IKOV مرئي في الجولة الاولي ، ولكنه غير ظاهر في الجولة الثانية من PCR (حاره 9). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 : المقارنة مع متواليات التمهيدي يظهر النيوبوتيديس التفاضلية في المناطق التمهيدي من 18 أنواع الليسوفيروس. N127 و N829 كانت الإشعال الخارجي ، N371F و N371R كانت الإشعال الداخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وفي الوقت الراهن ، فان الشركة هي أحد الفيروسات الرئيسية المسؤولة عن تقريبا كل داء البشر والحيوانية في الصين ، وكذلك في بلدان أخرى. الاضافه إلى ذلك ، تم التعرف أولا علي متغير من نوع irkv من الخفافيش التي كانت من نوع "اورنا ليوكواستر " في مقاطعه جيلين في شمال شرق الصين في ال201210، وأفيد بأنه يتسبب في وفاه الكلبة في مقاطعه لياونينغ في ال201711. في الاونه الاخيره ، تم التعرف أيضا علي الفيروس الجديد ، TWBLV ، من الخفافيش pipistrelle اليابانية في تايوان ، الصين في 2017. وتشير هذه النتائج إلى ان الكشف الفعال عن الفيروسات الأخرى هو أيضا مهم لمنع تسرب الفيروسات التي تحملها الخفافيش. وفي هذا الصدد ، فان الفيروسات المتداخلة من طراز RT-PCR التي تستهدف منطقه الجينات N الأكثر تحفظا هي أداه مفيده جدا ، وقد أظهرت النتائج انها قادره علي الكشف عن جميع الأنواع التي تمت الموافقة عليها بشكل فعال والتي تم التعرف عليها حتى الآن ، بما في ذلك [ربفس] متباعدة وراثيا و [ايركف] في الصين (معطيات علي [اركف] سلاله لا يبدي). ومع ذلك ، فمن المثير للاهتمام أيضا ان نلاحظ ان ARAV تم الكشف عنها فقط من قبل الإشعال PCR الجولة الثانية ، في حين تم الكشف عن IKOV فقط من قبل الإشعال PCR الجولة الاولي (الشكل 1). للتحقيق في سبب هذا التناقض ، أجريت مقارنه تسلسل جميع الفيروسات الثمانية عشره في مناطق التمهيدي الاربعه ، مع النتائج تبين ان 3 ' نهاية نوكليوتيد T من التمهيدي الخارجي N829 في الجولة الاولي PCR والثاني النيوكليوتيد T في 3 ' نهاية التمهيدي الداخلي N371F في الجولة الثانية PCR لم تكن مطابقه للمواقف المناظرة من ARAV (G) و IKOV (A) (الشكل 2). مره واحده تم تغيير T من التمهيدي N829 إلى G من ARAV و T من التمهيدي N371F تغيرت إلى A من IKOV ، تم الكشف عن كل من الفيروسات بنجاح في PCR (البيانات لم تظهر). وتبين هذه النتيجة الدور الحاسم الذي تؤديه النواة الثلاثة النهائية أو شبه النهائية من الإشعال في التضخيم الناجح للمنطقة المستهدفة.

لتقييم حساسية وخصوصية الطريقة في الكشف عن فيروس داء الدماغ للتشخيص السريري والمراقبة ، 9,624 عينات انسجه المخ الحيوانية تم اختبارها في السنوات ال 10 الماضية من قبل FAT والمتداخلة RT-PCR بالتوازي. من العينات 165 التي اختبرت داء اللقاح الإيجابي من قبل المتداخلة RT-PCR ، تم الكشف عن 162 بأنها ايجابيه من قبل FAT. لذلك ، تظهر طريقتين 99.07% وفقا. ويمكن تصنيف rabvs في هذه العينات 165 في السلالات المختلفة في الاسيويه, القطبية ذات الصلة, والعالمية التوثيق12,13, مشيرا إلى ان المتداخلة RT-PCR يمكن ان تغطي مختلف الجينات الوراثية من rabvs. تم اختبار ثلاثه العينات السريرية التهاوي للغاية ايجابيه من قبل المتداخلة RT-PCR ولكن السلبية من قبل FAT. وتتسق هذه النتيجة مع تقييم الفعالية في اختبار عينتين متدهورتين كما هو مبين في قسم النتائج التمثيلية ، مما يشير إلى ان التداخل RT-PCR أكثر حساسية من الدهون في الكشف عن الفيروسات في العينات الشديدة الانحدار.

وأكدت المشاركة في اختبار المقارنة المختبرية الدولية (ILCT) الذي نظمه المختبر المرجعي التابع للاتحاد الأوروبي لمكافحه الداء في الوكالة الفرنسية للغذاء والصحة البيئية والمهنية & السلامة ( ANSES) في 2010 ، وذلك باستخدام مجموعه من 12 عينات (واحد كل من RABV ، EBLV-1 ، EBLV-2 ، و ABLV كعناصر تحكم ايجابيه ، واحده السيطرة السلبية ، وسبع عينات اعمي). في الاختبار ، المتداخلة RT-PCR بنجاح التعرف علي كافة الفيروسات مع تناسق 100%. وفي 2018 ، تمت الموافقة علي هذه الطريقة كمعيار وطني لتشخيص داء الT36789 من قبل اللجنة الوطنية للتوحيد القياسي التقني للصحة الحيوانية في الصين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعمت الدراسة الخطة الوطنية الرئيسية للبحث والتطوير (المنحة رقم 2016YFD0500401) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter