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Genetics

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Ein Pan-Lysavirus verschachtete Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion wurde entwickelt, um speziell alle bekannten Lyssaviren zu erkennen. Die Validierung mit Tollwut-Hörnproben verschiedener Tierarten ergab, dass diese Methode eine Empfindlichkeit und Spezifität hat, die dem Gold-Standard-Fluoreszenz-Antikörper-Test entspricht und für die routinemäßige Tollwutdiagnostik verwendet werden könnte.

Abstract

Um Tollwut-Virus und andere Mitgliedsarten der Gattung Lyssavirus in der Familie Rhabdoviridaezu erkennen, wurde das Pan-Lysavirus verschachtelte Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion (verschachteltes RT-PCR) entwickelt, um die konservierte Region zu erkennen Das Nucleoprotein (N) Gen der Lyssaviren. Die Methode wendet die umgekehrte Transkription (RT) an, wobei virale RNAals Schablone und Oligo (dT) 15 und zufällige Hexamer als Primer verwendet werden, um die virale Komplementär-DNA (cDNA) zu synthetisieren. Dann wird die virale cDNA als Vorlage verwendet, um ein 845 bp N-Gen-Fragment in der ersten Runde PCR mit äußeren Primern zu verstärken, gefolgt von Zweitrunden-verschachteltem PCR, um das endgültige 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Diese Methode kann verschiedene genetische Ketten von Tollwut-Viren (RABV) erkennen. Die Validierung, mit 9.624 Hirnproben von acht heimischen Tierarten in 10 Jahren klinischer Tollwut-Diagnosen und Überwachung in China, zeigte, dass die Methode 100% Empfindlichkeit und 99,97% Spezifität im Vergleich zu den direkten Fluoreszenzerkrankungen hat Antikörpertest (FAT), die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) empfohlene Goldstandard-Methode. Darüber hinaus könnte die Methode auch das gezielte N-Gen-Fragment von 15 anderen zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten im 10. Bericht des Internationalen Komitees für die Besteuerung von Viren (ICTV), wie durch eine mimische Erkennung von synthetisierten N Gen-Plasmide aller Lyssaviren. Das Verfahren bietet eine bequeme Alternative zu FAT für die Tollwutdiagnose und ist als National Standard (GB/T36789-2018) von China zugelassen.

Introduction

Tollwut ist eine weltweite Zoonos-Krankheit, die durch Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus 1 verursachtwird. Lyssaviren (Familie Rhabdoviridae) sind einfallslose RNA-Viren mit einem etwa 12 kb-Genom, das fünf Proteine kodiert: N, Phosphoprotein (P), Matrix-Protein (M), Glykoprotein (G) und das große Protein oder Polymerase (L). Basierend auf Nukleotidsequenzen des N-Gens, der genetischen Distanz und der antigenen Muster wurden die Lyssaviren in 16 Arten unterteilt, die das klassische Tollwut-Virus (RABV) und die Tollwutviren (RRV) umfassen: Lagos-Batt-Virus (LBV), Duvenhage-Virus (DUVV) ), Mokola-Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische Fledermaus lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand-Virus (KHUV), Westkaukasischer Fledermau-Virus (WCBV), Shimoni-Bmeldchen-Virus (SHIBV), und Lleida Fledermaus Lyssavirus (LLEBV)2. In jüngster Zeit wurden zwei zusätzliche Lyssaviren identifiziert: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) von einer Brandt-Fledermaus (Myotis brandtii)in Finnland im Jahr 2017 3 und Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) von einer japanischen Pipistrelle isoliert ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China 2016– 2017 4.

Alle Säugetiere sind anfällig für Tollwut; Allerdings erlauben keine groben pathognomonischen Läsionen oder spezifische klinische Anzeichen ihre Identifizierung, und die Diagnose kann nur im Labor5erfolgen. Die am weitesten verbreitete Methode zur Tollwutdiagnose ist die FAT, die sowohl von der WHO als auch von der OIE5,6 alsGoldstandardangesehenwird. Dennoch kann der FAT unzuverlässige Ergebnisse bei degradided/autolysierten Hirngewebsproben liefern. Darüber hinaus kann es nicht verwendet werden, um biologische Flüssigkeitsprobe wie Hirnspinalflüssigkeit (CSF), Speichel und Urin zu unterlassen, wodurch die Verwendung in der antemortem-Diagnose 7 weitgehendausgeschlossen wird. Alternative konventionelle diagnostische Tests, wie der Tollwut-Gewebekultur-Infektionstest (RTCIT) und der Maus-Impfung (MIT), erfordern mehrere Tage6, ein großer Nachteil, wenn eine schnelle Diagnose unerlässlich ist.

Verschiedene molekulare Diagnosetests (z.B. der Nachweis der viralen RNA durch RT-PCR, der PCR – Enzym-verknüpfte immunsorsorbierte Assay [PCR-ELISA], In-situ-Hybridisierung und Echtzeit-PCR) werden alsschnelle und sensible Techniken für die Tollwettung eingesetzt 8. RT-PCR wird jetzt von OIE für die routinemäßige Tollwutdiagnose empfohlen, und eine heminachente (hn) PCR wird im OIE-Handbuch für Diagnostiktests und Impfstoffe für terrestrische Tierebeschrieben, um alle Lyssaviren 5 zu erkennen. Hier beschreiben wir ein pan-Lyssavirus verschachtelten RT-PCR, das die spezifische und sensible Erkennung aller 18 Lyssavirus-Arten ermöglicht, die mit der FAT vergleichbar sind oder sie übertreffen. Das Prinzip der Methode ist ein RT der Ziel-RNA (konservierte Region des Lyssavirus N-Gens) in cDNA, gefolgt von der Verstärkung der cDNA um zwei Runden PCR. Die cDNA unterzieht sich der ersten Runde PCR mit äußeren Primern, um ein 845 bp-Fragment zu verstärken; Die Second-round-PRR verwendet dann das PCR-Produkt der ersten Runde als Vorlage, um ein 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Die beiden PCR-Runden erhöhen die Empfindlichkeit des Tests deutlich.

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Protocol

Die Verwendung von Mäusen in diesem Protokoll wurde durch den Verwaltungsausschuss für Tierschutz des Instituts für Militärmedizin, Akademie der Militärmedizinischen Wissenschaften, China (Labortierpflege und Nutzung des Ausschusses Genehmigung, Genehmigung genehmigt Nummer JSY-DW-2010-02). Alle institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt.

1. RNA-Extraktion

  1. Extrahieren Sie RNA aus rabiaten Hirngewebe, Hautbiopsien, Speichel oder CSF oder aus RABV-infizierter Zellkultur, wobei Guanidinium isothiocyanat-phenol-chloroform-basierte Extraktionsmethoden oder kommerziell erhältliche virale RNA-Extraktionskits verwendet werden. Verwenden Sie die vorbereitete RNA sofort oder lagern Sie sie bei-80 ° C, bis sie benötigt wird.

2. Umkehrung der Transcription der Viralen RNA

  1. Entfernen Sie die in Tabelle 1 aufgeführten RT-Reagenzien aus dem Gefrierschrank, halten Sie sie auf Eis und tauchen Sie auf und wirbeln Sie sie vor dem Gebrauch.
  2. Bereiten Sie 12 μL RT-Reaktionsmix in einem 0,2 mL-PCR-Rohr mit den Reagenzien in Tabelle 1vor. Lassen Sie die Pipettiervariationen, indem Sie ein Volumen von Master-Mix mindestens eine Reaktionsgröße größer als erforderlich.
  3. Fügen Sie dem RT-Reaktionsmix innerhalb eines PCR-Arbeitsplatzes in einem Vorlagen-Raum 8 μL-Probe, positive Kontroll-RNA oder negative Steuerung hinzu. Die RT-Positivkontrolle ist eine RNA, die aus der Zellkultur gewonnen wird, die mit dem festen RABV-Stamm CVS-11 infiziert ist (Challenge-Virus-Standard-11) und bei-80 ° C gespeichert wird. Die Negativkontrolle enthält RNase-freies ddH2 O.
  4. Den Inhalt der RT-Rohre durch Wirbeln vermischen; Dann Zentrifuge kurz.
  5. Laden Sie die Reaktionsrohre in einen thermischen Zylinder. Das cDNA-Syntheseprogramm mit folgenden Bedingungen einrichten: 42 ° C für 90 min, 95 ° C für 5 min und 4 ° C auf Eis. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 20 μL ein.

3. Erste-Runden-PCR

  1. Halten Sie die PCR-Reagenzien, die in Tabelle 2 auf dem Eis aufgeführt sind, bis zum Gebrauch auf Eis; Dann tauten und wirbeln sie.
  2. Bereiten Sie den PCR-Mix in der ersten Runde in einem 0,2 mL-PCR-Rohr mit den Reagenzien vor, die in Tabelle 2aufgeführt sind.
  3. Fügen Sie eine 2 μL-Probe von cDNA oder Plasmid in den PCR-Mix der ersten Runde innerhalb eines PCR-Arbeitsplatzes in einem Vorlagen-Raum ein. Die PCR-Positivkontrolle ist CVS-11 cDNA, wie in Schritt 2.3 für die oben genannte RT-Methode erwähnt. Die PCR-Negativkontrolle ist ddH2 O.
  4. Übertragen Sie die versiegelten Rohre auf einen PCR-Thermozylinder und cycle mit den in Tabelle 3aufgeführten Parametern.

4. Second-Round PCR

  1. Bereiten Sie den PCR-Mix in einem 0,2 mL-PCR-Rohr mit den Reagenzien vor, die in Tabelle 4aufgeführt sind.
  2. Fügen Sie 2 μL PCR-Produkt in den Second-round-PCR-Mix ein. Dazu gehören ddH 2 Oalsnegative Kontrolle der Second-round-PCR.
  3. Führen Sie das PCR-Thermoradfahren mit den gleichen Parametern durch, wie in Schritt 3.4 angegeben.

5. Analyse der PCR-Produkte durch Elektrophorese auf Agarose Gels

  1. Bereiten Sie ein 1,5% agarose Gel vor, indem Sie 100 ml Tris-Acetate-EDTA (TAE) 1,5 g Agar hinzufügen und es gründlich auflösen, indem Sie es in einem Mikrowellenofen erwärmen.
  2. Fügen Sie Ethidium Bromid (EB) (bei einer Endkonzentration von 0,01%) Oder eine andere kommerzielle EB-Substitution. Das Gel in die Form gießen und bei Umgebungstemperatur für mindestens 30 Minuten erstarren lassen.
  3. Bereiten Sie die Verladeproben vor, indem Sie 5 μL jedes PCR-Produktes mit 1 μL 6x Ladepuffer mischen.
  4. Laden Sie die Proben und den geeigneten DNA-Marker separat in die Brunnen und führen Sie das Gel ca. 30-45 min bei 120 V, bis die Farbstofflinie etwa 75%-80% nach unten läuft.
  5. Schalten Sie die Leistung aus, trennen Sie die Elektroden von der Stromquelle und entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Gel-Kasten.
  6. Verwenden Sie ein UV-Gel, das das Gerät dokumentiert, um die DNA-Fragmente zu visualisieren und zu fotografieren.

6. Charakterisierung von Nested RT-PCR

  1. 6.1. Spezifität und Empfindlichkeit für den Nachweis von 18 Lyssavirus-Plasmiden
    1. Bestellen Sie 18 kommerzielle Plasmide, die das volle N-Gen jedes Lyssavirus (16 ICTV-Arten und zwei neuartige Arten) für die PCR enthalten.
    2. Berechnen Sie die Kopationsnummer des Plasmids mit der Avogadro-Nummer (NA)und der folgenden Formel.
      [(g/μL Plasmid DNA)/(Plasmid-Länge in bp x 660)] x 6.022 x 1023 = Anzahl der Molekües/μL
    3. Bereiten Sie Lagerlösungen (2,24 x 109 Molekües/μL) aller 18 Plasmide in ddH2 O.vor.
    4. Führen Sie neun 10-fache serielle Verdünnungen aller 18 Plasmide in ddH2O. Dilute 10 μL jedes Plasmid-Bestands mit 90 μL von ddH 2 O. VortexundZentrifuge kurz.
    5. Führen Sie die PCR-Verstärkung, wie sie in den Abschnitten 3-5 beschrieben ist.
    6. Analysieren Sie die Spezifität und Empfindlichkeit der verschachtelten PCR, indem Sie eine Reihe von Lyssavirus-Plasmiden erkennen.
  2. Bestimmung des d Etüden l imit
    1. Den Titer des Tollwut-Virus-Stammes CVS-11 Zellkultur auf 105.5 TCID50/mL (Virustiter nach dem OIE-Handbuch bestimmt)5anpassen.
    2. Führen Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen von CVS-11 (Bestandslösung ist 105.5 TCID50/mL), wie in Schritt 6.1.4 beschrieben.
    3. Führen Sie die RNA-Extraktion und die verschachtelten RT-PCR-Verstärkungsverfahren aller viralen Verdünnungen durch, wie in den Abschnitten 1-5 beschrieben.
  3. Verdiäre ison of Die Nester RT-PCR Mit dem "Goldstandard" FAT
    1. Testen Sie alle klinischen Proben durch verschachteltes RT-PCR und bestätigen Sie dann die Ergebnisse mit der FAT5 und N Gensequenzierung9.
    2. Verwenden Sie für eine statistische Auswertung mit SAS 9.1 normalisierte Daten. Verwenden Sie den Cappa-Test und den Chi-Quadrat-Test von McNemar für einen statistischen Vergleich der diagnostischen Tests (SAS-Befehl: Proc freq; table/agree). Berechnen Sie Vertrauensintervalle, die eine abinomiale Verteilung annehmen.
  4. Bewertung der Wirksamkeit bei der Prüfung degradierter Proben
    1. Stellen Sie zwei bestätigte klinische Hirngewebe-Proben von rabiaten Hunden bei 37 ° C.
    2. Die beiden Proben an jedem Tag der Exposition bei 37 ° C durch verschachtelte RT-PCR, die FAT und die MIT 5untersuchen.

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Representative Results

Die Ergebnisse der verschachtelten RT-PCR zur Erkennung von 18 Lyssavirus-Arten werden in Abbildung1 gezeigt. Alle PCR-positiven Steuerungen zeigten die zu erwartenden 845 bp in der ersten und 371 bp in den Zweitrundenverstärkungen ohne Band in der Negativsteuerung. Alle 18 Lyssaviren produzierten die erwarteten 845 and/oder 371 bp-Bands, was darauf hindeutet, dass die verschachtelten RT-PCR alle 18 lyssaviren entdeckt haben. Sechzehn Lyssaviruses Plasmide hatten eine effiziente Verstärkung in zwei Runden PCR, aber zwei, nämlich ARAV und IKOV, hatten eine Verstärkung in der ersten oder zweiten Runde PCR. Die Empfindlichkeit der Methode variierte bei der Erkennung verschiedener Lyssavirus-Plasmide, mit Grenzwerten von 2,24 x 10 0 bis 2,24 x 105 Molekülen/μL, wie in Tabelle 6gezeigt. Diese Unterschiede lassen sich auf die Fehleinschätzungen zwischen den Primern und Vorlagen aufgrund der Virussequenzvielfalt zurückführen. Darüber hinaus war die Empfindlichkeit, Tollwut-Virus CVS-11 in der Zellkultur zu erkennen, 10 2.5 TCID50/mL.

Insgesamt wurden 9.624 Hirngewebe aus klinischen Proben von verschachteltem RT-PCR im Vergleich zum FAT getestet und die Ergebnisse sind in Tabelle 7zusammengefasst, was zeigt, dass verschachteltes RT-PCR eine 100-prozentige Empfindlichkeit hatte (CI, 97,75% bis 100%). Und eine Spezifität von 99,97% (CI, 99,91% bis 99,99%). Die Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden war 990,7%. Drei Tests, die durch verschachtelte RT-PCR positiv, aber von der FAT negativ waren, waren von stark verfallenem klinischem Material. Diese drei Exemplare wurden durch die N-Gensequenzierung als RABV positiv bestätigt.

Ein Vergleich der Testleistung bei der Erkennung der beiden Hirnproben, die bei 37 ° C inkubiert wurden (Schritt 6.4.1 des Protokolls), deutete an, dass der verschachtelte RT-PCR das Virus in verfallenen Hirngewebe für mindestens 17 Tage Nachentnahme wirksam erkennen konnte, was für eine Längere Zeit im Vergleich zu nur 7 Tagen durch die FAT und nicht einmal 1 Tag durch das MIT. Dieses Ergebnis zeigt, dass verschachteltes RT-PCR bei der Erkennung von degradierten Proben sensibler ist als das FAT und das MIT.

Um das verschachtelte RT-PCR weiter zu validieren, wurden 10 Tollwutlabors in China eingeladen, Tests an einer Reihe von Proben durchzuführen. Von diesen wurden acht Labors aus unserem Labor eine Reihe von 10 blinden tierischen Hirngeweben zur Verfügung gestellt, darunter RABV-positive und negative Proben. Die beiden anderen Labore verwendeten ihre eigenen Exemplare. Alle Exemplare waren zuvor vom FAT archiviert und bestätigt worden. Alle 10 Labore haben Ergebnisse von verschachteltem RT-PCR in 100% Übereinstimmung mit dem FAT erhalten, ohne Falsch-Negative oder Falsch-Positive (Tabelle 8), was darauf hindeutet, dass der verschachtelte RT-PCR eine hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit aufweist.

Komponenten Volume pro Reaktion (μL)
DNTPs (2,5 mM) 4
Random Primer (50 μM) 1,5
Oligo (dT) 15 (50 μM) 0,5
M-MLV-Puffer (5x) 4
M-MLV Reverse Transkriptase (200 IU/μL) 1
RNasin (40 IU/μL) 1
Gesamtvolumen 12

Tabelle 1: Reagent Rückschrift für cDNA-Synthese .

Komponenten Volume pro Reaktion (μL)
DNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/μL) 0,3
Taq Buffer (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
DdH 2O 39,7
Gesamtvolumen 48

Tabelle 2: Reagent Der Die erste Runde PCR.

die Temperatur die Zeit Zyklen
94 ° C 2 min 1
94 ° C 30 s 35
56 ° C 30 s 35
72 ° C 40 s 35
72 ° C 10 Min. 1
4 ° C

Tabelle 3: C Fahrparameter von Die ersten- Und Second-Round PCR.

Komponenten Volume pro Reaktion (μL)
DNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/μL) 0,3
Taq Buffer (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
DdH 2O 39,7
Gesamtvolumen 48

Tabelle 4: Reagent Der Die zweite Runde PCR.

Primer Name Details die Richtung Sequenz (5 '-3 ') Nukleotid-Position Produktgröße
N127 Die erste Runde PCR vorwärts ATGTAACNCCTCTACAATGG -19 ~ 0 845bp
N829 Die erste Runde PCR Rückwärts GCCCTGTTCGAACATTCT 807 ~ 825 845bp
N371F Die zweite Runde PCR vorwärts ACAATGGAKKCTGACAARATTG -6 ~ 15 371bp
N371R Die zweite Runde PCR Rückwärts CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC 345 ~ 367 371bp

Tabelle 5: Primer s Gleichungen von Die ersten- Und Zweitrunde PCR . Degenerate bases: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

Lyssavirus-Arten anstrengen Template Plasmid (Moleküle/μL)
RABV GQ918139.1 2,24 x 101
Lbv EU293110.1 2,24 x 102
MOKV KF155005.1 2,24 x 101
DUVV EU293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 KF155004.1 2,24 x 101
ABLV GU992312.1 2,24 x 100
IRKV NC_020809.1 2,24 x 101
WCBV NC_025377.1 2,24 x 101
KHUV NC_025385.1 2,24 x 103
ARAV NC_020808.1 2,24 x 102
SHIBV NC_025365.1 2,24 x 101
BBLV NC_025251.1 2,24 x 101
IKOV NC_018629.1 2,24 x 105
LLEBV NC_031955.1 2,24 x 103
GBLV NC_031988.1 2,24 x 105
KBLV MF960865.1 2,24 x 101
TWBLV MF472710.1 2,24 x 101

Tabelle 6: Erkennungsgrenze von Nester RT-PCR O f 18 l Yssavirus es.

Standardmethode und Ergebnis RT-nPCR
positiv
RT-nPCR
ablehnend
Korrelation (%)
das Fett positiv
ablehnend
162
3
0
9459
99.07

Tabelle 7: Korrelation zwischen Nester RT-PCR Und die FAT Im Nachweis von RABVs in klinischen Proben.

Table 8
Tabelle 8: Validierungsergebnisse von verschachtelten RT-PCR von 10 Labore.

Figure 1
Bild 1 : Nachweis 18 Lyssavirus es by Nistum RT-PCR. (A) Das Ergebnis der ersten Runde PCR. (B) Das Ergebnis der zweiten Runde PCR. M = DL 2000 DNA-Marker. Lanes 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV und TWBLV, jeweils. Lane 19 = PCR positive Kontrolle; Spur 20 = Negativkontrolle für die PCR in der ersten Runde; Spur 21 = Negativkontrolle für die zweite Runde PCR. Ein positives PCR-Ergebnis zeigt ein Band mit 845 bp in der ersten Runde und 371 bp in der zweiten Runde PCR. Das Amplizium von ARAV ist nicht in der ersten Runde sichtbar, sondern in der zweiten Runde PCR (Spur 8), während das Amplizium von IKOV in der ersten Runde sichtbar ist, aber nicht in der zweiten Runde PCR (Spur 9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2
Bild 2 : Der Vergleich mit Primersequenzen zeigt die Differentialnukleotide in Primerregionen von 18 Lyssavirus-Arten. N127 und N829 waren äußere Primeln, N371F und N371R waren innere Primeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Derzeit ist RABV ein großes Lyssavirus, das für fast alle Menschen-und TiertRAB-Tollwut in China sowie in anderen Ländern verantwortlich ist. Zudem wurde erstmals eine IRKV-Variante von einem Murina leucogaster Fledermaus in der Provinz Jilin im Nordosten Chinas im Jahr 201210identifiziert, und es wurde berichtet, dass es in der Provinz Liaoning 2017 11Uhrden Tod eines Hundes verursacht. Zuletzt war auch ein neuartiges Lyssavirus, TWBLV, von einer japanischen Pipistrelle Fledermaus in Taiwan, China im Jahr 2017, identifiziert worden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die effektive Erkennung anderer Lyssaviren auch wichtig ist, um die Überflutung der mit Feuchtigkeit übertragenen Lyssaviren zu verhindern. In dieser Hinsicht ist das panlyssavirus verschachtelte RT-PCR, das auf die am meisten konservierte N-Genregion zielt, ein sehr nützliches Werkzeug, und die Ergebnisse haben gezeigt, dass es alle 16 ICTV-zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten, die bisher identifiziert wurden, effektiv erkennen kann, darunter Genetisch divergierende RABVs und IRKV in China (Daten zur IRKV-Stamm nicht abgebildet). Interessant ist aber auch, dass ARAV nur von den PCR-Primern der zweiten Runde entdeckt wurde, während IKOV nur von PCR-Primern der ersten Runde entdeckt wurde (Abbildung1). Um die Ursache dieser Diskrepanz zu untersuchen, wurde ein Sequenzvergleich aller 18 Lyssaviren innerhalb der vier Primerregionen durchgeführt, wobei die Ergebnisse zeigen, dass das 3 ' End-Nukleotid T der äußeren Grundierung N829 in der ersten Runde PCR und das zweite Nukleotid T bei der 3 ' Das Ende des inneren Primers N371F in der zweiten Runde PCR war nicht identisch mit den entsprechenden Positionen von ARAV (G) und IKOV (A) (Abbildung2). Nachdem das T des Primers N829 in das G von ARAV geändert wurde und das T von Primer N371F auf das A von IKOV geändert wurde, wurden beide Viren erfolgreich in PCR erkannt (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis zeigt die entscheidende Rolle der 3 ' End-oder Nah-Nukleotide von Primern bei der erfolgreichen Verstärkung der Zielregion.

Um die Empfindlichkeit und Spezifität der Methode bei der Erkennung von Tollwut-Virus zur klinischen Diagnostik und Überwachung zu bewerten, wurden in den letzten 10 Jahren 9.624 Tierhirngewebeproben parallel vom FAT und dem verschachtelten RT-PCR getestet. Von den 165 Proben, die Tollwut durch verschachteltes RT-PCR positiv getestet haben, wurden 162 von der FAT als positiv eingestuft; Daher zeigen die beiden Methoden 99.07% Übereinstimmung. Die in diesen 165 Proben entdeckten RABVs konnten in asiatische, arktische und kosmopolitische Bahnen 12, 13 inverschiedene Linien eingeteilt werden, was darauf hindeutet, dass verschachtelte RT-PCR die verschiedenen genetischen Klappen von RABVs abdecken können. Drei stark verfallene klinische Exemplare wurden von verschachteltem RT-PCR positiv getestet, aber von der FAT negativ. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Bewertung der Wirksamkeit bei der Prüfung von zwei abgebauten Proben, wie sie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse gezeigt wird, was darauf hindeutet, dass verschachteltes RT-PCR empfindlicher ist als die FAT bei der Erkennung von Viren in stark verfallenen Proben.

Die Leistung des verschachtelten RT-PCR wurde durch die Teilnahme am Internationalen Laborvergleichstest (ILCT) bestätigt, der vom EU-Referenzlabor für Rabien bei der französischen Agentur für Ernährung, Umwelt und Arbeits& schutz organisiert wurde ( ANSES) im Jahr 2010, mit einem Satz von 12 Proben (je eine von RABV, EBLV-1, EBLV-2 und ABLV als positive Steuerung, eine negative Kontrolle und sieben geblindete Proben). Im Test identifizierte der verschachtelte RT-PCR erfolgreich alle lyssaviren mit einer 100-prozentigen Konsistenz. Im Jahr 2018 wurde die Methode vom Nationalen Technischen Normungsausschuss Chinas als Nationaler Standard für Rabies-Diagnosen (GB/T36789-2018) genehmigt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Studie wurde durch den National Key Research and Development Plan (Grant Nr. 2016YFD0500401) und die National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 31302043) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

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References

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Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren
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Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

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