Lyssaवायरसों का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन Polymerase चेन रिएक्शन का मूल्यांकन
Summary
एक पैन-lyssavirus नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विशेष रूप से सभी ज्ञात lyssaवायरस का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है । मांयता रेबीज का उपयोग कर विभिंन पशु प्रजातियों के मस्तिष्क के नमूनों से पता चला है कि इस विधि एक संवेदनशीलता और सोने के मानक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण के समकक्ष विशिष्टता है और नियमित रेबीज निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
रैब्डोविरिडीपरिवार के भीतर रेबीज वायरस और जीनस लाइसैवायरस के अन्य सदस्य प्रजातियों का पता लगाने के लिए, संरक्षित क्षेत्र का पता लगाने के लिए पैन-लाइसावायरस नेस्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (नेस्टेड आरटी-पीसीआर) विकसित किया गया था । लाइसावायरसों के न्यूकोप्रोटीन (ढ) जीन का । यह विधि वायरल पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषी बनाने के लिए विषाणु आरएनए को टेम्पलेट और ओलिगो (डीटी)15 और यादृच्छिक हैडेक्सर के रूप में प्रयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) लागू करती है । इसके बाद, वायरल सीडीएनए का उपयोग बाहरी प्राइमर्स का उपयोग करते ३७१ हुए पहले दौर की पीसीआर में ८४५ बीपी एन जीन अंश को बढ़ाना है । इस विधि से रेबीज वायरस (RABV) के विभिन्न आनुवंशिक clades का पता लगा सकते हैं । सत्यापन, नैदानिक रेबीज निदान और चीन में निगरानी के 10 वर्षों में आठ घरेलू पशु प्रजातियों से ९,६२४ मस्तिष्क नमूनों का उपयोग कर पता चला है कि विधि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट के साथ तुलना में १००% संवेदनशीलता और ९९.९७% विशिष्टता है एंटीबॉडी टेस्ट (वसा), सोने के मानक विधि विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) और विश्व संगठन के लिए पशु स्वास्थ्य (OIE) द्वारा अनुशंसित । इसके अलावा, विधि भी विशेष रूप से वायरस की वर्गीकरण पर अंतरराष्ट्रीय समिति की 10 वीं रिपोर्ट में 15 अंय अनुमोदित और दो उपंयास lyssavirus प्रजातियों के लक्षित N जीन टुकड़ा बढ़ाना सकता है (ICTV) के रूप में एक संश्लेषित की नकल का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन द जीन सभी लाइसावायरसों का प्लाज्मिड्स । यह विधि रेबीज निदान के लिए वसा के लिए एक सुविधाजनक विकल्प प्रदान करती है और इसे चीन के राष्ट्रीय मानक (GB/T36789-2018) के रूप में अनुमोदित किया गया है ।
Introduction
रेबीज एक दुनिया भर में जूनोटिक जीनस lyssavirus1के भीतर वायरस की वजह से रोग है । Lyssaवायरस (परिवार रैब्डोविरिडी) एक लगभग 12 केबी जीनोम के साथ एक नकारात्मक-फंसे आरएनए वायरस हैं जो पाँच प्रोटीनों को एनकोड करते हैं: एन, फ़ॉफाफोप्रोटीन (पी), मैट्रिक्स प्रोटीन (एम), ग्लाइकोप्रोटीन (जी), और बड़े प्रोटीन या पॉलीमेरेज (एल) । N जीन, आनुवंशिक दूरी, और प्रतिजनी पैटर्न के न्यूकोटाइड दृश्यों के आधार पर, lyssaवायरसों को 16 प्रजातियों में बांटा गया है, जिनमें क्लासिकल रेबीज वायरस (RABV) और रेबीज से संबंधित वायरस (RRV): लागोस बैट वायरस (LBV), ड्यूवेर्हाज वायरस (DUVV) ), मोकोला वायरस (MOKV), यूरोपीय चमगादड़ lyssavirus 1 (EBLV-1), यूरोपीय चमगादड़ lyssavirus 2 (EBLV-2), ऑस्ट्रेलियाई चमगादड़ lyssavirus (ABLV), Aravan वायरस (ARAVAN), Ikoma वायरस (IKOV), बोकेलोह चमगादड़ lyssavirus (BBLV), गंनोरुवा चमगादड़ lyssavirus (GBLV), Irkut वायरस (IRKUT), खुजव वायरस (खुव), वेस्ट केशियन बैट वायरस (डब्ल्यूसीबीवी), शिरोनी बैट वायरस (शिबीवी), और ललीदा बैट लायसवायरस (एलईवीबीवी)2। हाल ही में, दो अतिरिक्त lyssaवायरसों की पहचान की गई है: Kotalahti चमगादड़ lyssaviruses (KBLV) फिनलैंड में एक Brandt चमगादड़ से अलग (Myotis brandt) २०१७ में3 और ताइवान चमगादड़ LYSSAVIRUSES (Twblv) एक जापानी pipistrelle से अलग ( (2) 2016-20174में ताइवान, चीन में ।
सभी स्तनधारियों को रेबीज होने की संभावना होती है; हालांकि, कोई सकल रोगविज्ञान घावों या विशिष्ट नैदानिक संकेत इसकी पहचान की अनुमति है, और निदान केवल प्रयोगशाला5में किया जा सकता है । रेबीज निदान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि वसा, जो दोनों और oie5,6द्वारा सोने के मानक के रूप में माना जाता है है । फिर भी, वसा अवक्रमित पर अविश्वसनीय परिणाम पैदा कर सकते है/ इसके अतिरिक्त, यह इस तरह के मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), लार, और मूत्र, जिससे काफी हद तक antemortem निदान7में अपने रोजगार precluding के रूप में जैविक द्रव नमूनों परख करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । वैकल्पिक पारंपरिक नैदानिक परीक्षणों, जैसे रेबीज टिश्यू कल्चर इंफेक्शन टेस्ट (RTCIT) और माउस टीका परीक्षण (एमआईटी), के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है6, एक बड़ी खामी है जब एक तेजी से निदान आवश्यक है ।
विभिन्न आणविक नैदानिक परीक्षणों (उदाहरण के लिए, आरटी-पीसीआर द्वारा वायरल आरएनए का पता लगाना, पीसीआर-एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोतुला परख [पीसीआर-एलिसा], स्वस्थानी संकरण में, और रीयल-टाइम पीसीआर) रेबीज निदान8के लिए तेजी से और संवेदनशील तकनीकों के रूप में उपयोग किया जाता है । आरटी-पीसीआर अब नियमित रेबीज निदान के लिए OIE द्वारा सिफारिश की है, और एक heminested (hn) पीसीआर नैदानिक परीक्षणों और स्थलीय जानवरों के लिए टीकों के OIE मैनुअल में वर्णित सभी lyssaवायरसों5का पता लगाने के लिए है । यहां हम एक पैन-lyssavirus नेस्टेड RT-पीसीआर, जो सभी 18 lyssavirus के लिए तुलनीय या अधिक है कि वसा द्वारा प्राप्त प्रजातियों में से विशिष्ट और संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति देता है का वर्णन । विधि का सिद्धांत लक्ष्य आरएनए (लाइसैवायरस एन जीन का संरक्षित क्षेत्र) सीडीएनए में एक आरटी है, जिसके बाद सीडीएनए को पीसीआर के दो राउंड द्वारा प्रवर्धन किया जाता है । एक ८४५ bp टुकड़ा बढ़ाना करने के लिए बाहरी प्राइमरों के साथ पहले दौर पीसीआर के साथ cdna गुजरता है; फिर, दूसरे दौर की पीसीआर आंतरिक प्राइमर्स के साथ ३७१ bp टुकड़ा बढ़ाना के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पहले दौर के पीसीआर उत्पाद का उपयोग करती है । पीसीआर के दो राउंड में परख की संवेदनशीलता काफी बढ़ जाती है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान में, RABV एक प्रमुख lyssavirus लगभग सभी मानव और चीन में पशु रेबीज के लिए जिंमेदार है, साथ ही साथ अंय देशों में है । इसके अलावा, एक irkv संस्करण पहले २०१२10में पूर्वोत्तर चीन में जिलीन प्रांत में एक एम…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास योजना (ग्रांट नंबर 2016YFD0500401) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान प्रतिष्ठान (ग्रांट नंबर ३१३०२०४३) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
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