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Genetics

Lyssaवायरसों का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन Polymerase चेन रिएक्शन का मूल्यांकन

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

एक पैन-lyssavirus नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विशेष रूप से सभी ज्ञात lyssaवायरस का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है । मांयता रेबीज का उपयोग कर विभिंन पशु प्रजातियों के मस्तिष्क के नमूनों से पता चला है कि इस विधि एक संवेदनशीलता और सोने के मानक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण के समकक्ष विशिष्टता है और नियमित रेबीज निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

रैब्डोविरिडीपरिवार के भीतर रेबीज वायरस और जीनस लाइसैवायरस के अन्य सदस्य प्रजातियों का पता लगाने के लिए, संरक्षित क्षेत्र का पता लगाने के लिए पैन-लाइसावायरस नेस्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (नेस्टेड आरटी-पीसीआर) विकसित किया गया था । लाइसावायरसों के न्यूकोप्रोटीन (ढ) जीन का । यह विधि वायरल पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषी बनाने के लिए विषाणु आरएनए को टेम्पलेट और ओलिगो (डीटी)15 और यादृच्छिक हैडेक्सर के रूप में प्रयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) लागू करती है । इसके बाद, वायरल सीडीएनए का उपयोग बाहरी प्राइमर्स का उपयोग करते ३७१ हुए पहले दौर की पीसीआर में ८४५ बीपी एन जीन अंश को बढ़ाना है । इस विधि से रेबीज वायरस (RABV) के विभिन्न आनुवंशिक clades का पता लगा सकते हैं । सत्यापन, नैदानिक रेबीज निदान और चीन में निगरानी के 10 वर्षों में आठ घरेलू पशु प्रजातियों से ९,६२४ मस्तिष्क नमूनों का उपयोग कर पता चला है कि विधि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट के साथ तुलना में १००% संवेदनशीलता और ९९.९७% विशिष्टता है एंटीबॉडी टेस्ट (वसा), सोने के मानक विधि विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) और विश्व संगठन के लिए पशु स्वास्थ्य (OIE) द्वारा अनुशंसित । इसके अलावा, विधि भी विशेष रूप से वायरस की वर्गीकरण पर अंतरराष्ट्रीय समिति की 10 वीं रिपोर्ट में 15 अंय अनुमोदित और दो उपंयास lyssavirus प्रजातियों के लक्षित N जीन टुकड़ा बढ़ाना सकता है (ICTV) के रूप में एक संश्लेषित की नकल का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन द जीन सभी लाइसावायरसों का प्लाज्मिड्स । यह विधि रेबीज निदान के लिए वसा के लिए एक सुविधाजनक विकल्प प्रदान करती है और इसे चीन के राष्ट्रीय मानक (GB/T36789-2018) के रूप में अनुमोदित किया गया है ।

Introduction

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रेबीज एक दुनिया भर में जूनोटिक जीनस lyssavirus1के भीतर वायरस की वजह से रोग है । Lyssaवायरस (परिवार रैब्डोविरिडी) एक लगभग 12 केबी जीनोम के साथ एक नकारात्मक-फंसे आरएनए वायरस हैं जो पाँच प्रोटीनों को एनकोड करते हैं: एन, फ़ॉफाफोप्रोटीन (पी), मैट्रिक्स प्रोटीन (एम), ग्लाइकोप्रोटीन (जी), और बड़े प्रोटीन या पॉलीमेरेज (एल) । N जीन, आनुवंशिक दूरी, और प्रतिजनी पैटर्न के न्यूकोटाइड दृश्यों के आधार पर, lyssaवायरसों को 16 प्रजातियों में बांटा गया है, जिनमें क्लासिकल रेबीज वायरस (RABV) और रेबीज से संबंधित वायरस (RRV): लागोस बैट वायरस (LBV), ड्यूवेर्हाज वायरस (DUVV) ), मोकोला वायरस (MOKV), यूरोपीय चमगादड़ lyssavirus 1 (EBLV-1), यूरोपीय चमगादड़ lyssavirus 2 (EBLV-2), ऑस्ट्रेलियाई चमगादड़ lyssavirus (ABLV), Aravan वायरस (ARAVAN), Ikoma वायरस (IKOV), बोकेलोह चमगादड़ lyssavirus (BBLV), गंनोरुवा चमगादड़ lyssavirus (GBLV), Irkut वायरस (IRKUT), खुजव वायरस (खुव), वेस्ट केशियन बैट वायरस (डब्ल्यूसीबीवी), शिरोनी बैट वायरस (शिबीवी), और ललीदा बैट लायसवायरस (एलईवीबीवी)2। हाल ही में, दो अतिरिक्त lyssaवायरसों की पहचान की गई है: Kotalahti चमगादड़ lyssaviruses (KBLV) फिनलैंड में एक Brandt चमगादड़ से अलग (Myotis brandt) २०१७ में3 और ताइवान चमगादड़ LYSSAVIRUSES (Twblv) एक जापानी pipistrelle से अलग ( (2) 2016-20174में ताइवान, चीन में ।

सभी स्तनधारियों को रेबीज होने की संभावना होती है; हालांकि, कोई सकल रोगविज्ञान घावों या विशिष्ट नैदानिक संकेत इसकी पहचान की अनुमति है, और निदान केवल प्रयोगशाला5में किया जा सकता है । रेबीज निदान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि वसा, जो दोनों और oie5,6द्वारा सोने के मानक के रूप में माना जाता है है । फिर भी, वसा अवक्रमित पर अविश्वसनीय परिणाम पैदा कर सकते है/ इसके अतिरिक्त, यह इस तरह के मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), लार, और मूत्र, जिससे काफी हद तक antemortem निदान7में अपने रोजगार precluding के रूप में जैविक द्रव नमूनों परख करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । वैकल्पिक पारंपरिक नैदानिक परीक्षणों, जैसे रेबीज टिश्यू कल्चर इंफेक्शन टेस्ट (RTCIT) और माउस टीका परीक्षण (एमआईटी), के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है6, एक बड़ी खामी है जब एक तेजी से निदान आवश्यक है ।

विभिन्न आणविक नैदानिक परीक्षणों (उदाहरण के लिए, आरटी-पीसीआर द्वारा वायरल आरएनए का पता लगाना, पीसीआर-एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोतुला परख [पीसीआर-एलिसा], स्वस्थानी संकरण में, और रीयल-टाइम पीसीआर) रेबीज निदान8के लिए तेजी से और संवेदनशील तकनीकों के रूप में उपयोग किया जाता है । आरटी-पीसीआर अब नियमित रेबीज निदान के लिए OIE द्वारा सिफारिश की है, और एक heminested (hn) पीसीआर नैदानिक परीक्षणों और स्थलीय जानवरों के लिए टीकों के OIE मैनुअल में वर्णित सभी lyssaवायरसों5का पता लगाने के लिए है । यहां हम एक पैन-lyssavirus नेस्टेड RT-पीसीआर, जो सभी 18 lyssavirus के लिए तुलनीय या अधिक है कि वसा द्वारा प्राप्त प्रजातियों में से विशिष्ट और संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति देता है का वर्णन । विधि का सिद्धांत लक्ष्य आरएनए (लाइसैवायरस एन जीन का संरक्षित क्षेत्र) सीडीएनए में एक आरटी है, जिसके बाद सीडीएनए को पीसीआर के दो राउंड द्वारा प्रवर्धन किया जाता है । एक ८४५ bp टुकड़ा बढ़ाना करने के लिए बाहरी प्राइमरों के साथ पहले दौर पीसीआर के साथ cdna गुजरता है; फिर, दूसरे दौर की पीसीआर आंतरिक प्राइमर्स के साथ ३७१ bp टुकड़ा बढ़ाना के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पहले दौर के पीसीआर उत्पाद का उपयोग करती है । पीसीआर के दो राउंड में परख की संवेदनशीलता काफी बढ़ जाती है ।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल में चूहों का उपयोग सैन्य पशु चिकित्सा संस्थान के पशु कल्याण पर प्रशासनिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, सैन्य चिकित्सा विज्ञान अकादमी, चीन (प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग समिति प्राधिकरण, परमिट संख्या जेएसवाई-DW-2010-02) । प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए सभी संस्थागत और राष्ट्रीय दिशा-निर्देशों का पालन किया गया ।

1. आरएनए निष्कर्षण

  1. रेबीज-संदिग्ध मस्तिष्क ऊतक, त्वचा बायोप्सी, लार, या सीएसएफ से या RABV संक्रमित कोशिका संस्कृति से, guanidinium आइसोथियोसायनेट-phenol-क्लोरोफॉर्म आधारित निष्कर्षण तरीकों या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वायरल आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर शाही सेना निकालें । जब तक आवश्यक हो, तैयार आरएनए का उपयोग तुरंत करें या इसे-८० ° c पर भंडारित कर ।

2. वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. RT अभिकर्मकों तालिका 1 में फ्रीजर से सूचीबद्ध निकालें, उंहें बर्फ पर रखने के लिए, और गल और उंहें उपयोग करने से पहले भंवर ।
  2. तालिका 1में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में 12 ΜL आर टी रिएक्शन मिक्स तैयार करें । मास्टर मिक्स की एक मात्रा की तैयारी से विविधताओं pipetting के लिए अनुमति दें कम से कम एक प्रतिक्रिया आकार से अधिक आवश्यक.
  3. एक टेम्पलेट कमरे में एक पीसीआर वर्कस्टेशन के भीतर आर टी रिएक्शन मिश्रण करने के लिए 8 μL नमूना, सकारात्मक नियंत्रण आरएनए या नकारात्मक नियंत्रण जोड़ें । आर. टी. सकारात्मक नियंत्रण आरएनए है सेल निश्चित RABV तनाव CVS-11 (चैलेंज वायरस मानक-11) से संक्रमित संस्कृति से निकाला और पर संग्रहीत-८० ° c । ऋणात्मक नियंत्रण में RNase-मुक्त ddH2O है ।
  4. मिश्रण vortexing द्वारा आरटी ट्यूब की सामग्री; फिर, संक्षिप्त अपकेंद्रित्र ।
  5. एक थर्मल cycler में प्रतिक्रिया ट्यूबों लोड । निंनलिखित शर्तों के साथ cDNA संश्लेषण कार्यक्रम की स्थापना: ४२ ° c ९० मिनट के लिए, ९५ ° c 5 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पकड़ पर । प्रतिक्रिया मात्रा सेट करने के लिए 20 μL. RT चलाएँ प्रारंभ करें ।

3. पहले दौर पीसीआर

  1. उपयोग तक एक साफ कमरे में बर्फ पर तालिका 2 में सूचीबद्ध पीसीआर अभिकर्मकों रखें; फिर, पिघलना और उन्हें भंवर ।
  2. तालिका 2में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में पहले दौर की पीसीआर मिक्स तैयार करें ।
  3. एक टेम्पलेट कक्ष में एक पीसीआर वर्कस्टेशन के भीतर पहले दौर पीसीआर मिश्रण में cDNA या प्लाज्मिड का एक 2 μL नमूना जोड़ें । पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण सीवीएस-11 Cvs तैयार के रूप में ऊपर आरटी विधि के लिए कदम २.३ में उल्लेख किया है । पीसीआर नेगेटिव कंट्रोल डीडीएच2ओ है ।
  4. एक पीसीआर थर्मल cycler और चक्र के लिए सील ट्यूब स्थानांतरण तालिका 3में सूचीबद्ध मापदंडों का उपयोग कर ।

4. दूसरे दौर पीसीआर

  1. तालिका 4में सूचीबद्ध अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए एक ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में दूसरे दौर की पीसीआर मिश्रण तैयार करें ।
  2. दूसरे दौर की पीसीआर मिक्स में पहले दौर की पीसीआर उत्पाद की 2 μL जोड़ें । इसके अलावा डीडीएच2ओ को दूसरे राउंड की पीसीआर के निगेटिव कंट्रोल के तौर पर शामिल करें ।
  3. कदम ३.४ में दिए गए के रूप में एक ही मापदंडों का उपयोग कर पीसीआर थर्मल सायक्लिंग प्रदर्शन ।

5. Agarose जैल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण

  1. एक १.५% एगेरोज़ जेल को १.५ ग्राम आगरोस के १०० मिलीलीटर ट्रायल्स-एसीटेट-ईटा (TAE) जोड़कर तैयार करें और इसे माइक्रोवेव ओवन में गर्म करके अच्छी तरह से घोलें ।
  2. एथिडियम ब्रोमाइड जोड़ें (EB) (०.०१% की एक अंतिम एकाग्रता पर) या अंय व्यावसायिक EB प्रतिस्थापन । मोल्ड में जेल डालो और इसे छोड़ने के लिए परिवेश के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए जमना ।
  3. प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 1 μL 6x लोडिंग बफर के साथ 5 μL मिश्रण द्वारा लदान के नमूने तैयार करते हैं ।
  4. अलग कुओं में नमूनों और उपयुक्त डीएनए मार्कर लोड और लगभग 30-45 मिनट के लिए १२० वी पर जेल चलाने जब तक डाई लाइन लगभग 75% है-८०% जेल से नीचे ।
  5. बिजली बंद करें, बिजली के स्रोत से इलेक्ट्रोड डिस्कनेक्ट करें, और फिर, सावधानी से जेल बॉक्स से जेल निकालें ।
  6. के लिए एक यूवी जेल का उपयोग करने का दस्तावेजीकरण उपकरण कल्पना और तस्वीर डीएनए टुकड़े ।

6. नेस्टेड आरटी के लक्षण वर्णन-पीसीआर

  1. ६.१. विशिष्टता और 18 lyssaवायरसों plasmids का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता
    1. आदेश 18 वाणिज्यिक plasmids प्रत्येक lyssavirus के पूर्ण N जीन युक्त (16 ICTV प्रजातियों और दो उपंयास प्रजातियों) पीसीआर के लिए ।
    2. Avogadro संख्या (Nएक) और निम्न सूत्र का उपयोग कर प्लाज्मिड की प्रतिलिपि संख्या की गणना.
      [(जी/μL प्लाज्मिड डीएनए)/(६६०) x ६.०२२ x 1023 = अणुओं की संख्या/μl
    3. डीडीएच2ओ में सभी 18 प्लाज्मिड्स के स्टाक समाधान (२.२४ x 109 अणु/μl) तैयार करें ।
    4. () प्रत्येक प्लाज्मिड ९० स्टाक की 10-एल-डी-के-------------------------------------------------------। ९ १०
    5. अनुभाग 3-5 में वर्णित के रूप में पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन ।
    6. स्पष्टता और लाइसैवाइरस plasmids की एक श्रृंखला का पता लगाने के द्वारा नेस्टेड पीसीआर की संवेदनशीलता का विश्लेषण करें ।
  2. डी का निर्धारण etection एल imit
    1. रेबीज वायरस तनाव cvs-11 सेल संस्कृति के अनुमापांक समायोजित 10५.५ tcid५०/एमएल (वायरस अनुमापांक oie मैनुअल के अनुसार निर्धारित)5.
    2. प्रदर्शन ५ १०-गुना CVS-11 के धारावाहिक dilutions (स्टॉक समाधान 10५.५ tcid५०/
    3. आरएनए निष्कर्षण और नेस्टेड आरटी-पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रियाओं सभी वायरल dilutions की धारा 1-5 में वर्णित के रूप में करते हैं ।
  3. Compar सन के नेस्टेड RT-पीसीआर "गोल्ड स्टैंडर्ड" फैट के साथ
    1. सभी नैदानिक नमूनों का परीक्षण नेस्टेड RT-पीसीआर द्वारा, और फिर, FAT5 और N जीन अनुक्रमण9के साथ परिणाम की पुष्टि करें ।
    2. एक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए SAS ९.१ के साथ सामांयीकृत डेटा का उपयोग करें । नैदानिक परीक्षणों (एसएएस कमांड: proc freq; तालिका/सहमत) की सांख्यिकीय तुलना के लिए कापा परीक्षण और mcnemar की ची-वर्गित परीक्षण का उपयोग करें । एबनोमी वितरण को मानते हुए विश्वास अंतरालों की गणना कीजिए ।
  4. अवक्रमित नमूनों की जांच में प्रभावकारिता का मूल्यांकन
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पागल कुत्तों के दो पुष्ट नैदानिक मस्तिष्क ऊतक के नमूनों का पर्दाफाश ।
    2. परख के प्रत्येक दिन पर दो नमूने ३७ डिग्री सेल्सियस पर नेस्टेड आरटी द्वारा-पीसीआर, वसा, और5एमआईटी ।

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Representative Results

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18 lyssavirus प्रजातियों का पता लगाने के लिए नेस्टेड आरटी-पीसीआर के परिणाम चित्र 1में दिखाए जाते हैं । सभी पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण पहले-और ३७१ बीपी में अपेक्षित ८४५ बीपी दिखाया नकारात्मक नियंत्रण में कोई बैंड के साथ दूसरे दौर amplifications में । सभी 18 lyssaवायरसों का उत्पादन किया उंमीद ८४५ और/या ३७१ bp बैंड, यह दर्शाता है कि नेस्टेड RT-पीसीआर सभी 18 lyssaवायरसों का पता चला । सोलह lyssaवायरस plasmids पीसीआर के दो दौर में कुशल प्रवर्धन था, लेकिन दो, अर्थात् ARAV और IKOV, या तो पहले या दूसरे दौर पीसीआर में प्रवर्धन था । विधि की संवेदनशीलता विभिन्न lyssavirusplasmids का पता लगाने में विविध, २.२४ x 100 से २.२४ x 105 अणुओं/ इन मतभेदों को वायरल अनुक्रम विविधता के कारण प्राइमर्स और टेम्पलेट्स के बीच बेमेल के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है । इसके अलावा, सेल कल्चर में रेबीज वायरस सीवीएस-11 का पता लगाने की संवेदनशीलता 10२.५ टीसीआईडी५०/एमएलआई थी ।

नैदानिक नमूनों से ९,६२४ मस्तिष्क के ऊतकों की कुल वसा के साथ तुलना में नेस्टेड आरटी-पीसीआर द्वारा परीक्षण किया गया था और परिणाम तालिका 7में संक्षेप हैं, जो पता चलता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर एक १००% संवेदनशीलता (CI, ९७.७५% करने के लिए १००%) और ९९.९७% विशिष्टता (सीआई, ९९.९१% से ९९.९९%) । दोनों तरीकों के बीच अनुसार ९९.०७% था । तीन परीक्षण है कि नेस्टेड आरटी द्वारा सकारात्मक थे-पीसीआर लेकिन वसा द्वारा नकारात्मक उच्च सड़ा हुआ नैदानिक सामग्री के थे । इन तीन नमूनों की पुष्टि एन जीन अनुक्रमण द्वारा रवी पॉजीटिव के रूप में की गई थी ।

दो मस्तिष्क नमूनों की खोज में परीक्षण के प्रदर्शन की तुलना में ३७ डिग्री सेल्सियस (प्रोटोकॉल के कदम 6.4.1) से पता चलता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर प्रभावी ढंग से क्षय होने वाले मस्तिष्क के ऊतकों में वायरस का पता लगाने सकता है कम से 17 दिनों postdegradation, जो एक समय की लंबी अवधि जब वसा द्वारा केवल 7 दिन और एमआईटी द्वारा 1 दिन भी नहीं की तुलना में । इस परिणाम से पता चलता है कि नेस्टेड RT-पीसीआर वसा और एमआईटी की तुलना में अवक्रमित नमूनों की खोज में अधिक संवेदनशील है ।

नेस्टेड आरटी-पीसीआर को और वैध बनाने के लिए चीन में 10 रेबीज प्रयोगशालाओं को नमूनों के सेट पर परीक्षण करने के लिए आमंत्रित किया गया था । इनमें से, आठ प्रयोगशालाओं को हमारी प्रयोगशाला से 10 अंधा पशु मस्तिष्क के ऊतकों का एक सेट प्रदान किया गया था, जिसमें RABV सकारात्मक और नकारात्मक नमूने शामिल थे । अन्य दो प्रयोगशालाओं ने अपने स्वयं के नमूनों का प्रयोग किया । सभी नमूनों को पहले वसा द्वारा संग्रहीत और पुष्ट किया गया था । सभी 10 प्रयोगशालाओं १००% के अनुसार नेस्टेड आरटी-पीसीआर द्वारा परिणाम प्राप्त वसा के साथ, कोई झूठी नकारात्मक या झूठी-सकारात्मक के साथ (तालिका 8), यह दर्शाता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर एक उच्च विशिष्टता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की योग्यता थी.

घटक प्रति प्रतिक्रिया मात्रा (μL)
dNTPs (२.५ मिमी) 4
यादृच्छिक प्राइमर (५० μM) १.५
ओलिगो (डीटी) 15 (५० μm) ०.५
एम MLV बफर (5x) 4
M-MLV रिवर्स ट्रांसक्रिटेस (२०० IU/μL) 1
रनस्न (४० IU/μL) 1
कुल मात्रा 12

तालिका 1: अभिकर्मकों cDNA संश्लेषण के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के .

घटक प्रति प्रतिक्रिया मात्रा (μL)
dNTPs (10 मिमी) 1
पूर्व-(5 U/μL) ०.३
क बफर (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
डीडी एच2 ३९.७
कुल मात्रा ४८

तालिका 2: अभिकर्मकों का पहले राउंड की पीसीआर ।

तापमान समय चक्र
९४ डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 1
९४ डिग्री सेल्सियस 30 एस ३५
५६ डिग्री सेल्सियस 30 एस ३५
७२ डिग्री सेल्सियस ४० एस ३५
७२ डिग्री सेल्सियस 10 मिनट 1
4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 3: के पैरामीटर्स को चिपकाकर को पहले कर दूसरे राउंड की पीसीआर ।

घटक प्रति प्रतिक्रिया मात्रा (μL)
dNTPs (10 मिमी) 1
पूर्व-(5 U/μL) ०.३
क बफर (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
डीडी एच2 ३९.७
कुल मात्रा ४८

तालिका 4: अभिकर्मकों का दूसरे राउंड की पीसीआर ।

प्राइमर नाम विवरण दिशा अनुक्रम (5 '-3 ') नाभिकोटाइड स्थिति उत्पाद का आकार
N127 पहले राउंड की पीसीआर आगे ATGTAACNCCTCTACAATGG -19 ~ 0 845bp
N829 पहले राउंड की पीसीआर उल्टा GCCCTGGTTCGAACATTCT 807 ~ 825 845bp
N371F दूसरे राउंड की पीसीआर आगे अटाग्गाक्क्सीटीगकाआरोत्ग -6 ~ 15 371bp
N371R दूसरे राउंड की पीसीआर उल्टा CCTGYWGAGCCCAGTTVCCTC 345 ~ 367 371bp

तालिका 5: प्राइमर एस की equences को पहले कर दूसरे दौर पीसीआर . अपभ्रष् ट आधार: एन (ए/टी/सी/जी), के (जी/टी), आर (ए/जी), वाई (सी/टी), डब् ल् यूवी (जी/ए/सी) ।

लाइसैवायरस प्रजाति तनाव टेम्पलेट प्लाज्मिड (अणु/μL)
RABV GQ 918139.1 २.२४ x 101
LBV EU 293110.1 २.२४ x 102
MOKV KF 155005.1 २.२४ x 101
DUVV EU 293119.1 २.२४ x 101
EBLV-1 EF 157976.1 २.२४ x 101
EBLV-2 KF 155004.1 २.२४ x 101
ABLV GU 992312.1 २.२४ x 100
आईआरकेवी NC_ 020809.1 २.२४ x 101
WCBV NC_ 025377.1 २.२४ x 101
खुव NC_ 025385.1 २.२४ x 103
आरव NC_ 020808.1 २.२४ x 102
शिबीवी NC_ 025365.1 २.२४ x 101
BBLV NC_ 025251.1 २.२४ x 101
IKOV NC_ 018629.1 २.२४ x 105
LLEBV NC_ 031955.1 २.२४ x 103
GBLV NC_ 031988.1 २.२४ x 105
KBLV MF 960865.1 २.२४ x 101
TWBLV MF 472710.1 २.२४ x 101

तालिका 6: की पहचान सीमा नेस्टेड RT-पीसीआर f 18 l वाईसैवाइरस es.

मानक विधि और परिणाम RT-nPCR
सकारात्मक
RT-nPCR
नकारात्मक
सहसंबंध (%)
वसा सकारात्मक
नकारात्मक
१६२
3
0
९४५९
९९.०७

तालिका 7: सहसंबंध नेस्टेड RT-पीसीआर और फैट में इस नैदानिक नमूनों में रैवी का पता लगाना ।

Table 8
तालिका 8: द्वारा नेस्टेड RT-पीसीआर के सत्यापन परिणाम 10 प्रयोगशालाओं ।

Figure 1
चित्रा 1 : 18 का पता लगाने लाइसैवाइरस es द्वारा नेस्टेड RT-पीसीआर । () प्रथम राउंड की पीसीआर का परिणाम । () दूसरे दौर की पीसीआर का परिणाम । एम = डीएल २००० डीएनए मार्कर । लेन 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, आरव, IKOV, BBLV, GBLV, आईआरकेवी, खुव, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, और TWBLV, क्रमशः । लेन 19 = पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण; लेन 20 = पहले दौर की पीसीआर के लिए नकारात्मक नियंत्रण; लेन 21 = दूसरे दौर की पीसीआर के लिए नकारात्मक नियंत्रण । एक सकारात्मक पीसीआर परिणाम पहले दौर में ८४५ बीपी पर एक बैंड और दूसरे दौर की पीसीआर में ३७१ बीपी से पता चलता है । आरव का एम्प् लीकॉन पहले राउंड में नहीं दिख रहा है, बल्कि दूसरे राउंड की पीसीआर (लेन 8) में दिख रहा है, जबकि पहले राउंड में आईकोव का एम्प् लीकॉन दिख रहा है, लेकिन दूसरे राउंड की पीसीआर (लेन 9) में दिखाई नहीं दे रही है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्राइमर दृश्यों के साथ तुलना 18 lyssavirusnoy प्रजातियों के प्राइमर क्षेत्रों में विभेदक न्यूकोटाइडों को दर्शाता है । N127 और N829 बाहरी प्राइमर्स थे, N371F और N371R इनर प्राइमर्स थे । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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वर्तमान में, RABV एक प्रमुख lyssavirus लगभग सभी मानव और चीन में पशु रेबीज के लिए जिंमेदार है, साथ ही साथ अंय देशों में है । इसके अलावा, एक irkv संस्करण पहले २०१२10में पूर्वोत्तर चीन में जिलीन प्रांत में एक एमयूरिन leucogaster चमगादड़ से पहचाना गया था, और यह २०१७11में लियानिंग प्रांत में एक कुत्ते की मौत का कारण बताया गया है । सबसे हाल ही में, एक उपंयास lyssavirvirus, TWBLV, भी ताइवान, चीन में एक जापानी pipistrelle बल्ले से २०१७ में पहचान की थी । इन परिणामों का सुझाव है कि अंय lyssaवायरसों का प्रभावी पता लगाने के लिए भी चमगादड़ जनित lyssaवायरसों के फैल-ओवर को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । इस संबंध में, पैन-lyssavirvirus नेस्टेड आरटी-पीसीआर सबसे संरक्षित एन जीन क्षेत्र लक्ष्यीकरण एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, और परिणाम से पता चला है कि यह प्रभावी ढंग से सभी 16 ictv-अनुमोदित और दो उपंयास lyssavirusnoy प्रजातियों का पता लगाने कर सकते है अब तक की पहचान की, सहित आनुवंशिक रूप से अलग RABVs और चीन में IRKV (आईआरकेवी तनाव पर डेटा नहीं दिखाया गया है) । हालांकि, यह भी गौर करने वाली बात है कि आरव को सिर्फ दूसरे दौर की पीसीआर प्राइमर्स ने ही खोजा था, जबकि आईकोव का पता पहले राउंड की पीसीआर प्राइमर्स (आंकड़ा 1) से ही चल पाया था । इस विसंगति के कारण की जांच करने के लिए, चार प्रवेशिका क्षेत्रों के भीतर सभी 18 lyssaवायरसों के अनुक्रम तुलना आयोजित किया गया था, यह दर्शाता है कि पहले दौर पीसीआर में बाहरी प्राइमर N829 के 3 अंत न्यूकोटाइड टी और 3 में दूसरा न्यूनाभिकोटाइड टी ' दूसरे दौर की पीसीआर में इनर प्राइमर N371F के अंत ARAV (जी) और IKOV (ए) (चित्रा 2) की इसी स्थिति के समान नहीं थे । एक बार प्राइमर के टी N829 को बदलकर जी ऑफ एआरएवी कर दिया गया और प्राइमर के टी N371F को बदलकर आईकोव कर दिया गया तो पीसीआर में दोनों वायरस सफलतापूर्वक पाए गए (डाटा नहीं दिखाया गया) । इस परिणाम लक्ष्य क्षेत्र के सफल प्रवर्धन में प्राइमरों के 3 अंत या निकट अंत न्यूकोटाइड की महत्वपूर्ण भूमिका को दर्शाता है.

नैदानिक निदान और निगरानी के लिए रेबीज वायरस का पता लगाने में विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, ९,६२४ पशु मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों का पिछले 10 वर्षों में वसा और नेस्टेड आरटी-पीसीआर द्वारा समानांतर परीक्षण किया गया था । १६५ नमूनों कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर द्वारा रेबीज सकारात्मक का परीक्षण किया, १६२ वसा द्वारा सकारात्मक के रूप में पाया गया; इसलिए, दो विधियाँ ९९.०७% अनुसार दिखाएँ । इन १६५ नमूनों में पता चला rabvs एशियाई, आर्कटिक से संबंधित में विभिन्न प्रजातियों में वर्गीकृत किया जा सकता है, और कॉस्मोपॉलिटन clades12,13, यह दर्शाता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर rabvs के विभिन्न आनुवंशिक clades को कवर कर सकते हैं । तीन अत्यधिक सड़ा हुआ नैदानिक नमूनों नेस्टेड आरटी-पीसीआर द्वारा सकारात्मक लेकिन वसा द्वारा नकारात्मक परीक्षण किया गया । यह परिणाम प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दर्शाए अनुसार दो अवक्रमित नमूनों के परीक्षण में प्रभावकारिता के मूल्यांकन के अनुरूप है, जो यह दर्शाता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर अत्यधिक सड़ा हुआ नमूनों में विषाणुओं का पता लगाने में वसा की तुलना में अधिक संवेदनशील होता है ।

नेस्टेड आरटी-पीसीआर के कार्य-निष्पादन के लिए यूरोपीय संघ संदर्भ प्रयोगशाला द्वारा आयोजित अंतर्राष्ट्रीय प्रयोगशाला तुलना परीक्षण (आईएमसीटी) में रेबीज के लिए फ्रांस की एजेंसी फॉर फूड, एनवायरमेंटल एंड ऑक्यूपेशनल हैल्थ & सेफ्टी ( ANSES) में २०१०, 12 नमूनों का एक सेट का उपयोग (एक RABV, EBLV-1, EBLV-2, और ABLV सकारात्मक नियंत्रण, एक नकारात्मक नियंत्रण, और सात अंधा नमूने के रूप में) । परीक्षण में, नेस्टेड RT-PCR सफलतापूर्वक एक १००% संगतता के साथ सभी lyssaवायरसों की पहचान की । २०१८ में, विधि को चीन के पशु स्वास्थ्य की राष्ट्रीय तकनीकी मानकीकरण समिति द्वारा रेबीज निदान (GB/T36789-2018) के राष्ट्रीय मानक के रूप में अनुमोदित किया गया था ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास योजना (ग्रांट नंबर 2016YFD0500401) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान प्रतिष्ठान (ग्रांट नंबर ३१३०२०४३) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

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References

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Lyssaवायरसों का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन Polymerase चेन रिएक्शन का मूल्यांकन
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Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

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