Summary
Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.
Abstract
Para detectar o vírus da raiva e outras espécies-membro do gênero lyssavirus dentro da família Rhabdoviridae, a reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa do Pan-lyssavirus (nested RT-PCR) foi desenvolvida para detectar a região conservada do gene do nucleoproteína (N) dos lyssavirus. O método aplica a transcrição reversa (RT) usando o RNA viral como o molde e o oligo (descolamento)15 e os hexâmeros aleatórios como primers para sintetizar o ADN complementar viral (cDNA). Em seguida, o cDNA viral é usado como um modelo para amplificar um fragmento de gene N 845 BP no PCR de primeira rodada usando primers externos, seguido de PCR Nested segundo round para amplificar o fragmento final de 371 BP usando primers internos. Este método pode detectar diferentes clados genéticos de vírus da raiva (rabv). A validação, usando 9.624 espécimes cerebrais de oito espécies animais domésticos em 10 anos de diagnósticos clínicos de raiva e vigilância na China, mostrou que o método tem 100% de sensibilidade e 99,97% de especificidade em comparação com a fluorescente direta teste de anticorpos (FAT), o método padrão-ouro recomendado pela Organização Mundial da saúde (OMS) e pela Organização Mundial para a saúde animal (OIE). Além disso, o método também poderia ampliar especificamente o fragmento de gene N alvo de 15 outras espécies de lyssavirus aprovadas e duas novas no 10º relatório do Comitê Internacional de taxonomia de vírus (ICTV), avaliada por uma detecção mímica de sintetizados N plasmídeos do gene de todos os lyssavirus. O método fornece uma alternativa conveniente ao FAT para o diagnóstico da raiva e foi aprovado como um padrão nacional (GB/T36789-2018) de China.
Introduction
A raiva é uma doença zoonótica mundial causada por vírus dentro do gênero lyssavirus1. Os lissavírus (família Rhabdoviridae) são vírus de RNA de cadeia única negativa com um genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) e a grande proteína ou polimerase (L). Baseado em seqüências do nucleotide do gene de N, distância genética, e testes padrões antigénicos, os lyssavirus foram divididos em 16 espécies, compreendendo o vírus de raiva Classical (RABV) e os vírus raiva-relacionados (RRV): vírus do bastão de Lagos (LBV), vírus de Duvenhage (DUVV ), Mokola Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Mónica bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand Virus (KHUV), West Caucasian bat Virus (WCBV), Shimoni bat Virus (SHIBV), e Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Recentemente, foram identificados dois lissavírus adicionais: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolado do morcego de um Brandt (Myotis brandtii) na finlândia em 2017 e3 de Taiwan e lyssavirus morcego (twblv) isolados de um pipistrelle japonês ( Pipistrellus abramus) em Taiwan, China em 2016 – 20174.
Todos os mamíferos são suscetíveis à raiva; Entretanto, nenhuma lesão patognomônico bruta ou sinais clínicos específicos permitem sua identificação, e o diagnóstico só pode ser feito no laboratório5. O método mais utilizado para o diagnóstico da raiva é a gordura, considerada padrão-ouro tanto pela OMS quanto pela OIE5,6. Não obstante, o FAT pode produzir resultados não confiáveis em amostras degradadas/autolyzed do tecido de cérebro. Adicionalmente, não pode ser usado para ensaiar espécimes fluidos biológicos tais como o líquido cerebrospinal (CSF), a saliva, e a urina, desse modo na maior parte impedindo seu emprego no diagnóstico anterior à morte7. Os testes diagnósticos convencionais alternativos, tais como o teste da infecção da cultura do tecido da raiva (RTCIT) e o teste da inoculação do rato (MIT), exigem diversos dias6, uma desvantagem principal quando um diagnóstico rápido é essencial.
Os vários testes diagnósticos moleculars (por exemplo, a deteção do RNA viral pelo RT-PCR, o PCR-enzima-lig o ensaio da imunoabsorção [PCR-ELISA], a hibridação in situ, e o PCR tempo real) são usados como técnicas rápidas e sensíveis para o diagnóstico da raiva8. A RT-PCR é agora recomendada pela OIE para o diagnóstico rotineiro da raiva, e uma PCR heminested (HN) é descrita no manual de testes de diagnóstico e vacinas para animais terrestres da OIE para detectar todos os lissavírus5. Aqui nós descrevemos um RT-PCR aninhado do Pan-lyssavirus, que permita a deteção específica e sensível de todas as 18 espécies do lyssavirus comparáveis ou excedendo aquela obtida pelo FAT. O princípio do método é um RT do RNA alvo (região conservada do gene do lyssavirus N) no cDNA, seguido pela amplificação do cDNA por duas voltas do PCR. O cDNA sofre o PCR de primeira rodada com primers externos para amplificar um fragmento de 845 BP; Então, o segundo-redondo PCR usa o primeiro-redondo produto do PCR como um molde para amplificar um fragmento da BP 371 com primeiras demão internas. As duas rodadas de PCR aumentam significativamente a sensibilidade do ensaio.
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Protocol
O uso de camundongos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Administrativo de bem-estar animal do Instituto de medicina veterinária militar, a Academia de ciências médicas militares, China (laboratório de cuidados com animais e autorização do Comitê de uso, permitir número JSY-DW-2010-02). Foram seguidas todas as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. extração de RNA
- Extraia o RNA da raiva-tecido de cérebro suspeitado, biópsias da pele, saliva, ou CSF ou da cultura de pilha rabv-contaminada, usando métodos da extração do isothiocyanate-fenol-clorofórmio-baseado do guanidínio ou jogos comercialmente disponíveis da extração do RNA viral. Utilize imediatamente o RNA preparado ou guarde-o a-80 ° c até ser necessário.
2. transcrição reversa do RNA viral
- Retire os reagentes de RT indicados na tabela 1 do congelador, mantenha-os no gelo e descongele-os antes de o utilizar.
- Prepare 12 μL de mistura de reação de RT em um tubo de 0,2 mL de PCR com os reagentes listados na tabela 1. Permitir a pipetagem variações, preparando um volume de Master Mix pelo menos um tamanho de reação maior do que o necessário.
- Adicionar 8 μL de amostra, RNA de controle positivo ou controle negativo para a mistura de reação de RT dentro de uma estação de trabalho de PCR em uma sala de modelo. O controle positivo de RT é o RNA extraído da cultura celular infectada com a cepa fixa de RABV CVS-11 (Challenge Virus Standard-11) e armazenada a-80 ° c. O controle negativo contém RNase-Free ddH2O.
- Misture o conteúdo dos tubos RT por vortexing; em seguida, centrifugue brevemente.
- Coloque os tubos de reacção num termociclador. Configurar o programa de síntese do cDNA com as seguintes condições: 42 ° c para 90 min, 95 ° c por 5 min e 4 ° c em espera. Defina o volume de reacção para 20 μL. Inicie a execução de RT.
3. primeiro-round PCR
- Mantenha os reagentes de PCR listados na tabela 2 no gelo em uma sala limpa até o uso; Então, descongelar e vórtice-los.
- Prepare a mistura PCR de primeira rodada em um tubo de 0,2 mL de PCR com os reagentes listados na tabela 2.
- Adicione uma amostra de 2 μL do cDNA ou do plasmídeo na mistura First-round do PCR dentro de uma estação de trabalho do PCR em um quarto do molde. O controle positivo do PCR é o cDNA CVS-11 preparado como mencionado na etapa 2,3 para o método acima do RT. O controle negativo de PCR é ddH2o.
- Transfira os tubos selados para um termociclador e ciclo de PCR usando os parâmetros listados na tabela 3.
4. PCR da segunda rodada
- Prepare a mistura de PCR da segunda rodada em um tubo de 0,2 mL de PCR usando os reagentes listados na tabela 4.
- Adicionar 2 μL de produto de PCR de primeira rodada na mistura de PCR de segunda rodada. Além disso, inclua ddH2o como um controle negativo da segunda rodada de PCR.
- Realize a ciclagem térmica do PCR usando os mesmos parâmetros que dados na etapa 3,4.
5. análise dos produtos de PCR por eletroforese em géis de agarose
- Prepare um gel de agarose de 1,5% adicionando 1,5 g de agarose a 100 mL de Tris-Acetato-EDTA (TAE) e dissolvendo-o completamente aquecendo-o em um forno de microondas.
- Adicionar brometo de etídio (EB) (em uma concentração final de 0, 1%) ou outra substituição comercial de EB. Despeje o gel no molde e deixe-o solidificar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.
- Prepare as amostras de carga misturando 5 μL de cada produto de PCR com 1 μL de tampão de carga de 6x.
- Carregar as amostras e marcador de DNA adequado separadamente para os poços e executar o gel por aproximadamente 30-45 min em 120 V até que a linha de corante é de aproximadamente 75%-80% para baixo o gel.
- Desligue o poder, desconecte os elétrodos da fonte de energia, e então, remova com cuidado o gel da caixa do gel.
- Use um gel UV que documenta o dispositivo para visualizar e fotografar os fragmentos do ADN.
6. caracterização de Nested RT-PCR
-
6,1. especificidade e sensibilidade para a detecção de 18 plasmís de lissavírus
- Encomendar 18 plasmís comerciais contendo o gene N completo de cada lyssavirus (16 espécies de ICTV e duas espécies novas) para a PCR.
- Calcule o número de cópia do plasmídeo usando o número de Avogadro (Na) e a seguinte fórmula.
[(g/μL de DNA plasmídeo)/(comprimento plasmídeo em BP x 660)] x 6, 22 x 1023 = número de moléculas/μl - Prepare soluções de estoque (2,24 x 109 moléculas/μL) de todos os 18 plasmís em DDH2O.
- Realize 9 10 diluições seriais de todos os 18 plasmídeos em ddH2o. Diluir 10 μL de cada estoque de plasmídeo com 90 μL de DDH2o. Vortex e centrifugador brevemente.
- Realize a amplificação de PCR conforme descrito nas seções 3-5.
- Analise a especificidade e a sensibilidade do PCR aninhado detectando uma série de plasmís do lyssavirus.
-
Determinação do d medição l imit
- Ajuste o título da linhagem de células CVS-11 da estirpe do vírus da raiva para 105,5 tcid50/ml (titer de vírus determinado de acordo com o manual do OIE)5.
- Realize 5 10 diluições seriais de CVS-11 (a solução conservada em estoque é 105,5 tcid50/ml) como descrito na etapa 6.1.4.
- Realize a extração do RNA e os procedimentos aninhados da amplificação de RT-PCR de todas as diluições virais como descritas nas seções 1-5.
-
Compar ison de a RT-PCR aninhado com o "Gold Standard" Fat
- Teste todas as amostras clínicas por RT-PCR aninhada e, em seguida, confirme os resultados com o gene FAT5 e N sequenciamento9.
- Use dados normalizados para uma análise estatística com o SAS 9,1. Use o teste de Kappa e o teste de qui-quadrado de McNemar para uma comparação estatística dos testes de diagnóstico (comando SAS: proc freq; tabela/concordo). Calcule os intervalos de confiança assumindo a distribuição abinomial.
-
Avaliação da eficácia no teste de amostras degradadas
- Expor duas amostras clínicas confirmadas do tecido de cérebro dos cães raioides em 37 ° c.
- Teste as duas amostras em cada dia de exposição em 37 ° c por RT-PCR aninhado, o FAT, e o MIT5.
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Representative Results
Os resultados do RT-PCR aninhado para detectar 18 espécies de lyssavirus são mostrados na Figura 1. Todos os controles positivos de PCR mostraram o esperado 845 BP no primeiro e 371 BP nas amplificações de segunda rodada sem banda no controle negativo. Todos os 18 lyssavirus produziram as 845 e/ou as faixas de 371 BP esperadas, indicando que o RT-PCR aninhado detectou todos os 18 lyssavirus. Dezesseis plasmídeos de lyssavirus tiveram a amplificação eficiente em duas voltas do PCR, mas dois, a saber arav e ikov, tiveram a amplificação na primeira ou segunda rodada PCR. A sensibilidade do método variou na detecção de diferentes plasmículas de lissavírus, com limites variando de 2,24 x 100 a 2,24 x 105 moléculas/μl, conforme mostrado na tabela 6. Essas diferenças podem ser atribuídas às desencontros entre os primers e os modelos devido à diversidade de sequências virais. Além disso, a sensibilidade de detectar o vírus da raiva CVS-11 na cultura de pilha era 102,5 tcid50/ml.
Um total de 9.624 tecidos cerebrais de espécimes clínicos foi testado por RT-PCR aninhado em comparação com o FAT e os resultados estão resumidos na tabela 7, o que mostra que a RT-PCR aninhada apresentou sensibilidade de 100% (ic, 97,75% a 100%) e uma especificidade de 99,97% (IC, 99,91% a 99,99%). O acordo entre os dois métodos foi de 99, 7%. Três testes que eram positivos pelo RT-PCR aninhado mas negativos pelo FAT eram do material clínico altamente deteriorado. Estes três espécimes foram confirmados como o positivo de RABV pelo sequenciamento do gene de N.
A comparação do desempenho do teste na deteção dos dois espécimes do cérebro incubadas em 37 ° c (etapa 6.4.1 do protocolo) indicou que o RT-PCR aninhado poderia eficazmente detectar o vírus em tecidos deteriorados do cérebro pelo menos 17 dias pós-degradação, que é para um período de tempo mais longo quando comparado com somente 7 dias pelo FAT e não mesmo 1 dia pelo MIT. Este resultado mostra que o RT-PCR aninhado é mais sensível na deteção de amostras degradadas do que o FAT e o MIT.
Para validar ainda mais a RT-PCR aninhada, 10 laboratórios de raiva na China foram convidados a realizar testes em um conjunto de espécimes. Destes, oito laboratórios foram fornecidos um jogo de 10 tecidos animais cegos do cérebro de nosso laboratório, incluindo espécimes positivos e negativos de RABV. Os outros dois laboratórios usaram seus próprios espécimes. Todos os espécimes tinham sido arquivados e confirmados pelo FAT previamente. Todos os 10 laboratórios obtiveram resultados por RT-PCR aninhado em 100% de acordo com o FAT, sem falsos-negativos ou falsos-positivos (tabela 8), indicando que a RT-PCR aninhada apresentou alta especificidade e reprodutibilidade.
| Componentes | Volume por reacção (μL) |
| dNTPs (2,5 mM) | 4 |
| Primer aleatório (50 μM) | 1,5 |
| Oligo (dT) 15 (50 μm) | 0,5 |
| Tampão M-MLV (5x) | 4 |
| Transcriptase reversa de M-MLV (200 UI/μL) | 1 |
| RNasin (40 UI/μL) | 1 |
| Volume total | 12 |
Tabela 1: Reagentes de transcrição reversa para síntese de cDNA .
| Componentes | Volume por reacção (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampão de Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Volume total | 48 |
Tabela 2: Reagentes de o PCR da primeira rodada.
| Temperatura | Tempo | Ciclos |
| 94 ° c | 2 minutos | 1 |
| 94 ° c | 30 de s | 35 |
| 56 ° c | 30 de s | 35 |
| 72 ° c | 40 s | 35 |
| 72 ° c | 10 minutos | 1 |
| 4 ° c | ∞ |
Tabela 3: C parâmetros de ycling de a primeira e PCR da segunda rodada.
| Componentes | Volume por reacção (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampão de Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Volume total | 48 |
Tabela 4: Reagentes de o PCR da segunda rodada.
| Nome da cartilha | Detalhes | Direção | Seqüência (5 '-3 ') | Posição do nucleotide | Tamanho do produto | |
| N127 | O primeiro PCR redondo | Frente | ATGTAACNCCTCTACAATGG | -19 ~ 0 | 845bp | |
| N829 | O primeiro PCR redondo | Reverter | GCCCTGGTTCGAACATTCT | 807 ~ 825 | 845bp | |
| N371F | A segunda rodada PCR | Frente | ACAATGGAKKCTGACAARATTG | -6 ~ 15 | 371bp | |
| N371R | A segunda rodada PCR | Reverter | CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC | 345 ~ 367 | 371bp | |
Tabela 5: Primer s equences de a primeira e segunda rodada PCR . Bases degenerados: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).
| Espécies de lyssavirus | Tensão | Plasmídeo do molde (moléculas/μL) |
| RABV | GQ 918139.1 | 2,24 x 101 |
| LBV | EU 293110.1 | 2,24 x 102 |
| MOKV | KF 155005.1 | 2,24 x 101 |
| O DUVV | EU 293119.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-1 | 157976.1 EF | 2,24 x 101 |
| EBLV-2 | KF 155004.1 | 2,24 x 101 |
| ABLV | GU 992312.1 | 2,24 x 100 |
| O IRKV | NC_020809.1 | 2,24 x 101 |
| WCBV | NC_025377.1 | 2,24 x 101 |
| O KHUV | NC_025385.1 | 2,24 x 103 |
| Arav | NC_020808.1 | 2,24 x 102 |
| SHIBV | NC_025365.1 | 2,24 x 101 |
| O BBLV | NC_025251.1 | 2,24 x 101 |
| O IKOV | NC_018629.1 | 2,24 x 105 |
| O LLEBV | NC_031955.1 | 2,24 x 103 |
| O GBLV | NC_031988.1 | 2,24 x 105 |
| KBLV | MF 960865.1 | 2,24 x 101 |
| O TWBLV | MF 472710.1 | 2,24 x 101 |
Tabela 6: Limite de detecção de RT-PCR aninhado o f 18 litros yssavirus es.
| Método padrão e resultado | RT-nPCR Positivo |
RT-nPCR Negativo |
Correlação (%) | |
| Gordura | Positivo Negativo |
162 3 |
0 9459 |
99, 7 |
Tabela 7: Correlação entre RT-PCR aninhado e o Fat no detecção de RABVs em espécimes clínicos.
Tabela 8: Resultados da validação do RT-PCR aninhado por 10 laboratórios.
Figura 1 : Detecção de 18 lyssavirus es por RT-PCR aninhado. (A) o resultado da PCR de primeira rodada. (B) o resultado da PCR de segunda rodada. M = DL 2000 marcador de ADN. Faixas 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, e TWBLV, respectivamente. Pista 19 = controle positivo de PCR; Lane 20 = controle negativo para o PCR de primeira rodada; Lane 21 = controle negativo para a segunda rodada de PCR. Um resultado positivo da PCR mostra uma faixa em 845 BP na primeira rodada e 371 BP na segunda rodada de PCR. O amplicon de ARAV não é visível na primeira rodada, mas visível na segunda rodada PCR (pista 8), enquanto o amplicon de IKOV é visível na primeira rodada, mas não visível na segunda rodada PCR (pista 9). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : A comparação com as seqüências da primeira demão mostra os nucleotídeos diferenciais em regiões da primeira demão de 18 espécies do lyssavirus. N127 e N829 foram primers externos, N371F e N371R foram primers internos. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Atualmente, RABV é um Major lyssavirus responsável por quase toda a raiva humana e animal na China, bem como em outros países. Além, uma variação de IRKV foi identificada primeiramente de um bastão deleucogaster de Murina na província de Jilin em China do nordeste em 201210, e foi relatado para causar a morte de um cão na província de Liaoning em 201711. Mais recentemente, um Lyssavirus novo, TWBLV, foi identificado igualmente de um bastão japonês do pipistrelle em Formosa, China em 2017. Estes resultados sugerem que a deteção eficaz de outros lyssavirus é igualmente importante impedir o derramamento-sobre dos lyssavirus bat-carregados. A este respeito, o Pan-lyssavirus aninhado RT-PCR visando a região mais conservada do gene de N é uma ferramenta muito útil, e os resultados mostraram que ele pode efetivamente detectar todos os 16 ICTV-aprovado e duas espécies de lyssavirus novela identificados até agora, incluindo RABVs geneticamente divergentes e IRKV na China (dados sobre a estirpe IRKV não mostrados). No entanto, também é interessante notar que o ARAV foi detectado apenas pelos primers de PCR de segunda rodada, enquanto o IKOV foi detectado apenas por primers de PCR de primeira rodada (Figura 1). Para investigar a causa desta discrepância, a comparação da seqüência de todos os 18 lyssavirus dentro das quatro regiões da primeira demão foi conduzida, com os resultados que mostram que os 3 ' nucleotide T da extremidade da primeira demão exterior N829 no PCR First-round e no segundo nucleotide T no 3 ' final da cartilha interna N371F no PCR de segunda rodada não foram idênticas às posições correspondentes de ARAV (G) e IKOV (A) (Figura 2). Uma vez que o T da primeira demão N829 foi mudado ao G de ARAV e o T da primeira demão N371F mudado ao a de IKOV, ambos os vírus foram detectados com sucesso no PCR (dados não mostrados). Este resultado demonstra o papel crítico dos nucleotídeos finais ou próximos de 3 ' das primeiras demão na amplificação bem sucedida da região do alvo.
Para avaliar a sensibilidade e a especificidade do método na detecção do vírus da raiva para o diagnóstico e a fiscalização clínicos, 9.624 amostras de tecido cerebral animal foram testadas nos últimos 10 anos pelo FAT e pelo RT-PCR aninhado paralelamente. Das 165 amostras que testaram a raiva positiva por RT-PCR aninhada, 162 foram detectadas como positivas pelo FAT; Portanto, os dois métodos mostram 99, 7% de acordo. Os rabvs detectados nessas amostras de 165 podem ser classificados em diferentes linhagens em clados asiáticos, árcticos e cosmopolitas12,13, indicando que o RT-PCR aninhado pode abranger os vários clados genéticos de rabvs. Três espécimes clínicos altamente deteriorados foram testados positivamente por RT-PCR aninhado, mas negativos pelo FAT. Este resultado é consistente com a avaliação da eficácia no teste de duas amostras degradadas, como mostrado na seção de resultados representativos, indicando que a RT-PCR aninhada é mais sensível do que a FAT na detecção de vírus em espécimes altamente cariados.
O desempenho do RT-PCR aninhado foi confirmado ainda pela participação no teste internacional da comparação do laboratório (ILCT) organizado pelo laboratório de referência da UE para a raiva na agência francesa para a segurança da alimentação, do ambiente e de saúde ocupacional & ( ANSES) em 2010, usando um conjunto de 12 amostras (uma cada um de RABV, EBLV-1, EBLV-2, e ABLV como controles positivos, um controle negativo, e sete amostras cegas). No teste, o RT-PCR aninhado identificou com sucesso todos os lyssavirus com uma consistência de 100%. Em 2018, o método foi aprovado como padrão nacional de diagnósticos de raiva (GB/T36789) pelo Comitê Nacional de normalização técnica de saúde animal da China.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pelo plano nacional de pesquisa e desenvolvimento (Grant no. 2016YFD0500401) e pela Fundação Nacional de ciência natural da China (Grant no. 31302043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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