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Genetics

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Se ha desarrollado una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa de pan-lyssavirus para detectar específicamente todos los lyssavirus conocidos. La validación utilizando muestras cerebrales de rabia de diferentes especies animales demostró que este método tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la prueba de anticuerpos fluorescentes estándar de oro y podría ser utilizado para el diagnóstico de la rabia de rutina.

Abstract

Para detectar el virus de la rabia y otras especies miembro del género lyssavirus dentro de la familia rhabdoviridae, se desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada de pan-lyssavirus (RT-PCR anidada) para detectar la región conservada del gen de la nucleoproteína (N) de los lissavirus. El método aplica la transcripción inversa (RT) utilizando ARN viral como plantilla y oligo (DT)15 y hexámeros tal aleatorios como imprimadores para sintetizar el ADN complementario viral (cDNA). Luego, el cDNA viral se utiliza como una plantilla para amplificar un fragmento de gen 845 BP N en PCR de primera ronda usando imprimadores externos, seguidos por PCR anidada de segunda ronda para amplificar el fragmento final de 371 BP usando imprimadores internos. Este método puede detectar diferentes clados genéticas de virus de la rabia (RABV). La validación, utilizando 9.624 especímenes de cerebro de ocho especies de animales domésticos en 10 años de diagnósticos clínicos de rabia y vigilancia en China, demostró que el método tiene 100% de sensibilidad y 99,97% de especificidad en comparación con la fluorescente directa prueba de anticuerpos (FAT), el método estándar de oro recomendado por la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Organización Mundial de sanidad animal (OIE). Además, el método también podría amplificar específicamente el fragmento genético N objetivo de otras 15 especies aprobadas y dos novelas de lyssavirus en el 10º informe del Comité Internacional sobre taxonomía de virus (ICTV), evaluado por una detección mímica de N plásmidos génicos de todos los lyssaviruses. El método proporciona una alternativa conveniente a FAT para el diagnóstico de la rabia y ha sido aprobado como una norma nacional (GB/T36789-2018) de China.

Introduction

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La rabia es una enfermedad zoonótica mundial causada por virus en el género lyssavirus1. Los lyssavirus (familia rhabdoviridae) son virus de ARN de cadena única negativa con un genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) y la proteína grande o polimerasa (L). Basándose en secuencias de nucleótidos del gen N, la distancia genética y los patrones antigénicos, los lissavirus se han dividido en 16 especies, que comprenden el virus de la rabia clásica (RABV) y los virus relacionados con la rabia (RRV): virus del murciélago de lagos (LBV), virus de Duvenhage (DUVV ), Virus Mokola (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), lyssavirus murciélago australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), lyssavirus de murciélago Bokeloh (BBLV), lyssavirus Gannoruwa bat (GBLV), virus Irkut (IRKV), Khujand virus (KHUV), el virus del murciélago del Cáucaso occidental (WCBV), el virus del murciélago Shimoni (SHIBV), y el lyssavirus del murciélago de Lleida (LLEBV)2. Recientemente, se han identificado dos lyssavirus adicionales: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) aislado de un murciélago de Brandt (Myotis Brandtii) en finlandia en 20173 y lyssavirus murciélago Taiwán (twblv) aislado de un Pipistrelle japonés ( Pipistrellus abramus) en Taiwán, China en 2016 – 20174.

Todos los mamíferos son susceptibles a la rabia; sin embargo, ninguna lesión patognomónica bruta o signos clínicos específicos permiten su identificación, y el diagnóstico sólo se puede hacer en el laboratorio5. El método más ampliamente utilizado para el diagnóstico de la rabia es la grasa, que se considera como el estándar de oro por la OMS y la OIE5,6. Sin embargo, la FAT puede producir resultados poco fiables en muestras de tejido cerebral degradadas/autolizadas. Además, no se puede utilizar para el ensayo de muestras de fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva y la orina, lo que excluye en gran medida su empleo en el diagnóstico de antemortem7. Las pruebas diagnósticas convencionales alternativas, tales como la prueba de infección del cultivo del tejido de la rabia (RTCIT) y la prueba de inoculación del ratón (MIT), requieren varios días6, un inconveniente importante cuando un diagnóstico rápido es esencial.

Varias pruebas de diagnóstico molecular (p. ej., la detección de ARN viral por RT-PCR, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas PCR [PCR-ELISA], hibridación in situ y PCR en tiempo real) se utilizan como técnicas rápidas y sensibles para el diagnóstico de rabia8. La OIE recomienda ahora la RT-PCR para el diagnóstico rutinario de la rabia, y se describe una PCR heminested (HN) en el manual de pruebas diagnósticas y vacunas para animales terrestres de la OIE para detectar todos los lyssavirus5. Aquí describimos un pan-lyssavirus anidado RT-PCR, que permite la detección específica y sensible de las 18 especies de lyssavirus comparables o superiores a las obtenidas por la grasa. El principio del método es un RT del ARN Diana (región conservada del gen del lyssavirus N) en la cDNA, seguida de la amplificación de la cDNA por dos rondas de PCR. El cDNA sufre el PCR de primera ronda con imprimadores externos para amplificar un fragmento de 845 BP; a continuación, el PCR de segunda ronda utiliza el producto PCR de primera ronda como plantilla para amplificar un fragmento de 371 BP con imprimaciones internas. Las dos rondas de PCR aumentan significativamente la sensibilidad del ensayo.

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Protocol

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El uso de ratones en este protocolo fue aprobado por el Comité Administrativo de bienestar animal del Instituto de medicina veterinaria militar, la Academia de ciencias médicas militares, China (autorización del Comité de cuidado de animales de laboratorio y uso, permitir número JSY-DW-2010-02). Se siguieron todas las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y el uso de animales de laboratorio.

1. extracción de ARN

  1. Extracto de ARN de la rabia-sospecha de tejido cerebral, biopsias de piel, saliva, o CSF o de cultivo celular infectado por RABV, utilizando métodos de extracción basados en isotiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio o kits de extracción de ARN viral disponibles comercialmente. Utilice el ARN preparado inmediatamente o guárdelo a-80 ° c hasta que sea necesario.

2. transcripción inversa del ARN viral

  1. Retire los reactivos RT enumerados en la tabla 1 del congelador, manténtelos en hielo y descongele y vórtice antes de usarlos.
  2. Prepare 12 μL de mezcla de reacción RT en un tubo PCR de 0,2 mL con los reactivos enumerados en la tabla 1. Permita variaciones de pipeteo preparando un volumen de mezcla maestra al menos un tamaño de reacción mayor que el requerido.
  3. Añada 8 μL de muestra, ARN de control positivo o control negativo a la mezcla de reacción RT dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo RT es el ARN extraído del cultivo celular infectado con la cepa fija RABV CVS-11 (Challenge virus Standard-11) y almacenada a-80 ° c. El control negativo contiene RNase-Free ddH2O.
  4. Mezclar el contenido de los tubos RT por vortexing; Luego, centrifugar brevemente.
  5. Cargue los tubos de reacción en un termociclador. Configurar el programa de síntesis de cDNA con las siguientes condiciones: 42 ° c para 90 min, 95 ° c para 5 min, y 4 ° c en espera. Ajuste el volumen de reacción a 20 μL. Inicie la ejecución de RT.

3. PCR de primera ronda

  1. Mantener los reactivos de PCR enumerados en la tabla 2 sobre hielo en una sala limpia hasta su uso; entonces, descongelarlos y vórtilos.
  2. Prepare la mezcla de PCR de primera ronda en un tubo de PCR de 0,2 mL con los reactivos enumerados en la tabla 2.
  3. Añadir una muestra de 2 μL de cDNA o plásmido en la mezcla de PCR de primera ronda dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo de PCR es CVS-11 cDNA preparado como se menciona en el paso 2,3 para el método RT anterior. El control negativo PCR es ddH2O.
  4. Transfiera los tubos sellados a un termociclador de PCR y ciclo utilizando los parámetros enumerados en la tabla 3.

4. PCR de segunda ronda

  1. Prepare la mezcla de PCR de segunda ronda en un tubo de PCR de 0,2 mL utilizando los reactivos enumerados en la tabla 4.
  2. Añadir 2 μL de producto de PCR de primera ronda a la mezcla de PCR de segunda ronda. Además, incluya ddH2O como un control negativo del PCR de segunda ronda.
  3. Realice el ciclo térmico de PCR usando los mismos parámetros que los dados en el paso 3,4.

5. Análisis de los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa

  1. Prepare un gel de agarosa al 1,5% añadiendo 1,5 g de agarosa a 100 mL de tris-acetato-EDTA (TAE) y disolviéndola a fondo calentándolo en un horno de microondas.
  2. Añadir bromuro de etidio (EB) (a una concentración final de 0,01%) u otra sustitución comercial de EB. Vierta el gel en el molde y deje que se solidifique a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
  3. Prepare las muestras de carga mezclando 5 μL de cada producto PCR con 1 μL de búfer de carga 6X.
  4. Cargue las muestras y el marcador de ADN adecuado por separado en los pozos y ejecute el gel durante aproximadamente 30-45 min a 120 V hasta que la línea de tinte sea aproximadamente del 75%-80% por el gel.
  5. Apague la alimentación, desconecte los electrodos de la fuente de alimentación, y luego, retire con cuidado el gel de la caja de gel.
  6. Utilice un dispositivo de documentación de gel UV para visualizar y fotografiar los fragmentos de ADN.

6. Caracterización de RT-PCR anidada

  1. 6,1. especificidad y sensibilidad para la detección de 18 plásmidos de lissavirus
    1. Ordene 18 plásmidos comerciales que contengan el gen N completo de cada lyssavirus (16 especies de ICTV y dos especies novedosas) para el PCR.
    2. Calcule el número de copia del plásmido utilizando el número de Avogadro (NA) y la siguiente fórmula.
      [(g/μl de ADN plásmido)/(longitud plásmido en BP x 660)] x 6,022 x 1023 = número de moléculas/μl
    3. Prepare soluciones de stock (2,24 x 109 moléculas/μL) de los 18 plásmidos en DDH2O.
    4. Realizar diluciones seriales de 9 10 veces de los 18 plásmidos en ddH2o. diluir 10 μl de cada material plásmido con 90 ΜL de DDH2o. Vortex y centrifugar brevemente.
    5. Realice la amplificación de PCR como se describe en las secciones 3-5.
    6. Analice la especificidad y la sensibilidad del PCR anidado detectando una serie de plásmidos de lyssavirus.
  2. Determinación de la d etection l imit
    1. Ajustar el título de la cepa del virus de la rabia de la cultura de células CVS-11 a 105,5 tcid50/ml (título del virus determinado de acuerdo con el manual de la OIE)5.
    2. Realizar diluciones en serie 5 10-Fold de CVS-11 (solución de stock es 105,5 tcid50/ml) como se describe en el paso 6.1.4.
    3. Realizar la extracción de ARN y los procedimientos anidados de amplificación RT-PCR de todas las diluciones virales como se describe en las secciones 1-5.
  3. Compar Ison con antelación de la RT-PCR anidada con la grasa "Gold Standard"
    1. Pruebe todas las muestras clínicas mediante RT-PCR anidada y, a continuación, confirme los resultados con la secuenciación de genes FAT5 y N9.
    2. Utilice datos normalizados para un análisis estadístico con SAS 9,1. Utilice la prueba Kappa y la prueba chi-cuadrada de McNemar para una comparación estadística de las pruebas de diagnóstico (mandato SAS: proc FREQ; tabla/acuerdo). Calcule los intervalos de confianza asumiendo la distribución abinomial.
  4. Evaluación de la eficacia en la prueba de muestras degradadas
    1. Exponga dos muestras de tejido cerebral clínico confirmado de perros rabiosos a 37 ° c.
    2. Ensayo de las dos muestras en cada día de exposición a 37 ° c por RT-PCR anidada, el FAT, y el MIT5.

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Representative Results

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Los resultados de la RT-PCR anidada para detectar 18 especies de lyssavirus se muestran en la figura 1. Todos los controles positivos de PCR mostraron el 845 BP esperado en la primera-y 371 BP en las amplificaciones de la segunda ronda sin banda en el control negativo. Los 18 lyssavirus produjeron las bandas 845 y/o 371 BP esperadas, indicando que el RT-PCR anidado detectó los 18 lyssavirus. Dieciséis plásmidos de los lissavirus tuvieron una amplificación eficiente en ambas rondas de PCR, pero dos, a saber, ARAV e IKOV, tenían amplificación en el PCR de primera o segunda ronda. La sensibilidad del método varió en la detección de diferentes plásmidos de lissavirus, con límites que oscilan entre 2,24 x 100 y 2,24 x 105 moléculas/μl, como se muestra en la tabla 6. Estas diferencias pueden atribuirse a las discrepancias entre las imprimadores y las plantillas debido a la diversidad de la secuencia viral. Además, la sensibilidad de detectar el virus de la rabia CVS-11 en el cultivo celular fue de 102,5 tcid50/ml.

Un total de 9.624 tejidos cerebrales de especímenes clínicos fueron probados por RT-PCR anidada en comparación con el FAT y los resultados se resumen en la Tabla 7, que muestra que la RT-PCR anidada tenía una sensibilidad del 100% (ic, 97,75% a 100%) y una especificidad del 99,97% (IC, 99,91% a 99,99%). La concordancia entre los dos métodos fue del 99,07%. Tres pruebas positivas por RT-PCR anidadas pero negativas por la FAT fueron de material clínico altamente deteriorado. Estos tres especímenes fueron confirmados como RABV positivo por la secuenciación de genes N.

La comparación del rendimiento de la prueba en la detección de los dos especímenes cerebrales incubados a 37 ° c (paso 6.4.1 del Protocolo) indicó que la RT-PCR anidada podría detectar eficazmente el virus en los tejidos cerebrales en descomposición durante un mínimo de 17 días después de la degradación, que es para un período de tiempo más largo en comparación con sólo 7 días por el FAT y ni siquiera 1 día por el MIT. Este resultado muestra que el RT-PCR anidado es más sensible en la detección de muestras degradadas que el FAT y el MIT.

Para validar aún más la RT-PCR anidada, se invitó a 10 laboratorios de rabia en China a realizar pruebas en un conjunto de especímenes. De estos, ocho laboratorios fueron provistos de un conjunto de 10 tejidos cerebrales animales ciegos de nuestro laboratorio, incluyendo muestras positivas y negativas de RABV. Los otros dos laboratorios utilizaron sus propios especímenes. Todos los especímenes habían sido archivados y confirmados por el FAT previamente. Los 10 laboratorios obtuvieron resultados por RT-PCR anidada en 100% de acuerdo con la FAT, sin falsos negativos o falsos positivos (Tabla 8), indicando que el RT-PCR anidado tenía una alta especificidad y reproducibilidad.

Componentes Volumen por reacción (μL)
dNTPs (2,5 mM) 4
Imprimación aleatoria (50 μM) 1,5
Oligo (dT) 15 (50 μm) 0,5
Búfer M-MLV (5x) 4
M-MLV transcriptasa inversa (200 UI/μL) 1
RNasin (40 UI/μL) 1
Volumen total 12

Tabla 1: Reactivos de la transcripción inversa para la síntesis de cDNA .

Componentes Volumen por reacción (μL)
dNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/μL) 0,3
Búfer Taq (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
DD H2O 39,7
Volumen total 48

Tabla 2: Reactivos de el PCR de primera ronda.

Temperatura hora Ciclos
94 ° c 2 min 1
94 ° c 30 s 35
56 ° c 30 s 35
72 ° c 40 s 35
72 ° c 10 min 1
4 ° c

Tabla 3: C parámetros de yadherencia de el primer y PCR de segunda ronda.

Componentes Volumen por reacción (μL)
dNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/μL) 0,3
Búfer Taq (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
DD H2O 39,7
Volumen total 48

Tabla 4: Reactivos de el PCR de segunda ronda.

Primer nombre Detalles Dirección Secuencia (5 '-3 ') La posición de nucleótido Tamaño del producto
N127 El PCR de primera ronda Adelante ATGTAACNCCTCTACAATGG -19 ~ 0 845bp
N829 El PCR de primera ronda Marcha atrás GCCCTGGTTCGAACATTCT 807 ~ 825 845bp
N371F El PCR de segunda ronda Adelante ACAATGGAKKCTGACAARATTG -6 ~ 15 371bp
N371R El PCR de segunda ronda Marcha atrás CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC 345 ~ 367 371bp

Tabla 5: Primer s ecuencias de el primer y segunda ronda PCR . Bases degeneradas: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

Las especies de lyssavirus Cepa Plásmido de la plantilla (moléculas/μL)
RABV GQ 918139.1 2,24 x 101
Lbv EU 293110.1 2,24 x 102
MOKV KF 155005.1 2,24 x 101
DUVV EU 293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 KF 155004.1 2,24 x 101
ABLV GU 992312.1 2,24 x 100
IRKV NC_020809.1 2,24 x 101
WCBV NC_025377.1 2,24 x 101
KHUV NC_025385.1 2,24 x 103
Arav NC_020808.1 2,24 x 102
SHIBV NC_025365.1 2,24 x 101
BBLV NC_025251.1 2,24 x 101
IKOV NC_018629.1 2,24 x 105
LLEBV NC_031955.1 2,24 x 103
GBLV NC_031988.1 2,24 x 105
KBLV MF 960865.1 2,24 x 101
TWBLV MF 472710.1 2,24 x 101

Tabla 6: Límite de detección de RT-PCR anidada o f 18 l yssavirus es.

Método y resultado estándar RT-nPCR
Positivo
RT-nPCR
Negativo
Correlación (%)
Grasa Positivo
Negativo
162
3
0
9459
99,07

Tabla 7: Correlación entre RT-PCR anidada y la FAT en el detección de RABV en muestras clínicas.

Table 8
Tabla 8: Resultados de validación de RT-PCR anidados por 10 laboratorios.

Figure 1
Figura 1 : Detección de 18 lyssavirus es al RT-PCR anidada. (A) el resultado del PCR de primera ronda. (B) el resultado del PCR de segunda ronda. M = marcador de ADN DL 2000. Carriles 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, y TWBLV, respectivamente. Carril 19 = control positivo PCR; carril 20 = control negativo para el PCR de primera ronda; carril 21 = control negativo para el PCR de segunda ronda. Un resultado positivo de PCR muestra una banda a 845 BP en la primera ronda y 371 BP en el PCR de segunda ronda. El amplicón de ARAV no es visible en la primera ronda, pero visible en el PCR de segunda ronda (carril 8), mientras que el amplicón de IKOV es visible en la primera ronda, pero no es visible en el PCR de segunda ronda (carril 9). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : La comparación con las secuencias de imprimación muestra los nucleótidos diferenciales en las regiones de imprimación de 18 especies de lyssavirus. N127 y N829 eran imprimadores externos, N371F y N371R eran imprimadores internos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Actualmente, RABV es un lissavirus importante responsable de casi toda la rabia humana y animal en China, así como en otros países. Además, una variante de IRKV fue identificada por primera vez a partir de un murciélago Murina leucogaster en la provincia de Jilin en el noreste de China en 201210, y se ha reportado que causó la muerte de un perro en la provincia de Liaoning en 201711. Más recientemente, un nuevo lyssavirus, TWBLV, también fue identificado a partir de un murciélago japonés Pipistrelle en Taiwán, China en 2017. Estos resultados sugieren que la detección efectiva de otros lyssavirus también es importante para prevenir el derrame de los lyssavirus transmitidos por murciélagos. En este sentido, el pan-lyssavirus anidado RT-PCR que apunta a la región del gen N más conservada es una herramienta muy útil, y los resultados han demostrado que puede detectar eficazmente todas las 16 especies de lyssavirus aprobadas por la ICTV y dos novelas nuevas identificadas hasta el momento, incluyendo RABV y IRKV divergentes genéticamente en China (no se muestran los datos sobre la cepa IRKV). Sin embargo, también es interesante notar que ARAV fue detectado sólo por los Imprimaciones de PCR de segunda ronda, mientras que ikov fue detectado sólo por Imprimaciones de PCR de primera ronda (figura 1). Para investigar la causa de esta discrepancia, se realizó una comparación secuencial de los 18 lissavirus dentro de las cuatro regiones de imprimación, con los resultados que muestran que el nucleótido de 3 ' final T de imprimación externa N829 en el PCR de primera ronda y el segundo nucleótido T en el 3 ' final de la imprimación interna N371F en el PCR de segunda ronda no eran idénticos a las posiciones correspondientes de ARAV (G) y IKOV (A) (figura 2). Una vez que la T de primer N829 fue cambiada a la G de ARAV y la T de primer N371F cambiado a la a de IKOV, ambos virus se detectaron con éxito en PCR (datos no mostrados). Este resultado demuestra el papel crítico de los nucleótidos finales de 3 ' o de extremo cercano de cebadores en la amplificación exitosa de la región de destino.

Para evaluar la sensibilidad y especificidad del método en la detección del virus de la rabia para el diagnóstico clínico y la vigilancia, 9.624 muestras de tejido cerebral animal fueron probadas en los últimos 10 años por la FAT y RT-PCR anidada en paralelo. De las 165 muestras que probaron la rabia positiva por RT-PCR anidada, 162 fueron detectadas como positivas por la FAT; por lo tanto, los dos métodos muestran 99,07% de acuerdo. Los RABV detectados en estas 165 muestras podrían clasificarse en diferentes linajes en asiáticos, relacionados con el Ártico y en los clados cosmopolitas12,13, lo que indica que el RT-PCR anidado puede abarcar los diversos clados genéticos de los rabos. Tres especímenes clínicos altamente deshilachados fueron probados positivamente por la RT-PCR anidada pero negativas por la FAT. Este resultado es consistente con la evaluación de la eficacia en la prueba de dos muestras degradadas como se muestra en la sección de resultados representativos, indicando que la RT-PCR anidada es más sensible que la FAT en la detección de virus en especímenes altamente deteriorados.

El rendimiento de la RT-PCR anidada fue confirmado por la participación en el ensayo internacional de comparación de laboratorios (ILCT) organizado por el laboratorio de referencia de la UE para la rabia en la agencia francesa de salud alimentaria, ambiental y ocupacional & seguridad ( ANSES) en 2010, utilizando un conjunto de 12 muestras (una cada una de RABV, EBLV-1, EBLV-2, y ABLV como controles positivos, un control negativo, y siete muestras cegados). En la prueba, el RT-PCR anidado identificó con éxito todos los lyssavirus con una consistencia del 100%. En 2018, el método fue aprobado como un estándar nacional de diagnósticos de rabia (GB/T36789-2018) por el Comité Nacional de normalización técnica de sanidad animal de China.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El estudio fue apoyado por el plan nacional clave de investigación y desarrollo (Grant Nº 2016YFD0500401) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant Nº 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

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References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses
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Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

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