Utvärdering av en Universal kapslad omvänd transkription polymerase kedje reaktion för detektion av Lyssaviruses
Summary
Ett Pan-lyssavirus kapslade omvänd transkription polymeras kedje reaktion har utvecklats för att upptäcka specifikt alla kända lyssaviruses. Validering med hjälp av rabieshjärnprover av olika djur arter visade att denna metod har en känslighet och specificitet som motsvarar den guldmynt standard fluorescerande anti kropps test och kan användas för rutinmässig rabies diagnos.
Abstract
För att upptäcka rabiesvirus och andra medlems arter av släktet lyssavirus inom familjen Rhabdoviridae, utvecklades Pan-lyssavirus kapslade omvänd transkription polymeras kedje reaktion (kapslade RT-PCR) för att upptäcka den bevarade regionen av nukleoproteingenen (N) hos lyssaviruses. Metoden tillämpar omvänd transkription (RT) med hjälp av viral RNA som mall och oligo (DT)15 och slumpmässiga multihexamererna som primers för att syntetisera viral kompletterande DNA (cDNA). Sedan, den Viral cDNA används som en mall för att förstärka en 845 BP N genfragment i första omgången PCR med yttre primers, följt av andra omgången kapslade PCR att förstärka den slutliga 371 BP fragment med inre primers. Denna metod kan detektera olika genetiska klader av rabiesvirus (RABV). Valideringen, med hjälp av 9 624 hjärnprover från åtta inhemska djur arter i 10 år av kliniska rabies diagnoser och övervakning i Kina, visade att metoden har 100% känslighet och 99,97% specificitet i jämförelse med den direkta fluorescerande anti kropps test (FAT), den guldmynt standard metod som rekommenderas av Världshälso organisationen (WHO) och världs organisationen för djur hälsa (OIE). Dessutom kan metoden också specifikt förstärka riktade N genfragment av 15 andra godkända och två nya lyssavirus arter i den 10: e rapporten från internationella kommittén för taxonomi av virus (ICTV) som utvärderats av en härma upptäckt av syntetiserade N-genplasmider av alla lyssaviruses. Metoden ger ett bekvämt alternativ till FAT för rabies diagnos och har godkänts som en nationell standard (GB/T36789-2018) i Kina.
Introduction
Rabies är en världs omspännande zoonotisk sjukdom orsakad av virus inom släktet lyssavirus1. Lyssaviruses (familjen Rhabdoviridae) är Single-negativa-Stranded RNA-virus med en cirka 12 KB genom att kodar fem proteiner: N, fosfoprotein (P), Matrix protein (M), glykoprotein (G), och det stora proteinet eller polymeras (L). Baserat på nukleotidsekvenser av N-genen, genetiska avstånd och antigena mönster har lyssaviruserna delats in i 16 arter, bestående av klassisk rabiesvirus (RABV) och rabiesrelaterade virus (RRV): Lagos bat-virus (LBV), Duvenhage-virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), australisk fladdermuslyssavirus (ABLV), Aravan-virus (ARAV), Ikoma-virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut-virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), West kaukasiska bat virus (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), och Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Nyligen har ytterligare två lyssaviruser identifierats: kotalahti bat lyssavirus (kblv) som Isoler ATS från en Brandt fladdermus (Myotis brandti) i Finland 20173 och taiwanesiska bat lyssavirus (twblv) isolerade från en japansk pipistrelle ( Pipistrellus abramus) i Taiwan, Kina 2016 – 20174.
Alla däggdjur är mottagliga för rabies; emellertid, inga grova patognomonic lesioner eller specifika kliniska tecken tillåter dess identifiering, och diagnos kan endast göras i laboratoriet5. Den mest använda metoden för rabies diagnos är fettet, som anses vara den gyllene standarden av både WHO och OIE5,6. Ändå kan FAT producera opålitliga resultat på degraderad/autolyzed hjärn vävnad prover. Dessutom, det kan inte användas för att assay biologiska vätske preparat såsom cerebrospinalvätska (CSF), saliv, och urin, vilket i hög grad utesluter sin anställning i veterinärbesiktning diagnos7. Alternativa konventionella diagnostiska tester, såsom rabies vävnads odling infektion test (RTCIT) och musen inympnings test (MIT), kräver flera dagar6, en stor nackdel när en snabb diagnos är viktigt.
Olika molekyl ära diagnostiska tester (t. ex. detektion av viral RNA med RT-PCR, PCR-enzymlänkade immunsorbent assay [PCR-ELISA], in situ hybridisering och realtids-PCR) används som snabba och känsliga tekniker för rabiesdiagnostik8. RT-PCR rekommenderas nu av OIE för rutinmässig rabiesdiagnostik, och en heminested (HN) PCR beskrivs i OIE: s manual för diagnostiska tester och vacciner för land levande djur för att detektera alla lyssaviruser5. Här beskrivs en kapslad RT-PCR med Pan-lyssavirus, som möjliggör en specifik och känslig detektion av alla 18 lyssaviruter som är jämförbara med eller överträffar den som erhålls genom FAT. Principen för metoden är en RT av mål-RNA (bevaras region av lyssavirus N genen) i cDNA, följt av amplifiering av cDNA med två omgångar av PCR. CDNA genomgår den första omgången PCR med yttre primers att förstärka en 845 BP fragment; sedan, den andra omgången PCR använder den första omgången PCR-produkt som en mall för att förstärka en 371 BP fragment med inre primers. De två omgångarna av PCR ökar signifikant känsligheten hos analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
För närvarande är RABV en stor lyssavirus som ansvarar för nästan alla människor och djur rabies i Kina, liksom i andra länder. Dessutom identifierades en IRKV-variant först från en Murina leucogaster bat i Jilin-provinsen i nordöstra Kina i 201210, och det har rapporter ATS orsaka en hunds död i Liaoning-provinsen i 201711. Senast, en roman lyssavirus, TWBLV, identifierades också från en japansk pipistrelle bat i Taiwan, Kina i 2017. Dessa re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av den nationella centrala forsknings-och utvecklings planen (Grant No. 2016YFD0500401) och Kinas nationella Naturvetenskaps stiftelse (Grant No. 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
