Summary
Vi demonstrere syntesen af fusogenic porøs silicium nanopartikler til effektiv in vitro- og in vivo oligonukleotid levering. Porøs silicium nanopartikler er lastet med siRNA til kernen, som er belagt med fusogenic lipider gennem ekstrudering at danne skallen. Målretning gruppe functionalization og partikel karakterisering er inkluderet.
Abstract
Med fremkomsten af genterapi, er udviklingen af en effektiv in vivo nukleotid-nyttelast levering system blevet parallel import. Fusogenic porøs silicium nanopartikler (F-pSiNPs) har for nylig demonstreret høj in vivo genhæmning effektivitet på grund af sin høje oligonukleotid lastning kapacitet og unikke cellulære optagelse pathway, der undgår endocytose. Syntesen af F-pSiNPs er en multi-trins proces, der omfatter: (1) indlæsning og forsegling af oligonukleotid nyttelast i silicon porer; (2) samtidige belægning og dimensionering af fusogenic lipider omkring porøs silicium kerner; og (3) konjugation af målretning peptider og vask for at fjerne overskydende oligonukleotid, silicium debris og peptid. Den partikel størrelse ensartethed er præget af dynamisk lysspredning, og dens kerne-shell struktur kan verificeres ved transmissions Elektron Mikroskopi. Fusogenic optagelse er valideret ved at indlæse en lipofile farvestof, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DiI), i fusogenic lipid tolagede og behandler det til celler in vitro-at observere for plasma membran farvning endocytic lokaliseringer. Målretning og in vivo gene silencing efficacies var tidligere tal i en musemodel af Staphylococcus aureus lungebetændelse, hvori den målretning peptid forventes at hjælpe F-pSiNPs til hjem til infektionsstedet. Ud over dets anvendelse i S. aureus infektion, kan F-pSiNP system bruges til at levere enhver oligonukleotid for genterapi for en bred vifte af sygdomme, herunder virusinfektioner, kræft og autoimmune sygdomme.
Introduction
Genterapi modulerer specifikke genekspression for at opnå en terapeutisk resultatet. Mange værktøjer til gen graduering er blevet opdaget og undersøgt, herunder ribonukleinsyre interferens (RNAi) ved hjælp af oligonukleotider (f.eks. korte interfererende RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nukleaser (f.eks. zink finger, TALENS)7,8, og CRISPR/Cas9 systems9,10. Mens hver værktøjets virkningsmekanisme er forskellig, skal alle værktøjerne nå cellens cytoplasma eller kerne at være aktive. Som sådan, mens disse værktøjer har vist sig for at fremkalde signifikant effekt i modulerende genekspression in vitro, lider in vivo effekten af ekstracellulære og intracellulære forhindringer. Skyldes, at værktøjerne er af biologisk oprindelse, findes mange enzymer og clearance systemer i vores krop, der har evnen til at nedbryde eller fjerne fremmede molekyler11. Selv i tilfældet lider at værktøjerne nå målcellen, de af endocytose; en tilstand af cellulære optagelse, der indkapsler og fælder værktøjer i sure maven-lignende blærer, der nedbrydes eller udvise værktøjer ud af cellen. Undersøgelser har faktisk vist sig at lipid nanopartikler er endocytosed via macropinocytosis, hvorfra omkring 70% af siRNA er exocytosed fra celler inden for 24 timer af optagelsen12,13. Fleste af de resterende siRNA er nedbrudt gennem den lysosomale vej, og i sidste ende kun 1-2% af den siRNA, der i første omgang kommer ind i cellen med nanopartikler opnå endosomal undslippe underkastes potentielt RNAi13,14 .
Vi har for nylig udviklet fusogenic porøs silicium nanopartikler (F-pSiNPs), har en siRNA-loaded kerne består af porøs silicium nanopartikler, og en fusogenic lipid shell15. F-pSiNPs præsentere tre store fordele i forhold til andre konventionelle oligonukleotid levering systemer: (1) en fusogenic lipid belægning, som gør det muligt for partikler til at omgå endocytose og levere hele nyttelasten direkte i cellen cytoplasma (versus 1-2% opnået ved endocytosed partikler13,14) (figur 1); (2) høje masse lastning af siRNA i pSiNPs (> 20 wt % i forhold til 1-15 wt % af konventionelle systemer)15, der hurtigt nedbrydes i cytoplasma (når core partikler kaste lipid belægning via fusogenic optagelse) for at frigive siRNA; og (3) målretning peptid konjugation for selektiv homing til ønskede celletyper in vivo.
F-pSiNP-systemet har demonstreret betydelige genhæmning effektivitet (> 95% in vitro-; > 80% in vivo) og efterfølgende terapeutiske effekt i en alvorlig musemodel af S. aureus lungebetændelse; resultaterne af som blev offentliggjort tidligere15. Den komplekse struktur af F-pSiNP system kræver dog fine håndtering og finjusteres optimering til at generere ensartet og stabil nanopartikler. Formålet med dette arbejde er således, at fremlægge en grundig protokol samt optimeringsstrategier for syntese, functionalization og karakterisering af F-pSiNPs anvendes i målrettet levering af siRNAs til potente gene silencing effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sammenfatning af porøs silicium nanopartikler (pSINPs)
Forsigtig: Brug altid forsigtig, når du arbejder med flussyre (HF). Følg alle sikkerheds guider ifølge sin sikkerhedsdatablad (SDS), håndtere enhver HF-indeholdende kemikalier i et stinkskab og bære passende personlige værnemidler (PPE, dobbelt handsker med butyl handsker på ydersiden, butyl forklæde med laboratoriekittel nedenunder, ansigt skjold med beskyttelsesbriller nedenunder). Alle universiteter og R & D laboratorier kræver specifik uddannelse på HF sikkerhed før brug. Forsøg ikke at arbejde med HF uden forudgående godkendelse af din lokale lab sikkerhedskoordinator, som yderligere sikkerhedsforanstaltninger ikke beskrevet her er påkrævet.
-
Forberedelse af ætsning løsninger
- For at gøre den 3:1 HF løsning for ætsning (bruges i trin 1.3 og 1.4), Fyld en plastik er uddannet cylinder med 30 mL vandig 48% HF og 10 mL af absolut ethanol (EtOH). Løsningen skal være indeholdt i høj densitet plast (fx HDPE), som HF opløser glas.
- For at lave en 1:29 eksamen HF løsning for lift-off (brugt i trin 1,5), Fyld en plastik cylinder med 1 mL vandig 48% HF og 29 mL absolut ethanol. Løsningen skal være indeholdt i høj densitet plast (fx HDPE), som HF opløser glas.
- Gør 1 M KOH løsning i 10% EtOH for overskydende pSi opløsning (bruges i trin 1.3 og 1.5).
-
Opsætning af cellen etch
- I en Teflon etch celle med en 8,6 cm2 etch godt (område beregnes ved at måle diameteren af silicium overfladen tilgængelig for ætsning inden for o-ringen, og beregning af område a = πr2), sted i faldende rækkefølge (figur 2a): (1) den Teflon celle øverst; (2) en O-ring; (3) et kvart stykke enkelt krystal (1 0 0) - orienteret p ++ - type silicium wafer skåret i kvarte (ved hjælp af en diamant cutter); (4) aluminiumsfolie; og (5) Teflon celle base med skruer forsigtigt strammede for at forhindre lækage.
- Fyld godt med EtOH. Tag en tør og sæt i revne mellem Teflon celle øverst og base. Hvis tørre er tør efter udtagning, er cellen etch forseglet. Hvis våd, cellen er utæt, og spænd yderligere skruerne indtil forseglet.
-
Electropolishing silicium wafer
- Bringe den forsamlede etch celle i et stinkskab.
- Fyld godt med 10 mL 3:1 HF løsning.
- Tilslut den positive bly til aluminiumsfolie (elektrode) fra cellen etch og Tilslut negative kundeemnet til platin spolen (Counter elektrode) nedsænkes i opløsningen 3:1 HF af cellen etch at fuldføre banen (figur 2b).
- Køre en nuværende konstant på 50 mA cm-2 til 60 s. Når etch er færdig, fjernes cellen fra kredsløbet, og skyl ud den 3:1 HF omhyggeligt ved hjælp af en sprøjte. Skyl med EtOH tre gange.
- Opløse væk det ætsede lag ved at fylde godt langsomt med 10 mL 1 M KOH. Vent indtil den boblende aftager.
- Skyl ud KOH med vand tre gange, og derefter med EtOH tre gange.
-
Elektrokemisk ætsning porøse lag i silicon wafer
- Køre en vekselstrøm med en firkantet bølgeform, med lavere current density af 50 mA/cm2 for 0,6 s og høj strømtæthed 400 mA/cm2 for 0,36 s gentages for 500 cyklusser.
- Når etch er færdig, fjernes cellen fra kredsløbet, og skyl ud den 3:1 HF omhyggeligt ved hjælp af en sprøjte. Skyl med EtOH tre gange.
-
Løft-off det porøse lag fra silicon wafer
- Fyld godt med 10 mL af 1:29 HF løsning.
- Køre en konstant 3,7 mA/cm2 for 250 s. Når etch er færdig, fjernes cellen fra kredsløbet. PSi lag kan have synlige krusninger med angivelse af udstationering fra krystallinsk silicium wafer. Forsigtigt vaske ud 1:29 HF løsning og skyl med EtOH tre gange, derefter med vand tre gange.
- Ved hjælp af en pipette tip, fast knæk omkredsen af laget pSi for fuldstændig løsrivelse. Bruger EtOH, etch indsamle pSi fragmenter (chips) fra Teflon celle i en vejning båd. Overføre chips til et hætteglas. PSi-chips kan opbevares ved stuetemperatur i EtOH i over 6 måneder til opbevaring.
- Opløse væk enhver resterende porøs silicium på wafer ved at fylde godt langsomt med 10 mL 1 M KOH. Vent indtil den boblende aftager.
- Skyl ud KOH med vand tre gange, og derefter med EtOH tre gange.
- Gentag trin 1,3-1,5 indtil hele wafer tykkelse har været ætset.
-
Sonicating porøse lag for nanopartikel dannelse
- Erstatte opløsningsmidler af hætteglasset indeholdende pSi chips fra EtOH til 2 mL Deioniseret vand.
- Fast lukke fælles landbrugspolitik, og forsegle bruger parafilm.
- Sted glasset vial i en sonikator bad og suspenderet så omfanget af pSi chips er helt neddykket under overfladen.
- Læg instrumenterne i ultralydsbad i 12 timer ved 35 kHz og RF power af 48W. For at forhindre vandtab af betydelige under sonikering, placere en målekolbe fyldes med vand, omvendt så at åbningen af kolben rører overfladen af vandbadet.
- Placer hætteglasset på en flad overflade for 1 h at tillade større partikler til at slå sig ned i bunden. Indsamle supernatanten ved hjælp af en pipette; suspensionen indeholder sub-100 nm pSiNPs.
2. forberedelse af fusogenic lipid film
-
Forberedelse af lipid stamopløsninger
- I et stinkskab, gøre 10 mg/mL bestande af lipider af hydrating DMPC, DSPE-PIND-MAL og DOTAP lipider i chloroform. Disse stamopløsninger kan opbevares ved-20 ° C i op til 6 måneder under stramme parafilm segl.
-
At lave fusogenic lipid film
Bemærk: Fusogenic sammensætning er lavet af lipider, DMPC, DSPE-PIND og DOTAP, på den molære forhold mellem 76.2:3.8:20 og 96.2:3.8:0, henholdsvis.- Bland 72.55 μL DMPC, 15.16 μL af DSPE-PIND og 19.63 μL af DOTAP når der afpipetteres i et hætteglas.
- Valgfrit: Fluorescerende mærkning af lipid belægning, derudover tilføje 20 µL af DiI opløst i EtOH ved en koncentration på 1 mg/mL.
- Placer hætteglasset i et stinkskab med en løs hætte til at tillade chloroform til at fordampe natten over. Tørrede filmen vil være en overskyet hard gel-lignende stof i bunden af hætteglasset.
3. påfyldning og forsegling af siRNA i pSiNPs
-
Forberedelse af calciumchlorid lastning lager
- 1.11 g CaCl opløses2 i 10 mL af RNAse-fri vand at gøre en 2 M CaCl2 løsning.
- Centrifugeres løsning på > 10.000 x g i 1 min. at bilægge aggregater og indsamle supernatanten ved hjælp af en pipette. Alternativt, opløsningen filtreres gennem et 0,22 µm filter.
-
Forberedelse af siRNA lastning lager
- Hydrat eller fortyndes siRNA til 150 µM i RNAse-fri vand. Denne stamopløsning kan blive aliquoted og holdes frossen på-20 ° C i mindst 30 dage, i betragtning af at det ikke undergår hyppige fryse-tø cykler.
-
Lastning siRNA i pSiNPs med calciumchlorid
- Forberede en Ice sonikering bad.
- Under 15 min ultralydbehandling, forsigtigt pipette 150 µL af siRNA og 700 µL af 2 M CaCl2 til 150 µL af pSiNP. Sørg for at lade låget af microcentrifuge rør åben for gas generation.
- Fjerne røret indeholder 1 mL af siRNA-loaded calcium belagt pSiNPs fra sonikator.
4. belægning siRNA-loaded pSiNPs med fusogenic lipider
-
Forberedelse af Liposom ekstrudering kit
- Udfylde et stort bægerglas med Deioniseret vand. Sættetid 1 polycarbonat membran (200 nm porerne), og 4 filter understøtter af flydende dem på vandoverfladen. Samle Liposom ekstrudering kit ved at følge producentens anvisninger
-
Hydrating lipid film med siRNA-loaded pSiNps
- Hydrat tørrede lipid filmen i hætteglas med 1 mL af siRNA-loaded calcium belagt pSiNPs fremstillet af trin 3.3.3. Der afpipetteres indtil alle lipider film har ophævet fra bunden af hætteglasset og har blandet i en overskyet homogene løsning.
- Placer en magnetisk omrøring bar i hætteglasset, og placere hætteglas på en varmeplade til at opvarme partikler til 40 ° C (eller høj nok over lipider fase transformation temperatur til at opretholde lipider i den mere fluidic flydende krystal fase) mens magnetisk omrøring løsning til 20 min.
-
Ekstrudering af lipid-belagt pSiNPs størrelse kontrol
- Opsug 1 mL af lipid-belagt pSiNP-siRNA løsning i ekstrudering sprøjten. Indsæt en tom sprøjte på den ene side af ekstruder, og den fyldte sprøjte i anden enden.
- Begynde ekstrudering ved at trykke stemplet langsomt at skubbe partiklerne fra en sprøjte, gennem polycarbonat membranen, og i den anden. Gentag 20 gange. Hvis stemplet sidder fast, kan blive tilstoppet filter og membran. Skil ekstruder og erstatte membran og filter understøtter. Hvis problemet fortsætter, fortyndes partikler indtil tilstopning er håndterbare.
- Indsamle de ekstruderet partikler ind i et microcentrifuge rør.
5. konjugation af målretning peptider
-
De tråddannende målretning peptid til lipid belægning
- Forberede peptid bestand med en 1 mg/mL peptid koncentration i RNAse-fri vand.
- I det microcentrifuge rør indeholdende fusogenic tilføje lipid-belagt pSiNPs, 100 µL 1 mg/mL peptid materiel og afpipetteres forsigtigt. Holde røret statisk ved stuetemperatur i 20 min. (alternativt > 2 h ved 4 ° C).
- For at fjerne overskydende peptid eller siRNA og andre hjælpestoffer, vaske i en 30 kDa centrifugal filter af spinning på 5.000 x g ved 25 ° C i 1 h. Centrifuge to gange mere med 1 mL PBS under den samme indstilling.
- Resuspend endelige peptid-konjugeret fusogenic lipid-belagt pSiNPs i PBS på den ønskede koncentration. Partiklerne kan nu blive aliquoted og frosne ved-80 ° C til opbevaring af mindst 30 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket syntese af fusogenic pSiNPs skal producere en homogen, lidt uigennemsigtig løsning (figur 3a). Undladelse af at optimere forholdet og koncentration af pSiNPs: siRNA: CaCl2 kan føre til sammenlægning efter indlæsning (figur 3b). Da partiklerne er ekstruderet gennem 200 nm membraner, hydrodynamiske gennemsnitsdiameteren på den fusogenic pSiNPs målt ved DLS bør være ca. 200 nm, og den gennemsnitlige zeta-potentielle ca + 7 mV som vist i figur 4. Efter overflade modifikation med målretning peptider, forhøjes den samlede diameter for at være under 230 nm, og den gennemsnitlige zeta potentiale faldt ned til-3.4 mV15. Enhver omfattende afvigelse fra ekstrudering størrelse er betegnende for mislykkede ekstrudering (dpartikel >> dekstrudering), eller kunne ikke indlæses (dpartikel << dekstrudering). Sammenlægninger kan også kvantificeres ved hjælp af DLS. Desuden, de frosne delprøver skal optøs kun én gang, som gentagne fryse-tø cykler forstyrre lipid membranen og intraparticular fusion og sammenlægning (figur 4). Som det fremgår af figur 4a , kan fusogenic pSiNPs gemt i 30 dage og optøet uden at forårsage strukturelle ændringer. Men, gentagne fryse-tø cykler af en enkelt alikvot forårsage alvorlige sammenlægning (d >> 1.000 nm) og senest 4 dage efter den daglige cyklus (figur 4b), derfor anbefales det at partiklerne være aliquoted til engangsbrug diskenheder.
Fusion kan bekræftes ved mærkning fusogenic lipider med den lipofile DiI (trin 2.2.2), og observere in vitro-lokalisering ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Figur 1 d viser vellykkede fusion, hvor fusogenic pSiNP lipider overføre DiI til plasma membran og er lokaliseret uafhængigt af lysosomer. Mislykket fusion vil vise DiI lokalisering inden for cellens cytoplasma og colocalization med lysosomer (figur 1 c).
Figur 1: Fusogenic porøs silicium nanopartikel system (F-pSiNP). (en) skematisk viser endocytic udbredelse af konventionelle nanopartikler og efterfølgende endosomal entrapment. (b) skematisk viser fusogenic udbredelse af F-pSiNPs og efterfølgende cytosole levering siRNA nyttelast. (c) Konfokal mikroskopisk billede af en CAOV-3 celle, der har endocytosed ikke-fusogenic pSiNPs, der var lastet med DiI lipofile farvestof. CAOV-3 celler var vokset til 80% sammenløbet i en 6 godt-plade, og behandlet med 10 µL af nanopartikler og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 for 15 min. Cellerne var fast i 1% PARAFORMALDEHYD skal monteres på glas dias med DAPI, tørret og opbevaret i mørke indtil undersøgt af Konfokal mikroskopi. (D) Konfokal mikroskopisk billede af en CAOV-3 celle, der har overtaget fusogenic pSiNPs, der var lastet med DiI lipofile farvestof. Celler var pre farves med LysoTracker Green i 1 timer ved 37 ° C i 5% CO2 ifølge producentens anvisninger. Cellerne blev derefter vasket PBS tre gange, og blev behandlet med 10 μL af DiI-loaded partikler i 15 min. Cellerne blev skyllet med PBS tre gange til at fjerne eventuelle partikler, der ikke blev taget op, og brøndene blev fyldt med 1 mL PBS og straks kommer til live-celle billeddannelse af konfokalmikroskopi; DAPI repræsenterer nukleare pletten og lysosomet repræsenterer lysosomale farvning af LysoTracker Green; skalalinjen repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Etch celle setup. (en) skematisk viser etch celle komponenter og Montageordre; og (b) diagram af installationsprogrammet i elektrokemiske ætsning af silicium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fotografi af slutproduktet F-pSiNP. (en) vellykket syntese viser homogen og overskyet løsning; (b) mislykket syntese viser sammenlægning af partikler (gul). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: gentagne fryse-tø cyklus af fusogenic pSiNPs forårsage sammenlægning. (en) gennemsnitlige størrelse og zeta potentiale af fusogenic pSiNPs forbliver stabil i 30 dage, når optøet når efter frysning; (b) gennemsnitlige størrelse og zeta potentiale af fusogenic pSiNPs viser tegn på sammenlægning og tab af strukturelle integritet senest 4 dage efter undergår dagligt fryse-tø cykler. Fejllinjer udgør standardafvigelse (n = 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Diagram af porøs silicium nanopartikel syntese. Skematisk viser elektrokemiske ætsning af silicium wafer (trin 1,4), lift-off af det porøse lag (trin 1,5), sonikering i de porøse lag i partikler og samling af porøs silicium nanopartikler (trin 1,6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntese af porøs silicium nanopartikler er vist i figur 5. Den kritiske trin i syntesen af fusogenic pSiNPs er i lastning trin (trin 3). Hvis fusogenic nanopartikler sammenlægning efter syntese (figur 3), årsagen kan skyldes følgende: (1) calciumchlorid lager blev ikke homogen måde forberedt, således skridt 3.1.2 skal være omhyggeligt fulgt eller raffineret; eller (2) forholdet mellem pSiNP: siRNA: CaCl2 eller koncentrationen af et eller flere af de tre komponenter kan ikke være optimal. Re optimering startende fra CaCl2 koncentration er foreslået (f.eks. ændre fra 2 M til 1 M eller 3 M). Derudover er det vigtigt at sørge for, at CaCl2 er fra den samme leverandør, som vi fandt, at den samme kemiske fra forskellige leverandører resulteret i lavere pH ved lastning trin, og efterfølgende fejl hen til ladning siRNA. PSiNPs kan også være koncentreret, fortyndet, eller yderligere nedbrudt før lastningen ved at efterlade partikler suspenderet i vandets RNAse-fri for 2 dage efter trin 1.6.6.
Efter lastning, fører lipid belægning ofte til vanskeligheder i ekstrudering koncentration eller tæthed af partiklerne (trin 4). Hvis ekstrudering membran er tilstoppet, kan tvinger ekstrudering rippe membranen. Ved tilstopning, demontere ekstruder og erstatte membranen og understøtter med et nyt sæt, hvis tab fra tilstopning er lille. Hvis tabet er stort, derefter fortyndes partikel suspension, og Rens med ultralyd i 30 s forud for ekstrudering. Hvis problemet vedvarer, anbefales ny optimering af pSiNP størrelse og lastning forholdet at minimere aggregater. Endelig foreslår vi, at filtrering partikel suspension gennem et 0,22 µm-pore filter til at fjerne eventuelle forureninger eller aggregater celle eller behandling af animalsk. Filtrering kan især anbefales hvis partiklerne blev syntetiseret i en ikke-sterile miljø, eller efter optøning af en frosset alikvot af partikler.
Fusogenicity af partiklerne kan valideres ved Konfokal mikroskopi (som vist i figur 1 c, d) og transmissions Elektron Mikroskopi af cellerne behandles med partikler at observere for lipid-skur porøs silicium kerner i cytoplasma 15.
Fusogenic pSiNPs og sin sammenfattende protokol har nogle begrænsninger. For in vitro-genhæmning applikationer, præsenteres fusogenic pSiNPs har vist sig for at fremkalde > 90% knockdown effektivitet i en række cellelinier på 100 nM dosis; herunder Neuro-2a mus neuroblastoma cellelinie, CAOV-3 menneskelige ovarie cancer cellelinie og notorisk vanskeligt at transfect RAW 264.7 musen makrofager cellelinje. Men vi har observeret > 50% knockdown effektivitet på så lavt som 25 nM dosis, som var sammenlignelig med Lipofectamine. Mens kationiske lipider skal bruges minimalt at reducere cytotoksiske effekt, har vi tidligere bevist sin sikkerhed i en lipid dosis på så højt som 1 mg15. For in vivo genhæmning applikationer, er fusogenic pSiNPs begrænset af selektivitet. Som de kationiske lipider elektrostatisk tiltrække til enhver cellemembranen, partikler skal bruges som en lokal terapeutisk, eller være overflade modificeret med en målretning gruppe (fx, peptider, antistoffer, osv.). Sammenfattende protokol for fusogenic pSiNPs er i øjeblikket optimeret og begrænset til siRNA levering kun. Samme metode er blevet verificeret hen til med held ladning miRNA, og er en hypotese, for at være i stand til at indlæse mRNA, cDNA og andre større nukleotid nyttelast, men disse har endnu at blive optimeret.
Det præsenterede arbejde gør et væsentligt bidrag til feltet af genterapi. Den standard benchmark for in vitro-genhæmning er Lipofectamine 2000. Vi har vist, at fusogenic pSiNPs kan fremkalde knockdown effekt af sammenlignelige, hvis ikke højere, effektivitetsgevinster15. Den største fordel ved fusogenic pSiNPs over Lipofectamine 2000 er dens evne til at blive anvendt til in vivo applikationer med systemisk injektioner. Mens andre agenser, såsom Invivofectamine 3.0, har været kommercialiseret for in vivo anvendelser, de er kun egnet til leveren levering, og kræver kemisk modificeret siRNAs (med eller uden udhæng eller i låst nukleinsyre (LNA) struktur) til at øge stabilitet og specificitet. 16 , 17 , 18 men fusogenic pSiNPs kan være ændret efter syntese til konjugat målretning fraspaltning med enkle thiol-maleimide kemi, hvori en thiol gruppe i den målretning peptid (som bærer et ekstra cystein til dette formål) binder et dobbelt-bundet kulstof i maleimide ring i slutningen af pegyleret lipider i fusogenic belægningen. Desuden, den høje masse lastning og levering effekten til cellen cytoplasma minimerer behovet for intracellulære specificitet og opnår stærk genhæmning effekt med ikke-modificerede siRNAs15. En ulempe ved fusogenic pSiNPs er, at syntesen protokollen er en multi-dages proces, der er mere komplekse end de kommercielt tilgængelige Transfektion agenter. Men mens benchmark produkter skal være frisk fremstillede før Transfektion at opnå de bedste resultater, fusogenic pSiNPs kan være aliquoted og frosne i mindst 30 dage uden at forringe den knockdown effektivitet.
Fremtidige ansøgninger om denne metode omfatter optimering af lastning og levering af større nukleinsyre nyttelast, såsom mRNAs og cDNAs. Desuden er levering af CRISPR/Cas9 protein-sgRNA komplekse, eller en cocktail af Cas9 mRNA og sgRNA, også en mulighed for udvikling, som systemet er optimal til indlæsning af anioniske nyttelast. Samlet, F-pSiNP system er en modulær nanoplatform for genterapi til behandling af sygdomme uden for infektioner, herunder virusinfektioner, kræft og autoimmune sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MJS er en videnskabelig grundlægger af spiler Biosciences, Inc., og har en egenkapital interesse i virksomheden. Selv om dette tilskud er blevet identificeret for interessekonflikt forvaltning baseret på det samlede omfanget af projektet og dets potentielle fordel spiler Biosciences, Inc., kan de forskningsresultater, der er inkluderet i denne særlige publikation ikke nødvendigvis forholde sig til interesser af spiler Biosciences, Inc. Vilkårene i denne aftale har gennemgået og godkendt af University of California, San Diego i overensstemmelse med dens interessekonflikt politikker. Andre forfattere har intet at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health gennem kontrakt # R01 AI132413-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
