Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

संश्लेषण, Functionalization, और के लक्षण वर्णन फ्यूजेनिक छिद्रपूर्ण सिलिकॉन के लिए नैनो कणों के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिलिवरी

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59440
Automatic Translation
1, 1,2
1Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

Summary

हम विट्रो में प्रभावी और vivo ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डिलीवरी में के लिए फ्यूजेनिक झरवाला सिलिकॉन नैनोकणों के संश्लेषण का प्रदर्शन । छिद्रक सिलिकॉन नैनोकणों के लिए कोर, जो बाहर निकालना के माध्यम से फ्यूजेनिक रक्तदाब द्वारा लेपित है बनाने के लिए सिरना के साथ लोड कर रहे है खोल फार्म । लक्ष्यीकरण मोइटी functionalization और कण लक्षण वर्णन शामिल हैं ।

Abstract

जीन थेरेपी के आगमन के साथ, vivo न्यूक्लिओटाइड में एक प्रभावी विकास-पेलोड डिलीवरी प्रणाली समानांतर आयात की बन गई है । फ्यूजेनिक झरनी सिलिकॉन नैनोकणों (एफ psinps) हाल ही में अपने उच्च ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लदान क्षमता और अद्वितीय सेलुलर तेज मार्ग है कि endocytosis से बचा जाता है के कारण vivo जीन मुंह बंद प्रभावकारिता में उच्च प्रदर्शन किया है । एफ pSiNPs के संश्लेषण एक बहु कदम प्रक्रिया है कि शामिल है: (1) लोड हो रहा है और सिलिकॉन pores में oligonucleotide पेलोड की सील; (2) एक साथ कोटिंग और छिद्रित सिलिकॉन कोर के आसपास फ्यूजेनिक लिपिड की नौकरशाही का आकार घटाने; और (3) पेप्टाइड्स लक्ष्यीकरण का संयुग्मन और अतिरिक्त oligonucleotide को हटाने के लिए धोने, सिलिकॉन मलबे, और पेप्टाइड. कण के आकार एकरूपता गतिशील प्रकाश बिखरने की विशेषता है, और इसकी कोर-शैल संरचना संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । फ्यूजेनिक भार एक लिपोफिलिक डाई, 1, 1 '-डिओटाडेसिल-3, 3, 3 ', 3 '-टेट्रामेथालिनडोकार्बोसायनीन परक्लोरेट (DiI), फ्यूजेनिक लिपिड bilayer में लोड हो रहा है और यह विट्रो में कोशिकाओं के इलाज के लिए प्लाज्मा झिल्ली धुंधला बनाम के लिए निरीक्षण endocytic localizations. लक्ष्यीकरण और vivo जीन मुंह बंद एफिशियोस में पहले staphylococcus औरेयस निमोनिया के एक माउस मॉडल में मात्रा निर्धारित थे, जिसमें लक्ष्यीकरण पेप्टाइड को संक्रमण की साइट के लिए घर के लिए एफ psinps मदद की उंमीद है । एस ऑरेयस संक्रमण में अपने आवेदन से परे, एफ psinp प्रणाली वायरल संक्रमण, कैंसर, और स्व-प्रतिरक्षित रोगों सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के जीन थेरेपी के लिए किसी भी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

जीन थेरेपी एक चिकित्सीय परिणाम प्राप्त करने के लिए विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति modulates । जीन मॉडुलन के लिए अनेक उपकरणों की खोज की गई है और अध्ययन किया गया है, जिनमें राइबोन्यूक्लीइक अम्ल हस्तक्षेप (आरएनआई) का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लिओटिडेस (उदा., लघु दखल आरएनए (सिरना)1,2, माइक्रोना (मिरना)3,4 ), डीएनए plasmids5,6, नाभिकों (जैसे, जस्ता उंगली, टैलेंस)7,8, और crispr/Cas9 सिस्टम9,10. जबकि कार्रवाई के प्रत्येक उपकरण के तंत्र अलग है, उपकरण के सभी सेल के कोशिका द्रव्य या नाभिक सक्रिय होने के लिए पहुंचना चाहिए । जैसे, जबकि इन उपकरणों के लिए विट्रो में जीन अभिव्यक्ति नियमन में महत्वपूर्ण प्रभाव पैदा साबित कर दिया है, vivo प्रभावकारिता में extracellular और intracellular बाधाओं से ग्रस्त है । तथ्य यह है कि उपकरण जैविक मूल के हैं के कारण, कई एंजाइम और निकासी प्रणाली हमारे शरीर में मौजूद है कि नीचा या विदेशी अणुओं को दूर करने की क्षमता है11. इस स्थिति में भी कि उपकरण लक्ष्य कक्ष तक पहुंचते हैं, वे endocytosis से पीड़ित हैं; सेलुलर की एक विधा जो कोशिका के बाहर के औजार को नीचा या निष्कासित करने वाली अम्लीय पेट की तरह उपकरण को संपुटित और जाल में झोंक लेती है । वास्तव में, अध्ययनों से पता चला है कि लिपिड नैनोकणों मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से endocytosed रहे हैं, जिसमें से लगभग ७०% सिरना के 24घंटे के भीतर कोशिकाओं से exocytosed हैं12,13। शेष सिरना के बहुमत लायोसोमल मार्ग के माध्यम से अपमानित कर रहे हैं, और अंततः केवल 1-2% सिरना है कि शुरू में नैनोकणों के साथ सेल में प्रवेश करती है एंडोसोमल एस्केप प्राप्त करने के लिए संभावित रूप से गुजरना rnai13,14 .

हम हाल ही में फ्यूजेनिक झरवाला सिलिकॉन नैनोकणों (एफ psinps) है कि एक सिरना भरी हुई है विकसित की है झरझरा सिलिकॉन नैनोकणों से बना कोर, और एक फ्यूजेनिक लिपिड शैल15। एफ psinps अन्य पारंपरिक oligonucleotide वितरण प्रणाली पर तीन प्रमुख लाभ वर्तमान: (1) एक फ्यूजेनिक लिपिड कोटिंग जो endocytosis बाईपास करने के लिए कणों को सक्षम बनाता है और पूरे पेलोड सीधे सेल कोशिका द्रव्य में देने के लिए (बनाम 1-2% 13,14endocytosed कणों द्वारा प्राप्त) (चित्रा 1); (2) pSiNPs में सिरना की उच्च मास लोडिंग (> 20 wt% पारंपरिक सिस्टम द्वारा 1-15 wt% की तुलना में)15, जो तेजी से साइटोप्लाज्म में नीचा (एक बार कोर कणों फ्यूजेनिक तेज के माध्यम से लिपिड कोटिंग शेड) सिरना रिहाई के लिए; और (3) vivo में वांछित सेल प्रकार के लिए चयनात्मक अभिलक्ष्यन के लिए पेप्टाइड संयुग्मन लक्ष्यीकरण ।

एफ-पीसीएनपी प्रणाली ने महत्वपूर्ण जीन साइलेंसिंग प्रभावकारिता (विट्रो में > 95%; वीवो में > 80%) तथा एस-ऑरियस निमोनिया के घातक माउस मॉडल में अनुवर्ती चिकित्सीय प्रभाव का प्रदर्शन किया है; जिसके परिणाम पहले15प्रकाशित किए गए थे । हालांकि, एफ pSiNP प्रणाली की जटिल संरचना नाजुक हैंडलिंग और ठीक tuned अनुकूलन के लिए वर्दी और स्थिर नैनोकणों उत्पंन करने की आवश्यकता है । इस प्रकार, इस काम का उद्देश्य एक संपूर्ण प्रोटोकॉल पेश करने के लिए है, साथ ही संश्लेषण के लिए अनुकूलन रणनीतियों, functionalization, और एफ pSiNPs के लक्षण वर्णन शक्तिशाली जीन साइलेंसिंग प्रभाव के लिए सिरनास के लक्षित डिलीवरी में इस्तेमाल किया जाएगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. असुरक्षित सिलिकॉन नैनोकणों का संश्लेषण (pSINPs)

चेतावनी: हमेशा सावधानी का प्रयोग करें जब hydrofluoric एसिड (एचएफ) के साथ काम कर रहे । अपनी सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) के अनुसार सभी सुरक्षा गाइड का पालन करें, किसी भी HF-एक धूआं हुड में रसायनों युक्त संभाल, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनते हैं (PPE; बाहर पर butyl दस्ताने के साथ डबल दस्ताने, नीचे लैब कोट के साथ butyl एप्रन, चेहरा नीचे सुरक्षा काले चश्मे के साथ ढाल) । सभी विश्वविद्यालयों और आर & डी प्रयोगशालाओं HF सुरक्षा पर विशिष्ट प्रशिक्षण उपयोग करने से पहले की आवश्यकता है । अपने स्थानीय प्रयोगशाला सुरक्षा समंवयक के पूर्व अनुमोदन के बिना HF के साथ काम करने का प्रयास नहीं, के रूप में अतिरिक्त सुरक्षा उपायों यहां वर्णित नहीं की आवश्यकता है ।

  1. नक़्क़ाशी समाधान की तैयारी
    1. नक़्क़ाशी के लिए 3:1 HF समाधान बनाने के लिए (कदम १.३ और १.४ में इस्तेमाल किया), 30 मिलीलीटर जलीय ४८% HF और पूर्ण इथेनॉल (EtOH) के 10 मिलीलीटर के साथ एक प्लास्टिक के एेसे सिलेंडर भरें । समाधान उच्च घनत्व प्लास्टिक (जैसे, एचडीपीई) में समाहित किया जाना चाहिए, के रूप में एचएफ कांच घुल ।
    2. लिफ्ट के लिए एक 1:29 HF समाधान बनाने के लिए (कदम १.५ में इस्तेमाल किया), जलीय ४८% HF के 1 मिलीलीटर और पूर्ण इथेनॉल के 29 मिलीलीटर के साथ एक प्लास्टिक के एेसे सिलेंडर भरें । समाधान उच्च घनत्व प्लास्टिक (जैसे, एचडीपीई) में समाहित किया जाना चाहिए, के रूप में एचएफ कांच घुल ।
    3. अतिरिक्त साई विघटन के लिए 10% EtOH में 1 एम KOH समाधान बनाओ (कदम १.३ और १.५ में प्रयुक्त) ।
  2. खोदना कक्ष की स्थापना
    1. एक ८.६ सेमी2 अच्छी तरह से खोदना के साथ एक Teflon खोदना सेल में (क्षेत्र के भीतर नक़्क़ाशी के लिए उपलब्ध सिलिकॉन सतह के व्यास को मापने के द्वारा गणना की है O-अंगूठी, और एक = πr2द्वारा क्षेत्र की गणना), अवरोही क्रम में जगह (चित्रा 2a): (1) Teflon सेल शीर्ष; (2) एक O-अंगूठी; (3) एकल क्रिस्टल का एक चौथाई टुकड़ा (1 0 0)-उंमुख पी + + प्रकार सिलिकॉन वेफर क्वार्टर में कटौती (एक हीरे कटर का उपयोग); (4) एल्यूमीनियम पन्नी; और (5) शिकंजा के साथ Teflon सेल आधार धीरे रिसाव को रोकने के लिए कड़ा कर दिया ।
    2. एटोह के साथ अच्छी तरह से भरें । एक पोंछ ले और teflon सेल शीर्ष और आधार के बीच दरार में डालें । अगर पोंछ हटाने पर सूखी है, खोदना कोशिका सील है । यदि गीला है, सेल लीक कर रहा है, और शिकंजा और कस आगे तक सील ।
  3. सिलिकॉन वेफर Electropolishing
    1. इकट्ठे खोदना सेल एक धूआं डाकू में लाओ ।
    2. 3:1 HF समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से भरें ।
    3. एल्यूमीनियम पन्नी (इलेक्ट्रोड) को खोदना सेल से सकारात्मक नेतृत्व कनेक्ट और प्लेटिनम का तार करने के लिए नकारात्मक नेतृत्व कनेक्ट (काउंटर-इलेक्ट्रोड) खोदना सेल के 3:1 HF समाधान में डूबे सर्किट को पूरा करने के लिए (चित्रा 2b).
    4. ६० एस के लिए ५० mA सेमी-2 पर एक निरंतर वर्तमान चलाते हैं । एक बार खोदना समाप्त हो गया है, सर्किट से सेल को हटाने, और 3:1 HF ध्यान से एक सिरिंज का उपयोग कर कुल्ला । EtOH के साथ कुल्ला तीन बार ।
    5. दूर 1 एम KOH के 10 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धीरे भरने से धंसा परत को भंग । Bubbling सबसाइड तक रुको ।
    6. तीन बार पानी के साथ KOH बाहर कुल्ला, और फिर EtOH के साथ तीन बार ।
  4. सिलिकॉन वेफर में बिजली की रासायनिक रूप से छिद्रण परतों नक़्क़ाशी
    1. एक वर्ग तरंग के एक बारी वर्तमान चलाते हैं, कम वर्तमान घनत्व के साथ ५० mA/cm2 के लिए ०.६ एस और ४०० mA/cm2 के उच्च वर्तमान घनत्व ०.३६ के लिए दोहराया ५०० चक्र के लिए ।
    2. एक बार खोदना समाप्त हो गया है, सर्किट से सेल को हटाने, और 3:1 HF ध्यान से एक सिरिंज का उपयोग कर कुल्ला । EtOH के साथ कुल्ला तीन बार ।
  5. सिलिकॉन वेफर से छिद्रक परत को उठाना
    1. 1:29 HF समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से भरें ।
    2. २५० s के लिए ३.७ mA/cm2 की एक निरंतर चलाते हैं । एक बार खोदना समाप्त हो गया है, सर्किट से सेल को हटा दें । साई की परत क्रिस्टलीय सिलिकॉन वेफर से टुकड़ी का संकेत तरंगें दिख सकता है । धीरे से 1:29 HF समाधान धोने और EtOH के साथ कुल्ला तीन बार, तो पानी के साथ तीन बार ।
    3. एक पिपेट टिप का प्रयोग, दृढ़ता से पूरी टुकड़ी के लिए साई परत की परिधि दरार । EtOH का प्रयोग, एक वजनी नाव में Teflon खोदना सेल से साई टुकड़े (चिप्स) इकट्ठा । एक गिलास शीशी में चिप्स हस्तांतरण । पीएसआई चिप्स के भंडारण के लिए 6 महीने से अधिक के लिए EtOH में कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है ।
    4. दूर 1 एम कोह के 10 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धीरे भरने के द्वारा वेफर पर किसी भी शेष झरवाला सिलिकॉन को भंग । Bubbling सबसाइड तक रुको ।
    5. तीन बार पानी के साथ KOH बाहर कुल्ला, और फिर EtOH के साथ तीन बार ।
    6. दोहराएं कदम 1.3-1.5 जब तक पूरे वेफर मोटाई etched किया गया है ।
  6. Nanoparticle गठन के लिए छिद्रिम परतों Sonicating
    1. कांच की शीशी के विलायक को ईटोह से 2 उस् तक पानी में बदलकर पीएसआई चिप्स से प्रतिस्थापित करें ।
    2. दृढ़ता से टोपी बंद, और parafilm का उपयोग कर मुहर ।
    3. एक sonicator स्नान में कांच की शीशी प्लेस और ऐसी है कि साई चिप्स की मात्रा पूरी तरह से सतह के नीचे जलमग्न है निलंबित कर दिया ।
    4. ३५ kHz और 48W के आरएफ शक्ति में 12 एच के लिए Sonicate । Sonication के दौरान महत्वपूर्ण पानी की हानि को रोकने के लिए, पानी से भरा एक volumetric फ्लास्क जगह है, ताकि कुप्पी के उद्घाटन पानी स्नान की सतह को छूता है ।
    5. 1 ज के लिए एक समतल सतह पर कांच की शीशी रखें ताकि बड़े कणों को तल पर बसा सके । अधिनतांत एक पिपेट का उपयोग कर लीजिए; निलंबन उप १०० एनएम pSiNPs शामिल हैं ।

2. फ्यूजेनिक लिपिड फिल्म की तैयारी

  1. लिपिड स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. एक धूआं हुड में, क्लोरोफॉर्म में DMPC, DSPE-खूंटी-मल और DOTAP रक्तदाब hydrating द्वारा लिपिड के 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक बनाओ । इन स्टॉक समाधानों को टाइट पैराफील् ट सील के तहत 6 महीने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
  2. फ्यूजेनिक लिपिड फिल्म बनाना
    ध्यान दें: फ्यूजेनिक संरचना के लिपिड, DMPC, DSPE-खूंटी, और DOTAP, 76.2 के मोलर अनुपात में किया जाता है: 3.8:20 और 96.2:3.8:0, क्रमशः ।
    1. एक कांच की शीशी में, DMPC के ७२.५५ μL मिश्रण, DSPE के १५.१६ μL-खूंटी, और डोटाप के १९.६३ μL से पिख्ता ।
    2. वैकल्पिक: लिपिड कोटिंग के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए, साथ ही 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एकाग्रता पर इटोह में भंग DiI के 20 μL जोड़ें ।
    3. एक ढीला टोपी के साथ एक धूआं हुड में शीशी प्लेस क्लोरोफॉर्म की अनुमति के लिए रातोंरात लुप्त हो जाना । सूखी फिल्म शीशी के नीचे एक बादल कठोर जेल की तरह पदार्थ होगा ।

3. लदान और pSiNPs में सिरना की सीलिंग

  1. कैल्शियम क्लोराइड लोडिंग स्टॉक की तैयारी
    1. १.११ में cacl2 के 10 मिलीलीटर rnase मुक्त पानी के एक 2 एम cacl2 समाधान बनाने के लिए भंग.
    2. > पर समाधान सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी समुच्चय बसने और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant इकट्ठा । वैकल्पिक रूप से, समाधान एक ०.२२ μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें ।
  2. सिरना लोडिंग स्टॉक की तैयारी
    1. हाइड्रेट या सिरना को पतला करने के लिए १५० μM RNAse मुक्त पानी में । इस स्टॉक समाधान को अल्कोटेड किया जा सकता है और कम से 30 दिनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जम कर रखा जाता है, ताकि यह लगातार फ्रीज-गल चक्रों से गुजरना न हो ।
  3. कैल्शियम क्लोराइड के साथ pSiNPs में सिरना लोड हो रहा है
    1. एक आइस्ड sonication स्नान तैयार ।
    2. 15 मिनट ultrasonication के तहत, धीरे पिपेट १५० μL के सिरना और ७०० μL 2 मीटर CaCl2 के १५० μl psinp में. गैस उत्पादन के लिए खुला माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के ढक्कन छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें ।
    3. Sonicator से सिरना भरी हुई कैल्शियम लेपित pSiNPs के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब निकालें ।

4. कोटिंग सिरना-फ्यूजेनिक रक्तदाब के साथ pSiNPs लोड

  1. लिपोकुछ बाहर निकालना किट की तैयारी
    1. DI पानी के साथ एक विस्तृत बीकर भरें । 1 पॉलीकार्बोनेट झिल्ली (२०० एनएम pores) भिगोएं, और 4 फिल्टर पानी की सतह पर तैरते हुए उन्हें सपोर्ट करता है । निर्माता के निर्देशों का पालन करके लिपोकुछ बाहर निकालना किट इकट्ठा
  2. सिरना-लोडेड pSiNps के साथ लिपिड फिल्म को हाइड्रेटिंग
    1. कांच की शीशी में सूखे लिपिड फिल्म को सिरना के 1 मिलीलीटर से भरा हुआ कैल्शियम लेपित pSiNPs के चरण 3.3.3 से प्राप्त हाइड्रेट । जब तक सभी रक्तदाब फिल्म शीशी के नीचे से उठा लिया है और एक बादल समरूप समाधान में मिलाया है पिपेट ।
    2. कांच की शीशी में एक चुंबकीय सरगर्मी बार प्लेस, और एक गर्म थाली पर शीशी जगह ४० डिग्री सेल्सियस (या उच्च रक्तदाब ' चरण परिवर्तन तापमान के ऊपर काफी अधिक fluidic तरल क्रिस्टल चरण में रक्तदाब बनाए रखने के लिए) कणों गर्मी के लिए जबकि चुंबकीय 20 मिनट के लिए समाधान सरगर्मी ।
  3. आकार नियंत्रण के लिए लिपिड लेपित pSiNPs Extruding
    1. बाहर निकालना सिरिंज में लिपिड लेपित pSiNP-सिरना समाधान के 1 मिलीलीटर महाप्राण । Extruder के एक तरफ एक खाली सिरिंज डालें, और दूसरे छोर पर भरा सिरिंज ।
    2. एक सिरिंज से कणों पुश करने के लिए धीरे में पिस्टन धक्का द्वारा बाहर निकालना शुरू, पॉलीकार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से, और दूसरे में. 20 बार दोहराएं । यदि पिस्टन अटक गया है, फिल्टर और झिल्ली भरा जा सकता है । Extruder जुदा और झिल्ली की जगह और फिल्टर का समर्थन करता है । यदि समस्या बनी रहती है, तब तक कणों को पतला करें जब तक कि कॉलेस्ट्रॉल प्रबंधनीय न हो ।
    3. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में extruded कणों ले लीजिए ।

5. पेप्टाइड्स लक्ष्यीकरण का संयुग्मन

  1. Conjugating लक्ष्यीकरण पेप्टाइड लिपिड कोटिंग करने के लिए
    1. एक 1 मिलीग्राम/एमएल पेप्टाइड एकाग्रता के साथ पेप्टाइड स्टॉक RNAse मुक्त पानी में तैयार करें ।
    2. फ्यूजेनिक लिपिड लेपित pSiNPs युक्त माइक्रोअपकेंद्रज ट्यूब में, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर पेप्टाइड स्टॉक और पिपेट के १०० μL को धीरे से जोड़ें । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर ट्यूब रखें (वैकल्पिक रूप से, > 2 ज 4 डिग्री सेल्सियस पर) ।
    3. अतिरिक्त पेप्टाइड या siRNA और अंय excipients को हटाने के लिए, एक 30 केडीए केंद्रापसारक फिल्टर में 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए ५,००० x जी पर कताई द्वारा धोने एक ही सेटिंग के तहत pbs के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार अधिक ।
    4. वांछित एकाग्रता पर PBS में अंतिम पेप्टाइड-संयुग्मित फ्यूजेनिक लिपिड लेपित pSiNPs । इन कणों को अब अल्पउद्धरित किया जा सकता है और कम-से-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए 30 दिनों के भंडारण के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

फ्यूजेनिक pSiNPs का एक सफल संश्लेषण एक समरूप, थोड़ा अपारदर्शी समाधान का उत्पादन करना चाहिए (चित्रा 3a). PSiNPs के अनुपात और एकाग्रता का अनुकूलन करने में विफलता: siRNA: CaCl2 लोड हो रहा है पर एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (चित्रा 3b). के रूप में कणों २०० एनएम झिल्ली के माध्यम से extruded रहे हैं, dls द्वारा मापा फ्यूजेनिक psinps के औसत द्रवगतिक व्यास लगभग २०० एनएम होना चाहिए, और औसत जीटा-संभावित लगभग + 7 mV के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है । पेप्टाइड्स लक्ष्यीकरण के साथ सतह संशोधन के बाद, समग्र व्यास २३० एनएम के तहत होना करने के लिए वृद्धि की जानी चाहिए, और औसत जीटा-संभावित नीचे-३.४ एमवी15में कमी आई । बाहर निकालना आकार से कोई व्यापक विचलन विफल बाहर निकालना (dकण > > dबाहरनिकालना), या विफल लोडिंग (dकण < < dबाहरनिकालना) का संकेत है । Aggregations भी dls का उपयोग कर मात्रा निर्धारित हो सकता है । इसके अलावा, जमे हुए aliquots केवल एक बार गल होना चाहिए, के रूप में दोहराया फ्रीज-गल चक्र लिपिड झिल्ली और intraविषेश फ्यूजन और एकत्रीकरण को बाधित (चित्रा 4) । चित्र 4a दिखाता है के रूप में, फ्यूजेनिक psinps 30 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और संरचनात्मक परिवर्तन के कारण के बिना गल । हालांकि, दोहराया फ्रीज-गल चक्र एक aliquot के कारण गंभीर एकत्रीकरण (डी > > १,००० एनएम) और दैनिक चक्र के 4 दिनों के भीतर (चित्रा 4b), इस प्रकार यह सलाह दी जाती है कि कणों एकल उपयोग संस्करणों के लिए aliउद्धृत किया जाता है ।

फ्यूजन के लिपोफिलिक dii (2.2.2 कदम) के साथ फ्यूजेनिक लिपिड लेबलिंग द्वारा पुष्टि की जा सकती है, और संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विट्रो स्थानीयकरण में देख । चित्रा 1 डी सफल फ्यूजन से पता चलता है, जहां फ्यूजेनिक pSiNP के लिपिड प्लाज्मा झिल्ली को dii हस्तांतरण और lysosomes के स्वतंत्र स्थानीयकृत रहे हैं । असफल फ्यूजन कोशिका के कोशिका द्रव्य के भीतर DiI स्थानीयकरण और lysosomes के साथ colocalization दिखाएगा (चित्रा 1c).

Figure 1
चित्रा 1: फ्यूजेनिक झरवाला सिलिकॉन nanoparticle प्रणाली (एफ pSiNP) । (क) पारंपरिक नैनोकणों की एन्डोस्टिक वृद्धि और बाद में इंडोसोमल अंतर्ग्रहण को दर्शाने वाला योजनाबद्ध । (ख) सिरना पेलोड के एफ-पीसिंप्स और उसके बाद के साइटोसोलिक डिलीवरी का फ्यूजेनिक रूप में होना । (ग) काओव-3 कोशिका की संनाभि सूक्ष्मदर्शी छवि जिसे डाइई लिपोफिलिक डाई से भरी हुई गैर-फ्यूजेनिक पीसिंप्स को एन्डोसाइटोस किया गया है । CAOV-3 कोशिकाओं को एक 6 अच्छी थाली में ८०% संगम के लिए बड़े हो गए थे, और नैनोकणों के 10 μL के साथ इलाज किया, और 15 मिनट के लिए 5% सह2 में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनसेबटेड । कोशिकाओं 1% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था dapi के साथ कांच स्लाइड पर घुड़सवार, सूख और अंधेरे में रखा जब तक संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की । (घ) काओव-3 कोशिका का संनाभि सूक्ष्मदर्शी प्रतिबिंब जो कि डिई लिपोफिलिक डाई से भरे हुए फ्यूजेनिक पीसिंप्स को ले चुका है । कोशिकाओं को पूर्व में 1 एच के लिए LysoTracker ग्रीन के साथ दाग थे ३७ ° c में 5% CO2 में निर्माता के निर्देशों के अनुसार । कोशिकाओं को फिर PBS तीन बार धोया गया, और 15 मिनट के लिए DiI-लोडेड कणों के 10 μL के साथ इलाज किया गया । कोशिकाओं pbs के साथ धोया गया था तीन बार किसी भी कणों कि नहीं लिया गया हटाने के लिए, और कुओं pbs के 1 मिलीलीटर से भर रहे थे और तुरंत संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव सेल इमेजिंग के लिए ले लिया; DAPI परमाणु दाग का प्रतिनिधित्व करता है और Lysosome लयसोसोमल धुंधला लाइसट्रैकर ग्रीन द्वारा प्रतिनिधित्व करता है; स्केल पट्टी 10 μm का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कक्ष सेटअप खोदना । (क) खोदना कक्ष घटकों और असेंबली ऑर्डर को दर्शाने वाला योजनाबद्ध; और (ख) सिलिकॉन के इलेक्ट्रोकेमिकल नक़्क़ाशी के लिए सेटअप का आरेख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अंतिम एफ pSiNP उत्पाद का फोटोग्राफ । (क) सफल संश्लेषण समरूप और बादल समाधान दिखा; (ख) कणों का एकत्रीकरण दर्शाने वाला असफल संश्लेषण (पीला) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: फूजनिक pSiNPs का दोहराया फ्रीज गल चक्र कारण एकत्रीकरण । (क) औसत आकार और जीटा-फ्यूजेनिक psinps की क्षमता 30 दिनों के लिए स्थिर रहता है जब एक बार ठंड के बाद गल; (ख) फ्यूजेनिक pSiNPs की औसत आकार और जीटा-क्षमता, दैनिक फ्रीज-गल चक्र के गुजरने के बाद 4 दिनों के भीतर संरचनात्मक अखंडता के एकत्रीकरण और हानि के संकेत दिखाता है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (n = 5) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: छिद्रपूर्ण सिलिकॉन nanoparticle संश्लेषण के आरेख । सिलिकॉन वेफर (कदम १.४), लिफ्ट-बंद झरनी परत (कदम १.५), कणों में छिद्रण परत के sonication, और झरझरा सिलिकॉन नैनोकणों का संग्रह (चरण १.६) के बाहर उठा इलेक्ट्रोकेमिकल दिखा योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

छिद्रक सिलिकॉन नैनोकणों का संश्लेषण चित्रा 5में दिखाया गया है । फ्यूजेनिक pSiNPs के संश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम लोड हो रहा है कदम (चरण 3) में है । यदि फ्यूजेनिक नैनोकणों के बाद संश्लेषण (चित्रा 3) समग्र रहे हैं, कारण निम्नलिखित के कारण हो सकता है: (1) कैल्शियम क्लोराइड स्टॉक समरूप तैयार नहीं था, इस प्रकार 3.1.2 कदम ध्यान से पालन किया जाना चाहिए या परिष्कृत; या (2) pSiNP का अनुपात: सिरना: CaCl2 या एक या अधिक तीन घटकों की एकाग्रता इष्टतम नहीं हो सकता है. पुन: अनुकूलन CaCl2 एकाग्रता से शुरू करने का सुझाव दिया है (उदाहरण के लिए, 2 मीटर से 1 मीटर या 3 मीटर में फेरबदल). इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि CaCl2 एक ही विक्रेता से है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसा कि हमने पाया कि विभिन्न विक्रेताओं से एक ही रासायनिक लोड कदम पर कम पीएच में परिणाम, और बाद में सिरना लोड करने के लिए विफलता. PSiNPs भी ध्यान केंद्रित किया जा सकता है, पतला, या आगे कम RNAse मुक्त पानी में निलंबित कर दिया कणों छोड़ने के द्वारा लदान प्रक्रिया से पहले 2 दिनों के लिए कदम 1.6.6 के बाद ।

बाद लोड हो रहा है, लिपिड कोटिंग अक्सर एकाग्रता या कणों की सघनता (चरण 4) के कारण बाहर निकालना में कठिनाई की ओर जाता है । यदि बाहर निकालना झिल्ली भरा हुआ है, बाहर निकालना मजबूर झिल्ली चीर सकता है । कॉलेस्ट्रॉल पर, extruder जुदा, और झिल्ली की जगह और एक नया सेट के साथ समर्थन करता है अगर कॉलेस्ट्रॉल से नुकसान छोटा है । यदि नुकसान महान है, तो कण निलंबन पतला, और 30 के लिए sonicate बाहर निकालना से पहले । यदि समस्या बनी रहती है तो समग्र रूप से न्यूनतम करने के लिए पीसीएनपी आकार और लदान अनुपात का पुन इष्टतम उपयोग करने की सलाह दी जाती है । अंत में, हम एक ०.२२ μm-pore फिल्टर के माध्यम से कण निलंबन फ़िल्टरिंग सुझाव किसी भी contaminants या सेल या पशु उपचार से पहले समुच्चय को खत्म करने के लिए । फिल्टर विशेष रूप से सलाह दी जाती है अगर कणों एक गैर बाँझ वातावरण में संश्लेषित किया गया, या कणों की एक जमे हुए aliquot गल के बाद.

कणों की फ्यूजनसिटी संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य किया जा सकता है (के रूप में चित्रा 1 सी, डीमें दिखाया गया है), और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के कणों के साथ इलाज के लिए कोशिका द्रव्य में लिपिड शेड झरनी सिलिकॉन कोर के लिए निरीक्षण 15.

फ्यूजेनिक pSiNPs और उसके संश्लेषण प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं हैं । विट्रो जीन साइलेंसिंग अनुप्रयोगों में के लिए, प्रस्तुत फ्यूजेनिक pSiNPs १०० एनएम खुराक में सेल लाइनों की एक सीमा में 90% पछाडाडाउन दक्षता > प्रेरित करने के लिए साबित कर दिया है; न्यूरो-2a माउस neuroblastoma सेल लाइन, CAOV-3 मानव डिम्बग्रंथि कैंसर सेल लाइन सहित, और कुख्यात मुश्किल से transfect कच्चे २६४.७ माउस मैक्रोफेज सेल लाइन । हालांकि, हमने देखा है > 50% पछाड़ना दक्षता के रूप में कम के रूप में 25 एनएम खुराक, जो लिपोफेक्टामीन के लिए तुलनीय था । जबकि धनायनी रक्तदाब ंयूनतम उपयोग किया जाना चाहिए साइटोटोक्सिक प्रभाव को कम करने के लिए, हम पहले के रूप में उच्च के रूप में 1 मिलीग्राम15की एक लिपिड खुराक पर अपनी सुरक्षा का प्रदर्शन किया । के लिए vivo जीन साइलेंसिंग अनुप्रयोगों में, फ्यूजेनिक pSiNPs चयनशीलता द्वारा सीमित हैं । के रूप में धनायनी लिपिड इलेक्ट्रोस्टैटिकली किसी भी कोशिका झिल्ली को आकर्षित करने के लिए, कणों एक स्थानीय चिकित्सकीय के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, या सतह एक लक्ष्यीकरण मोइटी (जैसे, पेप्टाइड, एंटीबॉडी, आदि) के साथ संशोधित किया जाना चाहिए । फ्यूजेनिक pSiNPs के लिए संश्लेषण प्रोटोकॉल वर्तमान में अनुकूलित और केवल सिरना वितरण के लिए सीमित है । एक ही विधि सफलतापूर्वक mirna लोड करने के लिए सत्यापित किया गया है, और करने के लिए एमआरएनए, cdna, और अंय बड़े न्यूक्लियोटाइड पेलोड लोड करने में सक्षम हो डोडो है, लेकिन इन अभी तक अनुकूलित किया जाना है ।

प्रस्तुत कार्य जीन चिकित्सा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण योगदान देता है. विट्रो जीन साइलेंसिंग के लिए मानक बेंचमार्क लिपोफेक्टामीन २००० है । हमने दिखा दिया है कि फ्यूजेनिक psinps की तुलना में पछाड़ना प्रभाव पैदा कर सकते हैं, नहीं तो उच्च, क्षमता15. लाइपोफेक्टामीन २००० पर फ्यूजेनिक pSiNPs का प्रमुख लाभ प्रणालीगत इंजेक्शन के साथ vivo अनुप्रयोगों में के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है । जबकि अंय एजेंटों, इस तरह के रूप में invivofectamine ३.०, vivo उपयोग करता है के लिए commercialized किया गया है, वे केवल जिगर की डिलीवरी के लिए उपयुक्त हैं, और रासायनिक संशोधित सिरनास (के साथ या बिना overhangs, या बंद न्यूक्लिक एसिड (lna) संरचना में) की आवश्यकता को बढ़ाने के लिए स्थिरता और विशिष्टता । 16 , 17 , 18 तथापि, फ्यूजेनिक psinps को संशोधित किया जा सकता है के बाद संश्लेषण को सरल thiol-maleimide रसायन विज्ञान के साथ को लक्षित moieties, जिसमें एक thiol समूह लक्ष्यीकरण पेप्टाइड में (जो इस प्रयोजन के लिए एक अतिरिक्त सिस्टीन किया जाता है) बांध एक फ्यूजेनिक कोटिंग में PEGylated लिपिड्स के अंत में maleimide अंगूठी में डबल बंधुआ कार्बन । इसके अलावा, सेल साइटोप्लाज्म के लिए उच्च द्रव्यमान लदान और वितरण प्रभावकारिता intracellular विशिष्टता के लिए आवश्यकता को कम करता है और गैर संशोधित सिरनास15के साथ मजबूत जीन साइलेंसिंग प्रभाव प्राप्त । फ्यूजेनिक psinps की एक खामी यह है कि संश्लेषण प्रोटोकॉल एक बहु दिन की प्रक्रिया है कि वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक एजेंटों की तुलना में अधिक जटिल है । हालांकि, जबकि बेंचमार्क उत्पादों हौसले से पहले से तैयार किया जाना चाहिए अभिकर्मक के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, फ्यूजेनिक psinps और aliquoted किया जा सकता है के लिए जमे हुए कम 30 दिनों के बिना पछाड़ना दक्षता ह्रासमान ।

इस पद्धति के लिए भविष्य के अनुप्रयोगों में शामिल है लोड हो रहा है और बड़े न्यूक्लिक एसिड पेलोड के वितरण के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन, जैसे mrnas और cdnas । इसके अतिरिक्त, crispr के वितरण/Cas9 प्रोटीन-sgrna परिसर, या Cas9 mrna और sgrna का कॉकटेल, भी एक विकास विकल्प है, के रूप में प्रणाली ऋणायनी पेलोड लदान के लिए इष्टतम है । कुल मिलाकर, एफ psinp प्रणाली जीन चिकित्सा के लिए एक मॉड्यूलर नैनोप्लफार्म संक्रमण से परे रोगों के इलाज के लिए है, वायरल संक्रमण, कैंसर सहित, और स्व-प्रतिरक्षित रोगों ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MJS Spinnaker Biosciences, Inc के एक वैज्ञानिक संस्थापक है, और कंपनी में एक इक्विटी ब्याज है ।  यद्यपि इस अनुदान को परियोजना के समग्र कार्यक्षेत्र और स्पिनेकर बायोसाइंसेज, इंक को उसके संभावित लाभ के आधार पर ब्याज प्रबंधन के टकराव के लिए अभिज्ञात किया गया है, तथापि इस विशेष प्रकाशन में शामिल शोध निष्कर्षों से यह आवश्यक नहीं हो सकता स्पिनाकर बायोसाइंसेज, इंक के हितों से संबंधित हैं । इस व्यवस्था की शर्तों की समीक्षा की है और कैलिफोर्निया, सैन डिएगो विश्वविद्यालय द्वारा अपनी ब्याज नीतियों के संघर्ष के अनुसार में मंजूरी दे दी है । अन्य लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह कार्य अनुबंध # R01 AI132413-01 के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).

Tags

इंजीनियरिंग अंक १४६ झरझरा सिलिकॉन nanomedicine दवा वितरण जीन थेरेपी सिरना संश्लेषण नैनोलेख लिपोकुछ फ्यूजन ओलिगोन्यूक्लिओटाइड पछाड़ा
संश्लेषण, Functionalization, और के लक्षण वर्णन फ्यूजेनिक छिद्रपूर्ण सिलिकॉन के लिए नैनो कणों के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिलिवरी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis,… More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter