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Engineering

Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59440
Automatic Translation
1, 1,2
1Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

Summary

Wir zeigen die Synthese von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für effektive in vitro und in vivo Oligonukleotid-Lieferung. Poröses Silizium-Nanopartikeln sind beladen mit SiRNA den Kern bilden die durch Fusogenic Lipide durch Extrusion die Shell zu bilden beschichtet ist. Targeting glyko-Funktionalisierung und Partikelcharakterisierung sind im Preis inbegriffen.

Abstract

Mit dem Aufkommen der Gentherapie ist die Entwicklung einer wirksamen in-vivo-Nukleotid-Nutzlast-Delivery-System der Parallelimport geworden. Fusogenic poröse Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) haben vor kurzem gezeigt, hohen in-vivo Gen-silencing Wirksamkeit aufgrund seiner hohen Oligonukleotid Tragfähigkeit und einzigartige zelluläre Aufnahme Weg, der Endozytose vermeidet. Die Synthese von F-pSiNPs ist ein mehrstufiger Prozess, der enthält: (1) laden und Abdichtung des Oligonukleotids Nutzlasten in den Silizium-Poren; (2) gleichzeitige Beschichtung und Dimensionierung der Fusogenic Lipide um die poröse Silizium-Kerne; und (3) Konjugation von targeting Peptide und waschen um überschüssige Oligonukleotid, Silizium Schmutz und Peptid zu entfernen. Die Partikel Größe Einheitlichkeit zeichnet sich durch dynamische Lichtstreuung und seine Kern-Schale-Struktur von Transmissions-Elektronenmikroskopie überprüft werden kann. Die Fusogenic-Aufnahme ist durch das Laden eines lipophilen validiert färben, 1, 1'-Dioctadecyl-3,3, 3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI), in der Fusogenic-Lipid-Bilayer und behandeln Sie es um Zellen in vitro Plasmamembran Färbung im Vergleich zu beobachten endocytic Lokalisierungen. Targeting und in-vivo Gen-Silencing-Wirksamkeiten wurden zuvor in einem Mausmodell der Staphylococcus Aureus Lungenentzündung, quantifiziert in denen targeting Peptid wird voraussichtlich die F-pSiNPs zu Haus, um den Ort der Infektion zu helfen. Über ihre Anwendung in S. Aureus -Infektion kann das F-pSiNP-System zur jeder Oligonukleotid für Gen-Therapie einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich virale Infektionen, Krebs und Autoimmunerkrankungen zu liefern.

Introduction

Gentherapie moduliert spezifische Genexpression um ein therapeutisches Ergebnis zu erhalten. Zahlreiche Werkzeuge für gen-Modulation entdeckt und untersucht, einschließlich der Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi) mit Oligonukleotiden (z. B. kurze interferierende RNA (SiRNA)1,2, MicroRNA (MiRNA)3,4 ), DNA Plasmide5,6, Nukleasen (z. B. Zinkfinger, TALENS)7,8und CRISPR/Cas9 Systeme9,10. Während jedes Werkzeug Wirkmechanismus unterscheidet, müssen alle Werkzeuge der Zelle Zytoplasma oder Nucleus aktiv sein erreichen. So, während diese Werkzeuge induzieren signifikanten Effekt Modulation der gen-Expression in vitro nachgewiesen haben, leidet die in-vivo Wirksamkeit extrazellulären und intrazellulären Hindernisse. Da die Werkzeuge der biologischen Ursprungs sind, gibt es viele Enzyme und Abfertigungssysteme in unserem Körper, die Fähigkeit zu degradieren oder fremde Moleküle11zu entfernen. Auch in dem Fall, dass die Werkzeuge die Zielzelle erreichen leiden sie Endozytose; ein Modus der zelluläre Aufnahme, die kapselt und fallen die Werkzeuge im sauren Magen-wie Bläschen, die verschlechtern oder die Werkzeuge aus der Zelle zu vertreiben. In der Tat haben Studien gezeigt, dass Lipid Nanopartikel Endocytosed über Macropinocytosis, von denen etwa 70 % der SiRNA aus den Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aufnahme12,13exocytosed sind. Der Großteil der verbleibenden SiRNA sind durch die lysosomalen Pathway abgebaut und letztlich erreichen nur 1-2 % der SiRNA, die zunächst die Zelle mit den Nanopartikeln betritt Endosomal Flucht potenziell RNAi13,14 unterziehen .

Wir haben vor kurzem Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) entwickelt, die einen SiRNA-geladenen Kern bestehend aus porösem Silizium-Nanopartikeln und Fusogenic Lipid Schale15haben. Die F-pSiNPs präsentieren drei große Vorteile gegenüber anderen konventionellen Oligonukleotid-Delivery-Systeme: (1) ein Fusogenic Lipid Beschichtung, wodurch die Teilchen zu umgehen Endozytose und liefern die gesamte Nutzlast direkt in das Zytoplasma der Zelle (im Gegensatz zu den 1 %-2 % erzielt durch Endocytosed Partikel13,14) (Abbildung 1). (2) hohe Masse geladen von SiRNA in der pSiNPs (> 20 Gew.-% im Vergleich zu 1-15 Gew.-% von herkömmlichen Systemen)15, die schnell im Zytoplasma verschlechtern (Sobald die Core-Partikel die Lipid-Beschichtung über Fusogenic Aufnahme Schuppen), lassen Sie die SiRNA; (3) gezielt Peptid Konjugation für selektive Homing, Zelltypen in-vivo gewünscht.

Die F-pSiNP-System hat bedeutende Gen-silencing Wirksamkeit gezeigt (> 95 % in-vitro-; > 80 % in-vivo) und anschließende therapeutische Wirkung in einem tödlichen Mausmodell der S. Aureus -Pneumonie; die Ergebnisse waren vorher15veröffentlicht. Allerdings erfordert die komplexe Struktur des F-pSiNP Systems Feingefühl und fein abgestimmte Optimierung, homogen und beständig Nanopartikel zu generieren. So soll der Zweck dieser Arbeit eine gründliche Protokoll sowie Optimierung von Strategien für die Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von F-pSiNPs in gezielte Bereitstellung von SiRNAs für potente Gen-Silencing-Effekt verwendet werden.

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Protocol

1. Zusammenfassung der poröse Silizium-Nanopartikeln (pSINPs)

Achtung: Seien Sie immer vorsichtig, beim Arbeiten mit Fluorwasserstoffsäure (HF). Folgen Sie alle Reiseführer in Sicherheit nach seiner Sicherheitsdatenblatt (SDB) zu, behandeln Sie keine HF-haltigen Chemikalien in einer Dampfhaube und tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA, doppelte Handschuhe mit Butyl Handschuhe auf der Außenseite, Butyl-Schürze mit Laborkittel unter Gesicht Schild mit Schutzbrille unter). Alle Universitäten und Forschungs- und Entwicklungslabors erfordern spezifische Schulungen zu HF-Sicherheit vor dem Gebrauch. Versuchen Sie nicht, mit HF ohne Pre-Approval von Ihrem lokalen Labor Sicherheitskoordinator zu arbeiten, da zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen, die hier nicht beschrieben erforderlich sind.

  1. Vorbereitung der Radierung Lösungen
    1. Um die 3:1 HF-Lösung für Radierung (verwendet in Schritte 1.3 und 1.4), füllen Sie eine Plastik machen Schloss Zylinder mit wässrigen 48 % HF 30 mL und 10 mL absolutes Ethanol (EtOH). Die Lösung muss in hoher Dichte Kunststoffe (z. B. HDPE) enthalten sein, wie die HF Glas auflöst.
    2. Zu einem 01:29 Schloss HF-Lösung für Lift-Off (verwendet in Schritt 1.5), füllen Sie eine Plastik Zylinder mit 1 mL wässrige 48 % HF und 29 mL absolutes Ethanol. Die Lösung muss in hoher Dichte Kunststoffe (z. B. HDPE) enthalten sein, wie die HF Glas auflöst.
    3. Machen die 1 M KOH-Lösung in 10 % EtOH für überschüssige pSi Auflösung (verwendet in Schritte 1.3 und 1.5).
  2. Einrichten der Etch-Zelle
    1. In einer Teflon Ätzen Zelle mit 8,6 cm2 Ätzen gut (Bereich ergibt sich durch die Messung des Durchmessers der Siliziumoberfläche für Radierung innerhalb des o-Rings und Berechnung der Fläche a = πr2), legen Sie in absteigender Reihenfolge (Abbildung 2a): (1) die Teflon Zelle oben; (2) ein o-Ring; (3) ein Viertel Stück der Einkristall (1 0 0) - orientierten p ++ - Typ Silizium-Wafer Vierteln (mit einem Diamantschleifer); (4) Alu-Folie; und (5) die Teflon-Zelle mit Schrauben festgezogen sanft auslaufen zu verhindern.
    2. Füllen Sie den Brunnen mit EtOH. Nehmen Sie ein Tuch und legen Sie in den Spalt zwischen Teflon Zelle oben und unten. Wenn das Tuch trocken nach dem entfernen ist, ist die Ätzen Zelle versiegelt. Wenn nass, die Zelle ist undicht, und ziehen Sie weiter die Schrauben bis versiegelt.
  3. Elektropolieren der Silizium-wafer
    1. Bringen Sie die montierte Etch-Zelle in einer Dampfhaube.
    2. Füllen Sie den Brunnen mit 10 mL 3:1-HF-Lösung.
    3. Verbinden Sie die Plusleitung mit Aluminiumfolie (Elektrode) aus der Zelle Ätzen und verbinden Sie das negative Kabel der Platin Spule (Gegenelektrode) eingebettet in der 3:1 HF-Lösung der nächsten Zelle Etch für den Schaltkreis (Abb. 2 b).
    4. Führen Sie eine konstanten Strom bei 50 mA cm-2 für 60 s. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen, und spülen Sie sorgfältig mit einer Spritze 3:1-HF. Spülen Sie dreimal mit EtOH.
    5. Auflösen entfernt die geätzte Schicht füllen Sie die nun langsam mit 10 mL 1 M KOH. Warten Sie, bis das sprudeln nachlässt.
    6. Spülen Sie die KOH mit Wasser dreimal, und dann mit EtOH dreimal.
  4. Elektrochemisch Ätzen poröse Schichten in Silizium-wafer
    1. Führen Sie einen Wechselstrom einer quadratischen Wellenform mit niedrigeren Current density von 50 mA/cm2 für 0,6 s und hohe Stromdichte von 400 mA/cm2 für 0,36 s für 500 Zyklen wiederholt.
    2. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen, und spülen Sie sorgfältig mit einer Spritze 3:1-HF. Spülen Sie dreimal mit EtOH.
  5. Heben Sie die poröse Schicht aus dem Siliziumwafer
    1. Füllen Sie den Brunnen mit 10 mL 01:29 HF-Lösung.
    2. Führen Sie eine konstante von 3,7 mA/cm2 für 250 s. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen. Die pSi-Schicht möglicherweise sichtbare Wellen angibt Loslösung von kristallinen Silizium-Wafer. Vorsichtig waschen Sie, die 01:29 HF-Lösung und spülen Sie mit EtOH dreimal, dann mit Wasser dreimal.
    3. Mit einer Pipettenspitze, fest den Umfang der pSi-Ebene für die vollständige Ablösung zu knacken. Mit EtOH, Ätzen Sie sammeln die pSi-Fragmente (Chips) aus Teflon Zelle in ein mit einem Gewicht von Boot. Übertragen Sie die Chips auf eine Glasflasche. Die pSi-Chips können für mehr als 6 Monaten für die Lagerung bei Raumtemperatur in EtOH gehalten werden.
    4. Lösen sich entfernt alle verbleibenden poröse Silizium auf dem Wafer durch Ausfüllen des Brunnens langsam mit 10 mL 1 M KOH. Warten Sie, bis das sprudeln nachlässt.
    5. Spülen Sie die KOH mit Wasser dreimal, und dann mit EtOH dreimal.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,5, bis die gesamte Waferdicke geätzt wurden.
  6. Beschallen poröse Schichten für Nanopartikel Bildung
    1. Das Lösungsmittel der Glasfläschchen mit pSi-Chips von EtOH zu 2 mL VE-Wasser zu ersetzen.
    2. Fest schließen Sie den Deckel und Dichtung mit Parafilm.
    3. Ort das Glas in einem Sonikator Bad Fläschchen und ausgesetzt, so dass das Volumen der pSi-Chips unter der Oberfläche vollständig eingetaucht sind.
    4. Für 12 h bei 35 kHz und HF-Leistung 48W beschallen. Um erhebliche Wasserverlust bei Beschallung zu vermeiden, legen Sie eine volumetrische Flasche gefüllt mit Wasser, invertiert, so dass die Öffnung des Kolbens die Oberfläche des Wasserbades berührt.
    5. Legen Sie die Glasflasche auf eine Ebene Fläche für 1 h erlauben größere Partikel auf dem Boden zu begleichen. Den Überstand mit einer Pipette zu sammeln; die Suspension enthält unter 100 nm pSiNPs.

2. Vorbereitung des Fusogenic-Lipid-film

  1. Vorbereitung der Lipid-Stammlösungen
    1. Machen Sie unter einem Abzug 10 mg/mL Bestände von Lipiden durch feuchtigkeitsspendende DMPC, DSPE-PEG-MAL und DOTAP Lipide in Chloroform. Diese Stammlösungen können bis zu 6 Monaten unter engen Parafilm Siegel bei-20 ° C aufbewahrt werden.
  2. Die Fusogenic-Lipid-Film zu machen
    Hinweis: Die Fusogenic Zusammensetzung der Lipide, DMPC, DSPE-PEG und DOTAP, das molare Verhältnis von 76.2:3.8:20 und 96.2:3.8:0, bzw. erfolgt auf.
    1. Mischen Sie in eine Glasflasche 72,55 μL DMPC, 15,16 μL der DSPE-PEG und 19.63 μL des DOTAP durch pipettieren.
    2. Optional: Für fluoreszierende Kennzeichnung der Lipid-Beschichtung, zusätzlich schreibe 20 µL DiI in einer Konzentration von 1 mg/mL EtOH aufgelöst.
    3. Legen Sie das Fläschchen in einer Abzugshaube mit einer losen Kappe zu Chloroform über Nacht verdunsten zu lassen. Der getrocknete Film wird eine trübe schwer gelartige Substanz an der Unterseite der Flasche sein.

(3) be- und Abdichtung von SiRNA in pSiNPs

  1. Vorbereitung von Kalzium-Chlorid Lager laden
    1. Auflösen von 1,11 g CaCl2 in 10 mL RNAse-freies Wasser, eine 2 M CaCl2 -Lösung zu machen.
    2. Zentrifugieren Sie die Lösung bei > 10.000 x g für 1 min zum begleichen der Aggregate und den Überstand mit einer Pipette zu sammeln. Alternativ filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-filter
  2. Vorbereitung der SiRNA Lager laden
    1. Hydrat oder die SiRNA bis 150 µM in RNAse-freies Wasser zu verdünnen. Diese Stammlösung möglicherweise regelmÄÑig und für mindestens 30 Tage bei-20 ° C eingefroren aufbewahrt, angesichts der Tatsache, dass es nicht häufigen Frost-Tau-Wechseln unterzogen.
  3. Laden die SiRNA in pSiNPs mit Calciumchlorid
    1. Bereiten Sie eine eisgekühlten Beschallung Bad.
    2. Weniger als 15 min Ultraschall, sanft Pipette 150 µL von SiRNA und 700 µL 2 M CaCl2 in 150 µL des pSiNP. Achten Sie darauf, den Deckel des Microcentrifuge Schlauch für Gaserzeugung offen lassen.
    3. Entfernen Sie die Röhrchen mit 1 mL der SiRNA-geladenen Kalzium beschichtet pSiNPs aus der Sonikator.

(4) Beschichtung SiRNA beladenen pSiNPs mit Fusogenic Lipide

  1. Vorbereitung der Liposomen-Extrusion-Kit
    1. Füllen Sie einen großen Becher mit VE-Wasser. Einweichen 1 Polycarbonat Membran (200 nm Poren), und 4 Filter unterstützt durch auf Wasseroberfläche schwimmt. Montieren Sie das Liposomen-Extrusion-Kit, indem Sie nach Anweisungen des Herstellers
  2. Feuchtigkeitsspendende Lipid-Film mit SiRNA geladen pSiNps
    1. Die getrockneten Lipid-Film in der Glasflasche mit 1 mL der SiRNA-geladenen Kalzium beschichtet pSiNPs gewonnenen Schritt 3.3.3 Hydrat. Pipette bis alle Lipide Film haben vom Boden des Röhrchens gehoben und in eine trübe homogene Lösung gemischt haben.
    2. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in der Glasflasche, und legen Sie das Fläschchen auf einer Heizplatte, die Partikel auf 40 ° C (oder hoch genug über die Lipide Phase Umwandlungstemperatur weiterhin die Lipide in der mehr fluidische Flüssigkristall-Phase) zu heizen zwar magnetisch Rühren die Lösung für 20 Minuten.
  3. Extrudieren der Lipid-beschichtete pSiNPs für Steuerung
    1. Aspirieren Sie 1 mL der Lipid-beschichtete pSiNP-SiRNA-Lösung in der Extrusion Spritze. Legen Sie eine leere Spritze auf der einen Seite des Extruders und die gefüllte Spritze am anderen Ende.
    2. Beginnen Sie Extrusion, indem der Kolben langsam auf die Partikel aus einer Spritze durch die Polycarbonat-Membran und ineinander zu schieben. Wiederholen Sie 20 Mal. Wenn der Kolben klemmt, können der Filter und die Membrane verstopft werden. Zerlegen des Extruders und ersetzen Sie die Membrane und Filter unterstützt. Wenn das Problem weiterhin besteht, verdünnen Sie die Partikel bis Verstopfung überschaubar ist.
    3. Sammeln Sie die extrudierten Partikel zu einem Microcentrifuge Schlauch.

(5) Konjugation von targeting Peptide

  1. Konjugation targeting Peptid Lipid-Beschichtung
    1. Bereiten Sie die Peptid-Aktie mit einer 1 mg/mL Peptid-Konzentration in RNAse-freies Wasser.
    2. Im Microcentrifuge Schlauch mit Fusogenic hinzufügen Lipid-beschichteten pSiNPs, 100 µL 1 mg/mL Peptid Lager und Pipettieren sanft. Halten Sie das Rohr statische bei Raumtemperatur für 20 min (Alternativ > 2 h bei 4 ° C).
    3. Um überschüssige Peptid oder SiRNA und anderen Hilfsstoffen zu entfernen, waschen Sie in einem 30 kDa zentrifugale Filter von Spinnen bei 5.000 X g bei 25 ° C für 1 h Zentrifuge noch zweimal mit 1 mL PBS unter die gleiche Einstellung.
    4. Aufschwemmen der endgültigen Peptid konjugiert Fusogenic Lipid-beschichtete pSiNPs mit PBS-Puffer auf die gewünschte Konzentration. Die Partikel können jetzt regelmÄÑig und gefrorenen bei-80 ° C für die Lagerung von mindestens 30 Tage sein.

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Representative Results

Eine gelungene Synthese aus Fusogenic pSiNPs sollte eine homogene, etwas undurchsichtige Lösung (Abbildung 3a) produzieren. Versagen, das Verhältnis und die Konzentration von pSiNPs zu optimieren: SiRNA: CaCl2 Aggregation nach dem Laden (Abb. 3 b) führen kann. Wie die Partikel durch 200 nm Membranen extrudiert werden, sollte die hydrodynamische Durchmesser von der Fusogenic pSiNPs DLS gemessen ca. 200 nm, und die durchschnittliche Zeta-Potential ca. + 7 mV wie in Abbildung 4dargestellt. Nach Oberflächenmodifikation mit targeting Peptide, der Gesamtdurchmesser sollte erhöht werden, um unter 230 nm und die durchschnittliche Zeta-Potential sank hinunter -3,4 mV15. Große Abweichungen von der Extrusion Größe ist bezeichnend für fehlgeschlagene Extrusion (dPartikel >> dExtrusion), oder Fehler beim Laden (dPartikel << dExtrusion). Aggregationen möglicherweise auch mit DLS quantifiziert werden. Darüber hinaus müssen die eingefrorenen aliquoten aufgetaut werden, nur einmal, als wiederholte Frost-Tau-Zyklen stören die Lipidmembran und intraparticular Fusion und Aggregation (Abbildung 4). Wie Abbildung 4a zeigt, kann Fusogenic pSiNPs für 30 Tage gespeichert und aufgetaut, ohne dass es zu strukturelle Veränderungen. Jedoch wiederholt Frost-Tau-Zyklen von einem einzigen aliquoten verursachen schwere Aggregation (d >> 1.000 nm) und innerhalb von 4 Tagen des täglichen Zyklus (Abbildung 4 b), so ist es ratsam, dass die Partikel regelmÄÑig, Einweg-Bände werden.

Fusion kann bestätigt werden, durch Kennzeichnung der Fusogenic Lipide mit lipophilen DiI (Schritt 2.2.2), und beobachten die in-vitro-Lokalisierung mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Abbildung 1 d zeigt erfolgreiche Fusion, wo die Fusogenic pSiNP Lipide die DiI auf der Plasmamembran übertragen und sind unabhängig von Lysosomen lokalisiert. Erfolglose Fusion wird die DiI Lokalisierung innerhalb der Zelle Zytoplasma und NS1 mit Lysosomen (Abbildung 1 c) zeigen.

Figure 1
Abbildung 1: Fusogenic poröses Silizium Nanopartikel System (F-pSiNP). (ein) Schaltplan zeigt endocytic Aufnahme von konventionellen Nanopartikel und anschließende Endosomal Einklemmung. (b) Schaltplan zeigt Fusogenic Aufnahme der F-pSiNPs und der cytosolischen Nachlieferung der SiRNA-Nutzlast. (c) konfokale mikroskopische Bild eines CAOV-3-Zelle, die Endocytosed nicht Fusogenic pSiNPs hat, die mit DiI lipophile Farbstoff geladen wurden. CAOV-3 Zellen wurden gezüchtet um 80 % Zusammenfluss in einem 6-Platte, mit 10 µL von Nanopartikeln behandelt und bei 37 ° C in 5 % CO2 für 15 min inkubiert. Die Zellen wurden in 1 % Paraformaldehyd auf Objektträgern mit DAPI montiert werden fixiert, getrocknet und gehalten in der Dunkelheit bis konfokalen Mikroskopie untersucht. (D) konfokale mikroskopische Bild einer CAOV-3-Zelle, die Fusogenic pSiNPs aufgenommen hat, die mit DiI lipophile Farbstoff geladen wurden. Zellen wurden mit LysoTracker Green für 1 h bei 37 ° C in 5 % CO2 nach Herstellerangaben bereits gefärbt. Die Zellen wurden dann PBS dreimal gewaschen und mit 10 μL der DiI-geladenen Teilchen für 15 min behandelt wurden. Die Zellen wurden mit PBS dreimal gewaschen, um alle Partikel zu entfernen, die nicht aufgegriffen wurden, und die Brunnen waren gefüllt mit 1 mL PBS und sofort für das live Cell Imaging von konfokalen Mikroskopie genommen; DAPI steht für nukleare Fleck und Lysosomen für lysosomale Färbung von LysoTracker Green; Maßstabsleiste stellt 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Etch Zelle Setup. (ein) Schaltplan zeigt Ätzen Zellbestandteile und Montageauftrag; und (b) Darstellung der Setup für elektrochemische Ätzen von Silizium. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Foto des Endprodukts F-pSiNP. (ein) erfolgreiche Synthese zeigt homogene und trübe Lösung; (b) erfolglos Synthese zeigt Aggregation der Partikel (gelb). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: wiederholte Frost-Tau-Zyklus von Fusogenic pSiNPs verursachen Aggregation. (ein) durchschnittliche Größe und Zeta-Potential von Fusogenic pSiNPs bleibt für 30 Tage stabil, wenn aufgetaut, sobald nach dem Einfrieren; (b) durchschnittliche Größe und Zeta-Potential von Fusogenic pSiNPs zeigt Zeichen der Aggregation und Verlust der strukturellen Integrität innerhalb von 4 Tagen nach täglich Frost-Tau-Zyklen durchlaufen. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung (n = 5). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Diagramm der poröse Silizium-Nanopartikel-Synthese. Schaltplan zeigt elektrochemische Ätzen von Silizium-Wafer (Schritt 1.4), Lift-off der porösen Schicht (Schritt 1.5), Beschallung der porösen Schicht in Partikel und Sammlung von porösem Silizium-Nanopartikeln (Schritt 1.6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Synthese von porösem Silizium-Nanopartikeln ist in Abbildung 5dargestellt. Der entscheidende Schritt bei der Synthese von Fusogenic pSiNPs ist im Laden Schritt (Schritt 3). Wenn die Fusogenic Nanopartikel aggregieren sind Post-Synthese (Abbildung 3), kann aufgrund der folgenden Gründe geben: (1) Kalzium-Chlorid-Lager war nicht homogen bereit, damit Schritt 3.1.2 muss sorgfältig gefolgt oder verfeinert; oder (2) das Verhältnis der pSiNP: SiRNA: CaCl2 oder die Konzentration eines oder mehrerer der drei Komponenten möglicherweise nicht optimal. Erneute Optimierung ab CaCl2 Konzentration wird vorgeschlagen (z. B. Änderung von 2 M bis 1 M oder 3 M). Darüber hinaus ist es wichtig, um sicherzustellen, dass das CaCl2 vom selben Hersteller ist, wie wir fanden, dass die gleiche Chemikalie von verschiedenen Anbietern führte zu niedrigeren pH-Wert an der Belastung Schritt und nachfolgende Fehler beim Laden der SiRNA. Der pSiNPs kann auch verdünnt oder weitere Geschädigte vor dem Ladevorgang konzentriert, werden durch Verlassen der Schwebeteilchen in der RNAse-freies Wasser für 2 Tage nach Schritt 1.6.6.

Nach dem Laden führt die Lipid Beschichtung oft zu Schwierigkeiten bei der Extrusion aufgrund der Konzentration oder Dichte der Partikel (Schritt 4). Wenn die Extrusion Membrane verstopft ist, kann zwingt die Extrusion die Membran rip. Zerlegen Sie bei Verstopfung Extruder zu und ersetzen Sie die Membran und die Stützen mit einem neuen Satz zu, wenn der Verlust von Verstopfung klein ist. Wenn der Verlust groß ist, verdünnen Sie die Partikel-Aussetzung und 30 s vor der Extrusion beschallen. Wenn das Problem weiterhin besteht, empfiehlt sich eine Optimierung der pSiNP Größe und Beladung Verhältnis Aggregate zu minimieren. Zu guter Letzt empfehlen wir filtern die Partikel Suspension durch einen 0,22 µm-Poren-Filter, Verunreinigungen oder Aggregate vor der Zelle oder Behandlung von Tieren zu beseitigen. Filterung ist besonders ratsam, wenn die Partikel synthetisiert wurden in einer nicht-sterilen Umgebung oder nach dem Auftauen einer eingefrorenen aliquoten der Partikel.

Die Fusogenicity der Partikel kann überprüft werden, durch konfokale Mikroskopie (wie in Abbildung 1 c, d) und Transmissions-Elektronenmikroskopie der Zellen behandelt mit den Partikeln, für poröse Silizium Lipid-Schuppen Kerne im Zytoplasma zu beobachten 15.

Die Fusogenic pSiNPs und dessen Synthese Protokoll haben einige Einschränkungen. Für in-vitro-Gen-silencing Anwendungen, die vorgestellten Fusogenic pSiNPs erwiesen sich als induzieren > 90 % Knockdown Effizienz in einer Reihe von Zelllinien bei 100 nM-Dosis; einschließlich der Neuro-2a Maus Neuroblastom-Zell-Linie, die CAOV-3 menschlichen Eierstock-Krebs-Zell-Linie und die notorisch schwierig zu transfizieren RAW 264,7 Maus Makrophagen-Zelllinie. Allerdings haben wir beobachtet > Knockdown Wirkungsgrad von 50 % auf so niedrig wie 25 nM-Dosis, die von Lipofectamine vergleichbar war. Während kationischen Lipide minimal verwendet werden müssen, zytotoxische Wirkung zu reduzieren, haben wir die Sicherheit bei einer Lipid-Dosis von 1 mg15möglichst hoch zuvor gezeigt. Für in-vivo Gen-silencing Anwendungen sind die Fusogenic pSiNPs durch Selektivität begrenzt. Die kationischen Lipide elektrostatisch auf jeder Zellmembran zu gewinnen, die Partikel müssen verwendet werden, wie ein einheimischer therapeutische oder Oberfläche mit einer targeting Abstimmungsunterlagen (z. B. Peptide, Antikörper) geändert werden. Die Synthese-Protokoll für Fusogenic pSiNPs ist derzeit optimiert und für SiRNA Lieferung nur begrenzt. Dieselbe Methode wurde erfolgreich geladen MiRNA überprüft und wird theoretisiert, um mRNA, cDNA und andere größeren Nutzlasten Nukleotid laden zu können, aber diese müssen noch optimiert werden.

Die vorgestellte Arbeit macht einen wesentlichen Beitrag auf dem Gebiet der Gentherapie. Die standard-Benchmark für in-vitro-Gen-silencing ist die Lipofectamine 2000. Wir haben gezeigt, dass die Fusogenic pSiNPs Knockdown Effekt vergleichbar, induzieren können, wenn nicht höhere Wirkungsgrade15. Der große Vorteil der Fusogenic pSiNPs über Lipofectamine 2000 ist seine Fähigkeit, für in-vivo Anwendungen mit systemischen Injektionen verwendet werden. Während andere Mittel, wie Invivofectamine 3.0, für in-vivo Anwendungen vermarktet worden, sie eignen sich nur für die Leber Lieferung, und erfordern chemisch modifizierten SiRNAs (mit oder ohne Überhänge oder verschlossene Nukleinsäure (LNA) Struktur) zu erhöhen Stabilität und Spezifität. 16 , 17 , 18 Fusogenic pSiNPs kann jedoch geänderte Post-Synthese targeting Moieties mit einfachen Thiol-Maleimide Chemie, konjugieren, wobei eine Thiol-Gruppe in das targeting Peptid (die eine extra Cystein zu diesem Zweck trägt) bindet eine Doppel-gebundenen Kohlenstoff in den Maleimide-Ring am Ende des pegylierten Lipide in der Fusogenic-Beschichtung. Darüber hinaus das Hochamt Verladung und Lieferung Wirksamkeit der Zelle Zytoplasma minimiert die Notwendigkeit zur intrazellulären Spezifität und starke Gen-silencing-Effekt mit unveränderten SiRNAs15erreicht. Ein Nachteil der Fusogenic pSiNPs ist, dass die Synthese-Protokoll einen mehrtägigen Prozess, der komplexer als die im Handel erhältlichen Transfektion Agenten ist. Während die Benchmark-Produkte frisch vor Transfektion bereit sein müssen, die besten Ergebnisse zu erzielen, kann die Fusogenic pSiNPs regelmÄÑig und gefrorenen für mindestens 30 Tage jedoch ohne Beeinträchtigung der Knockdown Effizienz.

Zukünftige Anwendungen für diese Methode sind Optimierungen für Verladung und Lieferung von größeren Nukleinsäure-Nutzlasten, wie mRNAs und cDNAs. Darüber hinaus ist Lieferung der CRISPR/Cas9-Protein-SgRNA-Anlage oder ein Cocktail aus der Cas9 mRNA und SgRNA, auch eine Entwicklungsoption, da das System optimal ist für das Laden von anionischen Nutzlasten. Insgesamt ist die F-pSiNP-System eine modulare Nanoplatform für Gen-Therapie zur Behandlung von Krankheiten über Infektionen, einschließlich virale Infektionen, Krebs und Autoimmunerkrankungen.

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Disclosures

MJS ist eine wissenschaftliche Gründer der Spinnaker Biosciences, Inc., und verfügt über eine Kapitalbeteiligung an der Gesellschaft.  Dieser Zuschuss für Interessenkonflikt Management basierend auf den gesamten Umfang des Projekts und der potenzielle Nutzen für Spinnaker Biosciences, Inc., identifiziert wurde zwar die Forschungsergebnisse, die in dieser besonderen Veröffentlichung enthaltenen nicht unbedingt beziehen sich auf die Interessen der Spinnaker Biosciences, Inc. Die Bedingungen dieser Vereinbarung haben überprüft und genehmigt von der University of California, San Diego gemäß ihrer Interessenkonflikt Politik wurde. Andere Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird unterstützt durch die National Institutes of Health durch Vertrag # R01 AI132413-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

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References

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Engineering drug Ausgabe 146 poröse Silizium Nanomedizin Delivery Gentherapie SiRNA Synthese Nanopartikel Liposomen Fusion Oligonukleotid Zuschlag
Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung
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Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis,… More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

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