Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.
Elektron mikroskobu (EM) kullanılarak biyolojik dokunun seri kesitlenmesi ve sonraki yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü görüntülenmiş yığınların 2D kullanılarak çözülemeyecek ultrayapısal desenleri ortaya çıkarmasını sağlar. Görüntü. Gerçekten de, ikincisi morfolojilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir, mitokondri durumunda olduğu gibi; bu nedenle 3D modellerin kullanımı giderek daha yaygın hale gelmekte ve morfoloji temelli fonksiyonel hipotezlerin formülasyonuna uygulanmaktadır. Bugüne kadar, ışık veya elektron görüntü yığınlarından oluşturulan 3B modellerin kullanımı nitel, görsel değerlendirmelerin yanı sıra nicelleştirmeyi de doğrudan 3D olarak gerçekleştirilmeye daha uygun hale getirir. Bu modeller genellikle son derece karmaşık olduğundan, bir sanal gerçeklik ortamı da tıkanıklık üstesinden gelmek ve 3D yapısı tam olarak yararlanmak için kurulması önemlidir. Burada, görüntü bölümlemeden yeniden yapılandırma ve çözümlemeye kadar adım adım kılavuz ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Otomatik seri bölüm ve görüntülemeye izin veren elektron mikroskobu kurulumu için önerilen ilk model 19811’ekadar uzanır; EM kullanarak görüntü büyük örnekler için bu tür otomatik, geliştirilmiş kurulumları difüzyon son on yıl içinde arttı2,3, ve etkileyici yoğun rekonstrüksiyonlar veya tam morfolojileri sergileyen eserler hemen takip4, 5,6,7,8,9,10.
Büyük veri kümelerinin üretimi, görüntü bölümlemi için geliştirilmiş ardışık hatlar gereksinimiyle birlikte geldi. RECONSTRUCT ve TrakEM211,12gibi seri bölümlerin manuel bölümleme için yazılım araçları iletim elektron mikroskobu (TEM) için tasarlanmıştır. Tüm süreç son derece zaman alıcı olabileceğinden, bu araçlar otomatik olarak son teknoloji ürünü, otomatik EM seri bölüm teknikleri (3DEM) ile oluşturulabilen binlerce seri mikrograf ile uğraşırken uygun değildir. blok-yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM)3 veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM)2. Bu nedenle, bilim adamları segmentasyon verimliliğini artırmak için yarı otomatik araçların yanı sıra tam otomatik araçlar geliştirmek için çaba sarf etti. Makine öğrenimi13 veya son teknoloji ürünü, eğitimsiz piksel sınıflandırma algoritmaları14’ütemel alan tam otomatik araçlar, daha büyük bir topluluk tarafından kullanılmak üzere geliştirilmektedir; yine de, segmentasyon hala tamamen güvenilir olmaktan uzaktır ve birçok eser hala segmentasyon süresi açısından verimsiz ama yine de tam güvenilirlik sağlar el emeği, dayanmaktadır. Ilastik15gibi yarı otomatik araçlar, gerçek bir düzeltme çerçevesi sağlamasa da, bir dereceye kadar düzeltilebilen segmentasyon için anında bir okuma sağladığından, daha iyi bir uzlaşmayı temsil eder ve entegre edilebilir paralel TrakEM2 kullanarak16.
Büyük ölçekli segmentasyon, bugüne kadar çoğunlukla konektomik lerle sınırlıdır; bu nedenle, bilgisayar bilim adamları en büyük, açıklamalı veri kümeleri entegre görselleştirmeler için çerçeveler sağlamak ve sinaptik kişilerin varlığı 17 ,18ile çıkarılan bağlantı desenleri analiz ilgileniyoruz. Bununla birlikte, 3B yapıların nitel değerlendirmeleri yerine nicel morfometrik analizler için doğru 3B rekonstrüksiyonlar kullanılabilir. NeuroMorph19,20 ve glikojen analizi10 gibi araçlar uzunlukları, yüzey alanları ve hacimleri için 3D rekonstrüksiyonları ölçümleri almak için geliştirilmiştir ve bulut noktalarının dağılımı, tamamen orijinal EM yığını8,10atarak . Astrositler ilginç bir vaka çalışmasını temsil eder, çünkü görsel ipuçlarının veya tekrarlayan yapısal örüntülerin eksikliği araştırmacılara bireysel yapısal birimlerin işlevi hakkında bir ipucu verir ve bunun sonucunda astrositik süreçlerin yeterli ontolojisinin eksikliği 21,analitik araçlar tasarlamayı zorhale getirin. Bir son girişimi Abstractocyteoldu 22, hangi astrositik süreçlerin görsel bir keşif ve astrositik süreçler ve nöritler arasındaki nitel ilişkilerin çıkarım sağlar.
Bununla birlikte, EM altında görüntü kesitli doku kolaylığı bozulmamış beyin örnekleri gizli bilgi miktarı çok büyük olduğu gerçeği ve tek bölümgörüntüleri yorumlayarak bu sorunun üstesinden gelebilir gerçeği geliyor. Beyindeki yapıların yoğunluğu o kadar yüksektir ki, aynı anda görülebilen birkaç nesnenin bile 3 boyutlu yeniden yapılandırmaları onları görsel olarak ayırt etmeyi imkansız kılar. Bu nedenle, yakın zamanda sanal gerçekliğin (VR) karmaşık yapıları gözlemlemek için geliştirilmiş bir yöntem olarak kullanılmasını önerdik. Biz oklüzyon üstesindenastrosit23 odaklanmak (ikinci bir ilgi nesnenin görünürlüğünü engelleme, bir 3D alanda) ve rekonstrüksiyonlar nitel değerlendirmeler imanları kolaylığı, redaksiyon dahil, yanı sıra nicelemeler uzaydaki nokta sayısını kullanarak özelliklerin. Yakın zamanda GLAM kullanımı ile VR görsel keşif kombine (glikojen kaynaklı laktat emilimi modeli), nöritlerin laktat mekik olasılık bir harita görselleştirmek için bir teknik, ışık yayan organları olarak glikojen granülleri dikkate alarak23; özellikle GLAM tarafından üretilen ışık tepelerini ölçmek için VR’ı kullandık.
Burada sunulan yöntem, fib-SEM veya diğer otomatik seri kesit ve görüntüleme teknikleri gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden gelsin, çok ölçekli bir EM veri setinin segmentasyonu ve 3D rekonstrüksiyonu için yararlı bir adım adım kılavuzdur. FIB-SEM, voxel boyutunda, odaklanmış bir iyon ışını kullanarak 5 nm’ye kadar ince keserek mükemmel izotropiye ulaşma avantajına sahiptir, fov’u yan objeler nedeniyle 15-20 m ile sınırlı olabilir, ki bu da muhtemelen kesilen dokunun birikmesi nedeniyle fo V bu değeri aşıyor. Bu tür eserler, mikroskop odası nın içindeki seri bölümleri kesmek için elmas bir bıçak kullanan SBEM gibi diğer teknikler kullanılarak önlenebilir. Bu ikinci durumda, z çözünürlüğü en iyi ihtimalle 20 nm civarında olabilir (genellikle, 50 nm), ancak piksel çözünürlüğü ilgi geniş bir bölge için tehlikeye gerekir rağmen, FOV daha büyük olabilir. Bu tür sınırlamalar (büyütme vs FOV) aşmak için bir çözüm fayans ilgi bölgesi bölmek ve her biri daha yüksek bir çözünürlükte elde etmektir. Burada hem temsili sonuçlarda bir SBEM yığın-veri kümesinin (i) hem de temsilci sonuçlarında FIB-SEM yığın-dataset (ii) sonuçlarını gösterdik.
Daha büyük ve daha büyük veri kümelerinin oluşturulması giderek yaygınlaştıkça, piksel sınıflandırması ve otomatik görüntü bölümleme için araçlar oluşturma çabaları çoğalıyor; Yine de, bugüne kadar, hiçbir yazılım güvenilirliği insan redaksiyon, bu nedenle hala gerekli, ne kadar zaman alıcı olursa olsun karşılaştırılabilir kanıtlamıştır. Genel olarak, veri kümesi (ii) durumunda olduğu gibi alt örneklenebilen daha küçük veri kümeleri, düzeltme süresi de dahil olmak üzere bir hafta içinde tek bir uzman kullanıcı tarafından yoğun bir şekilde yeniden oluşturulabilir.
Burada sunulan protokol özellikle üç yazılım programlarının kullanımını içerir: Fiji (sürüm 2.0.0-rc-65/1.65b), ilastik (sürüm 1.3.2 rc2) ve Blender (2.79), hepsi açık kaynak ve çoklu platform programları ve ücretsiz indirilebilir. Fiji ImageJ bir sürüme, biyolojik görüntü analizi için eklentileri tarafından desteklenmektedir. Bu sağlam bir yazılım mimarisine sahiptir ve yaşam bilim adamları için ortak bir platform olarak önerilmektedir ve TrakEM2, görüntü segmentasyonu için ilk ve en yaygın olarak kullanılan eklentileri içerir. Son zamanlarda birçok kullanıcı tarafından yaşanan bir sorun java 6 Java 8, uyumluluk sorunları yaratıyor geçiş; bu nedenle, Fiji’nin düzgün çalışmasına izin vermek için mümkünse Java 8’e güncellemekten kaçınmanızı öneririz. ilastik piksel sınıflandırması için bir dizi çerçeve sağlayan güçlü bir yazılımdır, her biri kendi web sitesinde belgelenmiş ve açıklanmıştır. EM yığınlarının yarı otomatik bölümlemasyonu için kullanılan oyma modülü, bilim adamlarının deneyimli bir kullanıcı için el ile çalışma için harcanan zamanı aylardan günlere düşürmelerine olanak tanıyan, tek bir tıklamayla tüm bir neurite olabileceği için çok zaman kazandırır. saniyeler içinde bölümlenir. Ön işleme adımı donanım açısından çok yoğundur ve burada sunulan SBEM yığını gibi çok büyük veri kümeleri, 26 GB’lık bir özellikti, belleğe sığacak tuhaf stratejiler gerektirir, çünkü büyük veri seti elde edilemeyeceğini göz önünde bulundurarak görüş ve çözüm alanı uzlaşma. Bu nedenle, alt örnekleme bu durumda uygun bir çözüm olmayabilir. Yazılımın en son sürümü güçlü bir Linux iş istasyonu ile birkaç saat içinde önişleme yapabilirsiniz, ancak segmentasyon dakika sürer ve yığın arasında kaydırma hala nispeten yavaş olacaktır. Biz hala ilk, kaba segmentasyon için bu yöntemi kullanmak ve TrakEM2 kullanarak proofread. Son olarak, Blender bir 3D modelleme yazılımı, güçlü bir 3D render motoru ile, hangi eklentileri olarak ana GUI gömülü olabilir python komut ile özelleştirilebilir, NeuroMorph ve glikojen analizi gibi. Bu yazılımın esnekliği, örneğin Fiji’nin aksine, büyük veri kümelerinin çevrimiçi görselleştirmesi için tasarlanmadığının dezavantajıile birlikte gelir; bu nedenle, büyük meshes (1 GB aşan) ile görselleştirme ve gezinme yavaş ve verimli olmayabilir. Bu nedenle, her zaman örgü karmaşıklığıazaltmak ama ilgi yapısının orijinal morfolojisi bozmak için dikkatli teknikleri seçmek için tavsiye edilir. Remesh işlevi kullanışlı dır ve NeuroMorph toplu alma aracının gömülü bir özelliğidir. Bu işlevle ilgili bir sorun, özgün kafesin tepe sayısına bağlı olarak, son çözümle ilgili octree derinlik değerinin buna göre değiştirilmesi gerektiğidir. Küçük nesneler küçük bir octree derinliği (örneğin 4) ile yeniden kullanılabilir, ancak aynı değer daha büyük değerlere ihtiyaç olan büyük nesnelerin morfolojisini bozabilir (en iyi ihtimalle 6, tam hücre gibi çok büyük bir ağ için 8 hatta 9). Nesnenin boyutu net değilse, bu işlemi yinelemeli yapmak ve farklı octree derinliklerini test etmek tavsiye edilir.
Daha önce de belirtildiği gibi, dikkate alınması gereken bir yönü kullanılan yazılım ile ilgili, yeniden yapılanma ve analiz, adanmış olması hesaplama gücüdür. Bu makalenin temsili sonuçlarında gösterilen tüm işlemler, AMD FirePro D500 Ekran kartı, 64 GB RAM ve 8 çekirdekli Intel Xeon E5 Işlemci ile donatılmış bir MacPro kullanılarak elde edilebilmektedir. Fiji büyük veri kümelerini işlemek için iyi bir yazılım mimarisine sahiptir; bu nedenle, 2,5 GHz Intel i7 işlemcive 16 GB RAM ile MacBook Pro gibi iyi bir donanım performansına sahip bir dizüstü bilgisayar kullanılması önerilir. ilastik yazılım, özellikle ön işleme aşamasında donanım kaynakları açısından daha talepkardır. Görüntü yığınının alt örneklemesi yazılımdan gelen donanım isteklerini sınırlamak için iyi bir hile olsa da ve kullanıcının bir dizüstü bilgisayarla bir desteyi işlemesine izin veriyor (genellikle x, y ,z’de 500 pikselin altındaysa), üst düzey bir kullanım önermekteyiz. bilgisayar sorunsuz bu yazılımı çalıştırmak için. Intel Xeon Gold 6150 Işlemci ile donatılmış, 16 çekirdekli ve 500 GB RAM ile donatılmış bir iş istasyonu kullanıyoruz.
Doğru bir 3D rekonstrüksiyon sağlandığında, bilim adamları orijinal mikrografları atabilir ve aynı türdeki hücrelerin yanı sıra farklı hücre türlerini karşılaştırmak için yararlı morfometrik verileri ayıklamak için doğrudan 3B modeller üzerinde çalışabilir ve morfolojilerin nitel ve nicel değerlendirmeleri. Özellikle, ikincisinin kullanımı, görsel oklüzyon (yani, gözlemci ve fi arasında yerleştirilen ikinci bir ilgi nesnesinin görüş engellemesi) mevcut yoğun veya karmaşık morfolojilerin analizleri durumunda yararlı olduğu kanıtlanmıştır rst nesne), temsil etmek ve 3D onları analiz etmek zor. Sunulan örnekte, deneyimli bir kullanıcının veri kümelerini gözlemleyebilmek ve nesneleri saymak yaklaşık 4 saat üst üste zaman aldı. VR analizi nde harcanan zaman, VR hastalığı gibi yönleri (bir dereceye kadar araba hastalığı ile ilgili olabilir) kullanıcı deneyimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir gibi değişebilir; Bu durumda, kullanıcı diğer analiz araçlarını tercih edebilir ve VR’a adanmış zamanlarını sınırlandırabilir.
Son olarak, tüm bu adımlar görüntü yığınları oluşturmak diğer mikroskopi ve olmayan EM teknikleri uygulanabilir. EM, genel olarak, işlemek ve segment zor görüntüler üretir, örneğin, floresan mikroskopisi ile karşılaştırıldığında, bir şey ikili maske karşılaştırılabilir (siyah bir arka plan karşı sinyal), prensipte kolayca 3D işlenebilir daha fazla işleme, genellikle ele alınması gerekir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (KAUST) Rekabetçi Araştırma Hibeleri (CRG) tarafından desteklenmiştir “BEYIN Enerjisi Metabolizmasının Bütünleştirici Modellemesi için KAUST-BBP İttifakı” p.j.m.
Fiji | Open Source | 2.0.0-rc-65/1.65b | Open Source image processing editor www.fiji.sc |
iLastik | Open Source | 1.3.2 rc2 | Image Segmentation tool www.ilastik.org |
Blender | Blender Foundation | 2.79 | Open Source 3D Modeling software www.blender.org |
HTC Vive Headset | HTC | Vive / Vive Pro | Virtual Reality (VR) Head monted headset www.vive.com |
Neuromorph | Open Source | — | Collection of Blender Addons for 3D Analysis neuromorph.epfl.ch |
Glycogen Analysis | Open Source | — | Blender addon for analysis of Glycogen https://github.com/daniJb/glyco-analysis |
GLAM | Open Source | — | C++ Code For generating GLAM Maps https://github.com/magus74/GLAM |