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Medicine

Administration intrabronchique directe pour améliorer le dépôt sélectif d'agent dans le poumon de souris

doi: 10.3791/59450 Published: May 20, 2019

Summary

L'administration intratrachéale (IT) des agents expérimentaux chez les souris a souvent comme conséquence la livraison asymétrique aux poumons distal.  Dans ce rapport, nous décrivons une approche intrabronchique directe (IB) pour cannuler chaque poumon dans les souris vivantes non-opératoirement.  Cette approche peut être utilisée pour administrer sélectivement des agents à un poumon ou peut être adaptée pour améliorer l'administration d'agents symétriques aux deux poumons.

Abstract

L'administration intratrachéale (IT) des agents expérimentaux est une technique essentielle dans les modèles murins des maladies pulmonaires diffuses, telles que la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine.  Cependant, la distribution des agents intratracheally-administrés au poumon distal de souris est souvent asymétrique, avec des concentrations parenchymales de poumon augmentées dans le poumon gauche plus petit (mais également accessible) de la souris.  Décrit dans ce rapport est une nouvelle approche intrabronchique (IB) pour canuiller les poumons gauches et/ou droits des souris vivantes non-opératoirement.  Il est également démontré comment cette approche peut être utilisée pour administrer sélectivement des agents à un poumon ou adaptée (par l'intermédiaire de l'administration de l'IB corrigée des doses) afin d'améliorer la symétrie gauche-droite des agents expérimentaux, améliorant ainsi les modèles de maladie pulmonaire telle que la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine.

Introduction

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L'administration pulmonaire directe d'agents expérimentaux chez la souris permet l'étude des réponses immunitaires pulmonaires, des lésions pulmonaires aigues et de la fibrose pulmonaire. L'administration pulmonaire directe est généralement effectuée par instillation intratrachéale (IT), comme décrit précédemment1,2,3. Cependant, cette approche n'est pas sélective, affectant les deux poumons d'une manière non ciblée et souvent asymétrique.  La modélisation expérimentale des lésions pulmonaires peut bénéficier de la capacité de cibler sélectivement un poumon spécifique, permettant l'utilisation du poumon contralatéral comme un contrôle. Inversement, la modélisation précise des maladies pulmonaires diffuses humaines bénéficie de la distribution symétrique d'agents expérimentaux au parenchyme pulmonaire bilatéral.

L'objectif global de ce rapport est de décrire une méthode d'administration sélective d'agents expérimentaux au poumon gauche ou droit d'une souris (figure 1). Cette approche d'administration intrabronchique (IB) permet le traitement unilatéral d'un poumon de souris et peut être facilement adaptée pour assurer la livraison égale d'un agent aux bronches bilatérales de mainstem. En utilisant l'administration de l'IB pour fournir de plus grandes doses d'agents expérimentaux au poumon droit plus grand et de plus petits volumes au poumon gauche plus petit (c.-à-d., l'administration de l'IB dose-ajustée), démontrée dans ce rapport est une amélioration de l'homogénéité du poumon pulmonaire l'administration d'agents expérimentaux, optimisant le modèle de lésions pulmonaires diffuses chez la souris. En tant que tel, ce rapport peut avoir de la valeur pour les chercheurs qui cherchent soit à administrer unilatéralement des agents expérimentaux aux souris ou d'améliorer la symétrie des dépôts de médicaments dans les deux poumons.

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Protocol

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Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par l'University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les procédures décrites ci-dessous (sections 4 à 7) ont été optimisées à l'aide de souris C57BL/6 mâles et femelles. Cette approche a été validée à l'aide de souris dont le poids corporel varie de 19 à 40 g.

1. Création d'une plate-forme pour l'administration de l'IB

  1. Pliez le bookend de l'angle original de 90 degrés entre l'aile basale et l'aile debout à 70 degrés (Figure 2A).
  2. Percer un trou au centre de l'aile debout du bookend en métal (Figure 2A).
  3. Percer un trou de taille identique à la position correspondante de la planche en plastique. Percer deux trous plus petits de façon inférieure et latérale (figure2A).
  4. Drape zunez une suture de soie 4:0 entre ces petits trous dans la planche en plastique (Figure 2A).
  5. Placez le crochet et le ruban adhésif sur le bord de la planche en plastique (Figure 2A).
  6. Assembler la planche en plastique au bookend en métal avec la vis (Figure 2B). Assurez-vous que l'écrou vis-écrou est suffisamment serré pour maintenir la planche en position tout en permettant l'ajustement de l'angle, si nécessaire.
  7. Assurez-vous que la rotation de la planche en plastique est dans le sens des aiguilles d'une montre et dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, se déplaçant librement.
    REMARQUE : Le mouvement dans le sens des aiguilles d'une montre est représenté dans le présent rapport sous la forme d'une rotation de degré(MD) et le mouvement dans le sens inverse des aiguilles d'une montre est représenté comme une rotation de degré (-) .
  8. Utilisez un protracteur d'angle pour positionner la planche en plastique à 30 degrés, 86, -30 et -74 degrés et marquez-les sur le bookend, respectivement.

2. Création de cathéters étendus pour l'administration des agents de l'IB

  1. Faire une coupe d'angle droit avec une lame pointue sur la pointe d'un cathéter original de 22 G (25 mm, voir Tableau des matériaux) (Figure 3, étape 1a).
  2. Bevel (50 '60 ') l'extrémité de l'autre cathéter d'origine (25 mm) avec la lame, puis coupé à angle droit de la plaque tournante (Figure 3, étape 1b).
  3. Coller les deux cathéters à leurs extrémités émoussées avec un angle légèrement inférieur à 180 degrés (figure3, étape 2).
  4. Émousser la pointe bevée en fondant avec une cautérisation à basse température (voir Tableau des matériaux).
  5. Polir le cathéter étendu avec du papier de verre de taille "0" sur la zone collée et la pointe bevée du cathéter étendu (figure 3, étape 3).
  6. Marquez sur le cathéter étendu avec des couleurs différentes à 25 mm, 30 mm et 35 mm (figure3, étape 3).
  7. Indiquer le côté bevel du cathéter prolongé en étiquetant son moyeu avec un marqueur.
  8. Rincer le cathéter prolongé avec de l'eau DI, en faisant le plein à l'intérieur du cathéter avec 70 % d'éthanol. Airdry le cathéter.
  9. Stériliser avec la lumière UV pendant 10 min avant utilisation.

3. Préparation préalable à la procédure

  1. Faire tous les agents administrés dans une hotte de sécurité biologique sous la technique stérile.
  2. Nettoyez le lieu de travail avec 70 % d'éthanol.
  3. Stériliser tous les outils chirurgicaux avec 70% d'éthanol.
  4. Fixez la base de la plate-forme de travail au banc immédiatement en face du chercheur en apposant des pinces C à l'aile basale du serre-livres.
  5. Générer plusieurs spiromètres de fortune, qui sont des dispositifs qui permettront de détecter le flux d'air des marées chez les souris. En bref, déposer 60 l de salin stérilisé dans une seringue de 1 ml (plunger enlevé) avec une pointe de chargement de gel.
    REMARQUE : La goutte déposée d'occludes salins du baril et se déplace vers le haut et vers le bas lorsqu'elle est exposée à la ventilation des marées3.
  6. Attachez lâchement le moyeu d'un cathéter étendu de 22 G au spiromètre de fortune.
  7. Placez chacun des gouttes de verre de chaque côté de la plate-forme pour faciliter l'accès.
  8. Connectez la chambre d'induction de l'isoflurane à la machine d'anesthésie des rongeurs (voir Tableau des matériaux) dans un coffret de sécurité biologique compatible avec l'isoflurane.

4. Approche d'intubation informatique non opérationnelle

  1. Anesthésiez une souris C57BL/6 (mâle ou femelle, 8 à 10 semaines, 25 g) avec de l'oxygène (2 L/min) et 5 % d'isoflurane (voir Tableau des matériaux)dans une chambre d'induction pendant 4 min.
  2. Aspirez l'agent expérimental à livrer (p. ex., colorant bleu Evans ou FITC-dextran, comme le démontre la figure 4) en deux pipettes, puis placez-les de chaque côté de la plate-forme pendant la sédation.
  3. Assurer un taux respiratoire d'environ 24 à 30 respirations/min avant de retirer la souris de la chambre d'induction de l'anesthésie.
    REMARQUE : L'anesthésie d'isoflurane dure typiquement pendant 4 min, suffisante pour toutes les procédures d'IB. Si l'opérateur n'est pas compétent avec la technique, la kétamine/xylazine (80 mg/kg et 10 mg/kg intrapéritonement, voir Tableau des matériaux) peut être utilisé pour une anesthésie plus prolongée.
  4. Suspendre la souris par ses inciseurs sur la ligne de suture drapée en position de supine. Fixer la souris avec deux à trois morceaux de crochet et boucler la bande lâchement, en évitant la restriction de la ventilation.
  5. Allumez l'illuminateur à fibres optiques LED (voir Tableau des matériaux, Figure 2C).
  6. Placez l'opérateur derrière la plate-forme (dorsal à la souris).
  7. Orientez le goulot d'oie de l'illuminateur afin qu'il illumine la zone du larynx à travers la peau. La distance entre la souris et la source de lumière est de 2 à 3 cm (figure2C).
  8. Confirmez la profondeur de l'anesthésie avec une pincement d'orteil/patte avant d'effectuer toutes les procédures ci-dessous.
  9. Tenez les forceps stériles avec la main dominante, puis tirez la langue hors de la cavité buccale avec les forceps.
  10. Tenez le dépresseur stérile avec la main non dominante, puis aplatissez la racine de la langue avec le dépresseur pour exposer largement l'oropharynx. Les forceps peuvent alors être libérés, libérant la main dominante.
  11. Utilisez la main dominante pour intuber le cathéter prolongé dans la trachée par la cavité buccale (Figure 2C).
  12. Confirmer le placement en observant si la bulle dans la seringue se déplace de haut en bas à chaque respiration.
  13. Des détails supplémentaires de l'intubation informatique ont été publiés précédemment3. Le temps total de procédure, à l'exclusion de l'anesthésie, dure de 10 à 15 s pour un opérateur bien formé.

5. Approches non opérationnelles d'intubation et de livraison de l'IB

  1. Approche de l'IB à la cannulation lobar sélective du poumon droit distal
    1. Après avoir effectué le cannulation informatique (étape 4.11), faites pivoter la planche en plastique à 30 degrés (figure 4A).
    2. Tenez le moyeu du cathéter et guidez-le naturellement en parallèle à la ligne médiane de la souris, en l'étendant aux profondeurs basées sur le poids comme décrit dans le tableau 1.
      REMARQUE : La résistance à ces profondeurs doit être notée. À ce stade, la souris deviendra légèrement tachypneic, comme expliqué dans les résultats représentatifs. Pour un opérateur expérimenté, environ 90% des tentatives cannule avec succès le poumon droit (avec la tachypnée notée).
    3. Fournir 20 l de 0,3 % de colorant bleu Evans (EBD, voir Table of Materials) avec une pointe de chargement de gel.
    4. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 ml chacun) d'air à l'aide du goutte-à-goutte en verre.
      REMARQUE : Cela assure le dégagement de la solution résiduelle d'EBD (ou agents expérimentaux) de l'intérieur du cathéter.
    5. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s.
    6. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.
  2. Approche de l'IB pour le cannulation segmenté sélectif du poumon gauche distal
    1. Après avoir effectué le cannulation informatique (étape 4.11), faites pivoter la planche en plastique -74 ' (Figure 4B).
    2. Maintenez le moyeu du cathéter et exercez une légère pression pour faire avancer le cathéter dans les bronches du tronc principal gauche, tout en exerçant une pression modeste à la fois vers le bas (90 degrés) et vers le bookend. Aux profondeurs indiquées dans le tableau 1, l'opérateur doit noter la résistance au fur et à mesure que les segments inférieurs du poumon gauche sont engagés. Si la tachypnée se produit, retirez le cathéter à la position de 20 à 25 mm, et retentez.
    3. Après avoir cannulating les segments inférieurs gauches de poumon, un changement de position est exigé pour permettre l'assistance gravitationnelle pour l'administration d'agent. Faites pivoter la planche en plastique -30 ' (Figure 4B).
    4. Fournir 40 L de 0,3 % d'EBD avec une pointe de chargement de gel.
      REMARQUE: Il est possible de fournir un plus grand volume d'agent parce que le poumon gauche n'a qu'un seul lobe.
    5. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide des gouttes de verre.
      REMARQUE : Cela assure le dégagement de tout EBD résiduel (ou agents expérimentaux) de l'intérieur du cathéter.
    6. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s.
    7. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.
  3. Adaptation de l'administration de l'IB pour permettre la livraison de l'agent à l'intégralité du poumon gauche ou droit
    REMARQUE : Si l'opérateur cherche à livrer des agents non pas à un lobe pulmonaire droit spécifique ou à un segment pulmonaire gauche, mais plutôt à l'ensemble du poumon (poumon droit ou gauche), le cathéter doit être légèrement retiré aux bronches du tronc principal respectif, comme suit.
    1. Administration pulmonaire entière droite
      1. Après l'étape 4.11, faites pivoter la planche en plastique à 30 degrés (figure 5A).
      2. Tenez le moyeu du cathéter et guidez-le naturellement en parallèle à la ligne médiane de la souris, l'atteignant à des profondeurs nécessaires pour le cannulation lobar distal latéral droit (tableau 1).
      3. Confirmer l'apparence du signe de tachypnée.
      4. Faites pivoter la souris à -74 degrés pour permettre l'assistance par gravité pour la livraison de l'agent (figure 5B).
      5. Retirez le cathéter à une position qui correspond au décollage de la bronche du tronc principal droit (tableau 1). Assurez-vous que le bevel du cathéter fait face vers le bas (figure 5B).
      6. Fournir 30 L de 0,3 % d'EBD avec une pointe de chargement de gel au poumon droit.
      7. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide d'un goutte-à-goutte en verre.
      8. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.
    2. Administration pulmonaire entière laissée
      1. Après l'étape 4.11, faites pivoter la planche en plastique -74 ' (Figure 6A). Alternativement, la rotation peut se produire après l'étape 5.3.1.8 en retirant le cathéter à la trachée, permettant l'administration bilatérale d'agent d'IB.
      2. Maintenez le moyeu du cathéter et exercez une légère pression pour faire avancer le cathéter dans le cathéter principal gauche, tout en exerçant une pression modeste à la fois vers le bas (90 degrés) et vers le bookend. La profondeur de l'intubation est guidée par le tableau 1.
      3. Confirmez le signe de non tachypnea.
      4. Faites pivoter la souris à 86 degrés pour permettre une assistance gravitationnelle avec l'administration de l'agent.
      5. Retirez le cathéter vers les bronches du tronc principal gauche (les mêmes distances que le poumon droit sont suffisantes, tableau 1) et faites pivoter le beveter du cathéter vers le bas (Figure 6B).
      6. Fournir 30 L de 0,3 % d'EBD avec une pointe de chargement de gel au poumon gauche.
      7. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide d'un goutte-à-goutte en verre.
      8. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.

6. Utilisation d'approches séquentielles de cannulation de l'IB pour fournir des volumes d'agent ajustés en dose à chaque poumon

  1. Groupe d'administration informatique
    1. Effectuer IT cannulation tel que décrit dans les étapes 4.1-4.11.
    2. Fournir 60 L de 0,05 % FITC-dextran (voir Tableau des matériaux) avec une pointe de chargement de gel (Figure 1B).
    3. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide des gouttes de verre.
    4. Gardez la position pour 60 s et permettre la récupération de la souris comme décrit ci-dessus.
  2. Administration bilatérale symétrique de l'IB
    1. Effectuer les étapes 5.3.1.1-5.3.1.8 (poumon droit) et les étapes 5.3.2.1-5.3.2.8 (poumon gauche).
    2. Administrer des volumes égaux (30 l) de 0,05 % de FITC-dextran (ou un agent expérimental) de chaque côté du poumon.
  3. Administration bilatérale de l'IB corrigée des doses
    1. Effectuer l'étape 5.3.1.1-5.3.1.8 (poumon droit) et les étapes 5.3.2.1-5.3.2.8 (poumon gauche).
    2. Administrer un volume plus important (40 l) de 0,05 % de FITC-dextran au poumon droit plus grand, et un volume plus faible (20 L) de 0,05 % DE FITC-dextran au poumon gauche plus petit. Au lieu de FITC-dextran, un agent expérimental peut être administré.

7. Utilisation de l'administration de l'IB corrigée des doses pour améliorer la symétrie des lésions pulmonaires induites par la bléomycine à dose unique (BLM)

  1. Groupes d'administration BLM
    1. Groupe d'administration IB-BLM ajusté en fonction de la dose (1,2 mg/kg, voir Table of Materials) groupe d'administration : 60 L (20 l pour le poumon gauche et 40 l pour le poumon droit, respectivement) de la solution BLM ont été livrés à des souris (n ' 5). Les commandes (n '5) ont reçu des volumes similaires de salin.
      REMARQUE : Se référer aux étapes 5.3.1 et 5.3.2.
    2. Groupe d'administration informatique : 60 lde de solution BLM ont été livrés à des souris avec des techniques d'administration informatique.
      REMARQUE : Reportez-vous aux étapes 6.1.1-6.1.4.
  2. Mesure de la fonction pulmonaire
    1. Le jour 21 après BLM ou salin, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale (IP) de kétamine (160 mg/kg) et de xylazine (32 mg/kg).
    2. Après avoir confirmé la profondeur de l'anesthésie par pincement de patte/orteil, effectuer une trachéotomie avec une canule de 18 G (voir Tableau des matériaux).
    3. Connectez les souris au ventilateur et mesurez la mécanique respiratoire telle que décrite précédemment4.
  3. Collecte et traitement des tissus pulmonaires
    1. Après la mesure de la mécanique pulmonaire, euthanasiez les souris anesthésiées par ponction cardiaque.
    2. Ouvrez la paroi thoracique et induise des pneumothoraces bilatérales.
    3. Gonfler les poumons avec 1 % d'agarose de fonte faible (40 oC)5 en PBS à une pression constante (42 cm H2O).
    4. Couper quatre à cinq morceaux du poumon le long du long axe transversalement, fixer dans 10% de formaline, et incorporer dans la paraffine.
    5. Coupez des sections de 5 m et tachez avec le trichrome de Masson pour visualiser les dépôts de collagène.

8 Soins post-procéduraux

  1. À la fin des procédures de survie, placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.

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Representative Results

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L'intubation sélective de l'IB cible des lobes spécifiques (poumon droit) ou des segments basilaires (poumon gauche).

L'administration de l'IB de l'EBD au poumon droit a été exécutée comme décrit dans la section 5.1. Après l'achèvement de l'expérience, des souris ont été administrées une dose mortelle de kétamine intrapéritonéale/xylazine, et des poumons ont été moisis pour la démonstration de la distribution d'EBD (figure 4A, droite). L'aspect brut du poumon démontre que 90% des tentatives ont cannulé le petit lobe postérieur du poumon droit, alors que 10% des tentatives ont visé le lobe inférieur. On suppose que les petits volumes de ces lobes expliquent la tachypnée compensatoire de la souris pendant le cannulation distal (pour maintenir la ventilation infime par le cathéter).

L'administration de l'IB de l'EBD au poumon gauche a été exécutée comme décrit dans la section 5.2. 100% des tentatives ciblent les segments inférieurs du poumon gauche (figure 4B). Contrairement à l'intubation côté droit, aucune tachypnée ne se produit avec cet engagement, reflétant l'intubation (et la ventilation) des segments pulmonaires gauches plus grands.

L'adaptation de la technique sélective de cannulation d'IB peut cibler le poumon gauche ou droit entier.

Une fois que l'IB cannulation est effectué, le retrait du cathéter ib (et les changements dans le positionnement de la souris, comme détaillé dans la section 5.3) peut être utilisé pour améliorer la livraison d'agents à tous les lobes du poumon droit (et tous les segments du poumon gauche). L'instillation de la solution EBD au poumon droit (section 5.3.1) a ciblé avec succès tous les lobes droits, comme démontré dans la figure 5C. L'instillation de la solution EBD au poumon gauche (section 5.3.2) a ciblé avec succès tous les segments gauches (figure 6C).

Administration informatique ou administration symétrique de l'IB rendements poumon asymétrique concentrations d'agents parenchymal, qui peuvent être corrigées par l'ajustement de la dose de l'IB.

Les souris ont subi l'administration bilatérale de 30 'L de 0.05% FITC-dextran au poumon gauche et de 30 'L de 0.05% FITC-dextran au poumon droit comme décrit dans la section 6.2. Alternativement, les souris ont reçu 60 l de 0.05% FITC-dextran intratracheally selon la section 6.1. À la fin de l'expérience, les souris ont été euthanasiées par surdosage d'anesthésie terminale (kétamine/xylazine). Les poumons ont été immédiatement récoltés et homogénéisés. FitC-fluorescence (quantifié par densité optique) a été mesurée avec le lecteur de plaque de 96 puits. La date a été analysée avec le t-test de l'étudiant pour des comparaisons de deux groupes.

Comme l'a indiqué la figure 7, les TI ( figure7A) et l'administration symétrique de l'IB (figure 7B) de FITC-dextran ont conduit à la fluorescence parenchymale parenchymale de FITC asymétrique, avec des concentrations relatives plus élevées (normalisées au poids) indiquées dans le poumon gauche. Ceci suggère que la livraison asymétrique de poumon des agents expérimentaux après administration de TI n'est pas une conséquence de la présentation asymétrique de ces agents à chaque bronche de mainstem. On a plutôt émis l'hypothèse que l'administration symétrique de l'IB (comme en témoignent l'administration symétrique de l'IB) a été diluée par des différences dans le poids/masse des poumons, comme on l'a observé dans le tableau 2.

Pour surmonter ces différences dans l'accouchement symétrique, 40 L de 0,05 % de FITC-dextran ont été administrés au poumon droit plus grand et 20 l au poumon gauche plus petit, selon la section 6.3. Cette « administration de l'IB ajustée en fonction de la dose » a amélioré la symétrie de l'administration d'agents parenchymals pulmonaires (figure 8A). Malgré cette correction, cependant, nous avons observé une hétérogénéité persistante dans différents lobes du poumon droit (figure 8B).

Blessures pulmonaires induites par le BLM dans différents systèmes d'accouchement :

Pour démontrer que l'administration d'agents expérimentaux de l'IB corrigée de la dose peut améliorer la modélisation des maladies pulmonaires diffuses, nous avons administré BLM (un modèle de souris de lésions pulmonaires fibrosantes) soit intratracheally ou par l'administration de l'IB corrigée de la dose, selon la section 7. Comme prévu avec ce modèle de blessure, les injections de BLM de l'IT et de l'IB ont entraîné des lésions pulmonaires et des maladies systémiques (avec perte de poids). Cette maladie systémique résolue en 7 jours. La mortalité sur 21 jours était de 20 % (1/5) dans le groupe informatique et de 0 % (0/5) dans le groupe DE l'IB corrigé de la dose.

21 jours après l'administration de IT- ou IB-BLM, des souris ont été moissonnées pour l'histologie de poumon. Comme l'ont démontré les images histologiques représentatives (figure 9A),

Pour déterminer si cette homogénéité gauche-droite améliorée des lésions pulmonaires fibrotiques est physiologiquement pertinente, il a été observé que l'administration de BLM de blM ajustée en fonction de la dose a entraîné une perte plus constante de la capacité inspiratoire (IC) et de la conformité au système respiratoire. (Crs), ainsi qu'une augmentation concordante de l'élastance du système respiratoire (Ers) (Figure 9B).

Figure 1
Figure 1 : Anatomie des voies respiratoires de souris cannulation. (A) Un jet de voie aérienne de souris a été fait en gonflant un poumon de souris (récolté à partir d'une souris de 25 g) avec de l'élastomère de silicium. (B) Placement cathéter pour l'administration informatique standard. (C) Placement de cathéter pour l'administration de l'IB. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Configuration de la plate-forme de travail. (A) Un bookend métallique (angle de 90 degrés) est plié à 70 degrés. Un trou de vis est placé dans la ligne médiane supérieure pour ancrer un mobile (80 mm x 150 mm). Du ruban adhésif et de la boucle et une suture suspendante sont placés pour permettre le positionnement d'une souris anesthésiée sur le plateau. (B) La planche en plastique est ancrée avec une vis sur le bookend en métal. La vis est suffisamment lâche pour permettre la rotation de la planche dans le sens des aiguilles d'une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d'une montre (-) direction. (C) Une souris anesthésiée est positionnée à l'aide d'un crochet et d'une bande de boucle (0,75 po W) pour l'administration d'agents informatiques et IB. Une suture est passée sous les incisifs de souris pour permettre la stabilisation de la tête. L'opérateur est positionné à l'aspect dorsal de la souris, et le cou est éclairé par une lampe de cou d'oie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Création de cathéters personnalisés pour l'administration de l'IB. (Étape 1) Pour permettre une longueur suffisante du cathéter pour engager les bronches du tronc principal, deux cathéters sont combinés. (Étape 2) Les cathéters sont reliés à un léger angle, facilitant l'intubation sélective aux bronches du tronc principal. (Étape 3) En outre, la pointe distale de cathéter est bevée, permettant un meilleur contrôle directionnel de l'instillation des voies respiratoires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Approche pour le lobar et l'administration sélectifs de lobar et d'administration de poumon droite/gauche. (A) Pour cibler le poumon droit, la planche en plastique est en rotation de 30 degrés, ce qui améliore la facilité d'engager sélectivement la bronche du tronc principal droit. Le cathéter est avancé (par distances proposées dans le tableau 1) pour engager sélectivement les lobes du côté droit. 20 L de 0,3 % d'EBD ont été administrés. Dans 90 % des tentatives, le lobe postérieur est cannulé. Les 10% restants des tentatives engagent le lobe inférieur. (B) Pour cibler le poumon gauche, la planche en plastique est d'abord pivotée de -74 degrés pour l'engagement du pilier gauche. Après l'intubation réussie du cathéter, la rotation est alors diminuée à -30 degrés pour permettre à la gravité d'aider à la livraison d'agent. Pour prouver l'engagement sélectif du côté gauche, 40 l de 0,3% EBD ont été livrés. Cette approche ciblait systématiquement (100 % des tentatives) les segments basilaires pulmonaires gauches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Approche d'administration symétrique pour livrer unilatéralement des agents à l'ensemble du poumon droit. (A) L'intubation de l'IB côté droit a été réalisée à 30 degrés, identique à la cannulation sélective du lobar du poumon droit (figure 4A). (B) La planche en plastique a ensuite été tournée à -74 degrés pour permettre une assistance gravitationnelle pendant l'administration de l'agent. La pointe du cathéter est ensuite retirée à des profondeurs détaillées dans le tableau 1, correspondant à la bronche droite du tronc principal. Le bevel de la pointe est positionné vers le bas en faisant pivoter le moyeu du cathéter. (C) 30 l d'EBD a été livré à -74 degrés, prouvant l'administration diffuse de poumon droit de L'EBD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Approche d'administration symétrique d'administrer unilatéralement des agents à l'ensemble du poumon gauche . (A) L'intubation de l'IB côté gauche a été effectuée à -74 degrés, identique à la cannulation sélective du lobar du poumon gauche (figure 4B). (B) Après une intubation réussie, la planche en plastique a ensuite été tournée à 86 degrés pour permettre une assistance gravitationnelle pendant l'administration de l'agent. La pointe du cathéter est ensuite retirée à la profondeur détaillée dans le tableau 1. Le bevel de la pointe est décalé vers le bas en faisant pivoter le moyeu du cathéter. (C) 30 l d'EBD a été livré avec la pointe de chargement de gel, prouvant l'administration gauche diffuse de poumon d'EBD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : L'administration informatique d'agents expérimentaux est également administrée aux bronches du tronc principal, mais elle entraîne différentes concentrations parenchymales pulmonaires. (A) L'administration informatique de 0,05 % de FITC-dextran (60 l) a donné une fluorescence plus élevée dans le poumon gauche, suggérant des concentrations inégales de poumon sénérdès d'agent livré. (B) Cette fluorescence parenchymale pulmonaire inégale persiste même lorsque des volumes égaux de 0,05 % de FITC-dextran (30 L) sont administrés à chaque bronche du tronc principal. Ce déséquilibre parenchymal persistant, en dépit de la livraison égale droite/gauche de mainstem, suggère que les différences dans des concentrations d'agent de poumon reflètent la dilution dans le poumon droit plus grand (n - 10 par groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Amélioration de l'homogénéité des dépôts d'agents par IB ajusté en dose l'administration. (A) L'asymétrie de l'accouchement parenchymal pulmonaire est améliorée lorsqu'une plus grande proportion d'agent (40 L de 0,05 % de FITC-dextran) est administrée au poumon droit plus grand et à une proportion moindre d'agent (20 L de 0,05 % de FITC-dextran) au poumon gauche plus petit. (B) Malgré cette symétrie gauche-droite améliorée, il reste l'hétérogénéité lobar du dépôt d'agent (noir : lobe supérieur ; jaune : lobe moyen ; bleu : lobe inférieur ; vert : lobe postérieur ; rouge : poumon gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Amélioration du modèle de fibrose pulmonaire induit par la souris BLM à l'aide d'une administration de l'IB corrigée de la dose. (A) L'administration informatique de BLM (1,2 mg/kg dans une solution de 60 l) induit des lésions pulmonaires/fibrose prédominantes du côté gauche 21 jours plus tard, ce qui correspond à des concentrations pulmonaires plus élevées d'agent dans ce poumon plus petit. La symétrie gauche-droite s'améliore en ajustant le volume de BLM de chaque côté du poumon : 40 l de la solution est administrée au poumon droit plus grand et 20 l de la solution est administrée au poumon gauche plus petit. I: lobe inférieur, M: lobe moyen, S: lobe supérieur, P: lobe postérieur. Les images représentent les lobes d'une seule souris représentative. (B) Conformément à l'amélioration de la symétrie de la distribution, l'administration de BLM de blM ajustée en fonction de la dose améliore la modélisation physiologique de la fibrose pulmonaire, avec des augmentations plus représentatives de l'élastance du système respiratoire (Ers) et une diminution de la capacité respiratoire (IC) et la conformité dynamique du système respiratoire (Crs). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Poids corporel (g) Nombre de souris testées Profondeur de cathéter (mm)
pour Selective cannulation
Profondeur de cathéter (mm) pour cannulation de poumon entier
Poumon droit Poumon gauche
15 à 19 ans 17 Annonces 37 Ans, états-unis ( 38 Annonces 26 Annonces
20 à 25 ans 22 Ans 38 Annonces 39 Ans et plus qu'ils 27 Annonces
25 à 30 ans 29 Ans et plus 39 Ans et plus qu'ils 40 ans, états-unis ( 28 Annonces
30 euros 11 Ans, états-unis ( 40 ans, états-unis ( 41 Ans, états-unis ( 31 Ans, états-unis (

Tableau 1 : Profondeur suggérée de l'insertion du cathéter. Les profondeurs de cathéter prévues nécessaires pour cannuler sélectivement les poumons distal et proximal ont été empiriquement déterminées utilisant des souris de C57BL/6 de divers poids (total - 79 souris).

Poids corporel (g) Nombre de souris testées Ratio de poids pulmonaires
14 à 10 25 Annonces 2,01 à 0,16
20 à 25 ans 35 Annonces 1,88 à 0,27
25 à 30 ans 15 Annonces 1,88 à 0,27
30 euros 6 Annonces 2,03 à 0,09

Tableau 2 : Droite : rapports de poids pulmonaire gauche. Les différences dans les poids de poumon observés dans 81 souris c57BL/6 démontrent la justification pour l'administration corrigée de drogue d'IB. Les poumons ont été disséqués et pesés après une dose mortelle de kétamine et de xylazine.

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Discussion

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Les lésions pulmonaires ont été modélisées classiquement chez les rongeurs en utilisant l'administration informatique d'agents nuisibles tels que BLM6. Une telle administration informatique, cependant, ne conduit qu'à des blessures inégales, reflétant la nature non ciblée de la livraison des poumons avec cette approche7. Ces limitations de la modélisation des lésions pulmonaires sont des défis instructifs rencontrés lors de la tentative de la livraison informatique d'agents expérimentaux non-blessés, tels que les médicaments, siRNA, ou des thérapies cellulaires.

Dans ce rapport, nous décrivons l'administration directe de l'IB d'agents expérimentaux. Cette approche offre deux avantages distincts par rapport aux approches classiques de l'administration informatique. Tout d'abord, l'approche permet une administration unilatérale sélective à un poumon, permettant d'épargnant le poumon contralatéral. Cette approche est utile pour l'administration sélective de médicaments dans un poumon légèrement blessé (par exemple, l'ischémie-reperfusionblessure 8), en évitant les effets non spécifiques dans le poumon non blessé. En outre, l'administration dirigée des cellules de tumeur peut êtreemployée pour distinguer la croissance primaire de tumeur de la propagation contralatérale et métastatique 9,10.

Deuxièmement, le rapport détaille un avantage jusque-là non reconnu de l'administration de l'IB. Comme l'explique la figure 7A,l'administration informatique concentre relativement les agents expérimentaux dans le poumon gauche plus petit. Cette asymétrie peut être corrigée en administrant un volume relativement plus important d'agent au poumon droit plus grand (tableau 2), tout en livrant un plus petit volume au poumon gauche plus petit (figure 8A). La pertinence de cette administration d'IB dose-ajustée aux dommages fibrotic de poumon BLM-induits a été démontrée ici. L'ajustement de dose atténue la blessure au poumon gauche (qui a reçu moins de BLM), tout en augmentant des dommages au poumon droit (figure 9A). Cette symétrie accrue coïncide avec une diminution de la variabilité des lésions pulmonaires, comme quantifiée par les mesures de la fonction pulmonaire (figure 9B).

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, y compris la nécessité d'avoir un support capable de modifier facilement et à plusieurs reprises le positionnement des animaux (c.-à-d. la rotation). Plus critique est la capacité de déterminer quand le cannulation sélectif de poumon a été réalisé. Tel que décrit à la section 4.12, l'utilisation d'un spiromètre (dans lequel une colonne d'eau démontre la ventilation des marées) assure le succès de la cannulation trachéale3. L'observation de la tachypnée droite de souris est compatible au cannulation droit distal de segment de poumon, alors que l'absence de dyspnée (en dépit de la résistance de sensation avec l'insertion de cathéter) a suggéré le cannulation du poumon gauche. À l'aide de ces techniques de localisation non opératoires, l'opérateur devrait être en mesure de guider avec précision le dépôt de l'IB et de l'agent expérimental.

Cette approche comporte plusieurs limites. Le modèle informatique de livraison d'agents est attrayant dans sa simplicité. Il exige un degré modéré de pratique et de compétence technique, bien qu'un opérateur qualifié puisse encore exécuter rapidement cette technique dans la fenêtre de l'anesthésie d'isoflurane. Les compétences techniques supplémentaires/pratique requises, cependant, peuvent être facilement compensées par l'avantage de cette approche dans des expériences qui donnent la priorité à l'agent sélectif/siRNA/cell delivery ou à l'homogénéité accrue du dépôt d'agent. Une limitation supplémentaire à cette méthode est l'incertitude concernant la longueur de l'insertion du cathéter. Comme détaillé dans le tableau 1, 79 souris mâles et femelles ont été mesurées pour estimer la profondeur de l'insertion de cathéter nécessaire pour le cannulation sélectif d'IB. Ces données servent de ressource pour guider l'opérateur à exécuter notre protocole. Cependant, nous ne pouvons pas extrapoler avec confiance notre ressource à d'autres souches de souris (y compris les souris knock-out) ou des souris morbides obèses. De plus, nous n'avons pas mesuré s'il existe des différences dans le volume de l'espace aérien (lobar, segmentaire) qui varient en fonction du poids. En tant que tel, il est possible que les grosses souris puissent accueillir de plus grands volumes d'instillation avec l'administration de l'IB. Ainsi, l'opérateur doit effectuer une première étape d'optimisation/dépannage (à l'aide de l'instillation EBD) pour s'assurer que notre technique est bien adaptée au modèle de souris désiré.

En résumé, ce rapport décrit une nouvelle technique de l'IB qui peut être utilisée pour administrer sélectivement des agents expérimentaux à un seul poumon ou adaptée pour assurer une distribution symétrique dans les deux poumons. Ces avantages justifient l'augmentation marginale de la complexité par rapport aux techniques informatiques standard.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par la subvention HL125371 de l'NHLBI à E.P.S. et par la subvention W81XWH-17-1-0051 du DOD (CDMRP) à Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106, (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
  5. Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71, (1), 149-153 (1994).
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  7. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, (3), L379-L399 (2008).
  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44, (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47, (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13, (6), 349-358 (2000).
Administration intrabronchique directe pour améliorer le dépôt sélectif d'agent dans le poumon de souris
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Cite this Article

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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