Summary
La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali nei topi spesso si traduce in consegna asimmetrica ai polmoni distali. In questa relazione, descriviamo un approccio intrabronchiale diretto (IB) per cannulare ogni polmone in topi viventi non chirurgici. Questo approccio può essere utilizzato per somministrare selettivamente gli agenti a un polmone o può essere adattato per migliorare la somministrazione simmetrica dell'agente a entrambi i polmoni.
Abstract
La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali è una tecnica essenziale nei modelli murini di malattie polmonari diffuse, come la fibrosi polmonare indotta dalla bleomicina. Tuttavia, la distribuzione di agenti somministrati intratrachealmente al polmone del topo distale è spesso asimmetrica, con concentrazioni parenilmale polmonari aumentate nel polmone sinistro inferiore (ma ugualmente accessibile) del polmone sinistro del topo. Descritto in questo rapporto è un nuovo approccio intrabronchiale (IB) per cannulare i polmoni sinistro e/o destro dei topi viventi in modo non chirurgico. È inoltre dimostrato come questo approccio possa essere utilizzato per somministrare in modo selettivo gli agenti a un polmone o adattato(tramite somministrazione IB regolata mediante dose) per migliorare la simmetria sinistra-destra della somministrazione polmonare di agenti sperimentali, migliorando così i modelli di diffusione polmonare come la fibrosi polmonare indotta dalla bleomicina.
Introduction
La somministrazione polmonare diretta di agenti sperimentali nei topi consente lo studio delle risposte immunitarie polmonari, delle lesioni polmonari acute e della fibrosi polmonare. La somministrazione polmonare diretta viene in genere eseguita tramite instillazione intratratracheale (IT), come descritto in precedenza1,2,3. Tuttavia, questo approccio non è selettivo, interessando entrambi i polmoni in modo non mirato e spesso asimmetrico. La modellazione sperimentale della lesione polmonare può beneficiare della capacità di colpire in modo selettivo un polmone specifico, consentendo l'uso del polmone contralaterale come controllo. Al contrario, una modellazione accurata delle malattie polmonari diffuse umane beneficia della distribuzione simmetrica di agenti sperimentali al parenchyma polmonare bilaterale.
L'obiettivo generale di questa relazione è descrivere un metodo per la consegna selettiva di agenti sperimentali al polmone sinistro o destro di un mouse (Figura 1). Questo approccio di somministrazione intrabronchiale (IB) consente il trattamento unilaterale di un polmone di topo e può essere facilmente adattato per garantire la consegna equa di un agente ai bronchi bispoli bisbici bilaterali. Utilizzando la somministrazione IB per fornire dosi più grandi di agenti sperimentali al polmone destro più grande e volumi più piccoli al polmone sinistro più piccolo (cioè la somministrazione IB regolata dalla dose), dimostrato nella presente relazione è un miglioramento dell'omogeneità delle pulmonie l'ottimizzazione del modello di lesione polmonare diffusa nei topi. Come tale, questa relazione può avere valore per gli investigatori che cercano di somministrare unilateralmente agenti sperimentali ai topi o migliorare la simmetria della deposizione di farmaci in entrambi i polmoni.
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Protocol
Tutti i protocolli animali sono stati approvati dall'Università del Colorado Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutte le procedure descritte di seguito (sezioni 4-7) sono state ottimizzate utilizzando topi C57BL/6 maschi e femmine. Questo approccio è stato convalidato utilizzando topi che vanno da 19 a 40 g di peso corporeo.
1. Creazione della piattaforma per l'amministrazione IB
- Piegare il bookend dall'angolo originale di 90 gradi tra l'ala basale e l'ala in piedi a 70 gradi (Figura2A).
- Forare un foro nella parte superiore centrale dell'ala in piedi del bookend metallico (Figura 2A).
- Forare un foro di dimensioni identiche alla posizione corrispondente della scheda di plastica. Forare due fori più piccoli in modo inferiore e laterale (Figura 2A).
- Drappo una sutura di seta 4:0 tra questi piccoli fori nella scheda di plastica (Figura 2A).
- Posizionare il gancio e il nastro a loop sul bordo della scheda di plastica (Figura 2A).
- Assemblare la scheda di plastica al bookend metallico con la vite (Figura 2B). Assicurarsi che il dado di vite sia sufficientemente stretto per tenere la scheda in posizione, consentendo al contempo la regolazione dell'angolo, se necessario.
- Assicurarsi che la rotazione della scheda di plastica sia in senso orario e antiorario, muovendosi liberamente.
NOTA: il movimento in senso orario è rappresentato in questo rapporto come una rotazione di gradi ( ) e in senso antiorario è rappresentato come una rotazione di gradi (-). - Utilizzare un goniometro angolare per posizionare la tavola di plastica a 30, 86 , -30 e -74 e contrassegnarli rispettivamente sul bookend.
2. Creazione di cateteri estesi per l'amministrazione degli agenti IB
- Effettuare un taglio ad angolo retto con una lama affilata sulla punta di un catetere originale da 22 G (25 mm, vedere Tabella deimateriali) (Figura 3, passo 1a).
- Spalanca la punta dell'altro catetere originale (25 mm) con la lama, quindi taglia ad angolo retto dall'hub (Figura3, passaggio 1b).
- Incollare i due cateteri alle estremità smussate con un angolo leggermente inferiore a 180 gradi (Figura3, passaggio 2).
- Smussare la punta smussata fondendosi con un cavolo a bassa temperatura (vedere Tabella dei materiali).
- Polacco il catetere esteso con carta vetrata di dimensioni "0" sull'area incollata e la punta snella del catetere esteso (Figura3, passo 3).
- Segnare sul catetere esteso con colori diversi a 25 mm, 30 mm e 35 mm (Figura3, passaggio 3).
- Indicare il lato svelto del catetere esteso etichettandoil mozzo con il marcatore.
- Risciacquare il catetere esteso con acqua DI, seguendo il lavaggio all'interno del catetere con 70% di etanolo. Asciugare il catetere.
- Sterilizzare con luce UV per 10 min prima dell'uso.
3. Preparazione pre-procedura
- Rendere tutti gli agenti somministrati in una cappa di sicurezza biologica in una tecnica sterile.
- Pulire il posto di lavoro con il 70% di etanolo.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con 70% etanolo.
- Fissare la base della piattaforma di lavoro alla panca immediatamente di fronte al ricercatore apponendo i morsetti a C sull'ala basale del bookend.
- Generare diversi spirometri di fortuna, che sono dispositivi che consentiranno il rilevamento del flusso d'aria di marea nei topi. In breve, depositare 60 L di salina sterilizzata in una siringa da 1 mL (rimosso) con una punta di carico gel.
NOTA: Il calo depositato della salina occinga la canna e si muove verso l'alto e verso il basso quando esposto alla ventilazione delle maree3. - Attacca liberamente il mozzo di un catetere esteso da 22 G allo spirometro improvvisato.
- Posizionare ciascuno dei contagocce di vetro su ogni lato della piattaforma per facilitare l'accesso.
- Collegare la camera di induzione dell'isoflurano alla macchina per l'anestesia dei roditori (cfr. tabella deimateriali) in un armadietto di sicurezza biologico compatibile con l'isoflurane.
4. Approccio di intubazione IT non operativo
- Anestesizzare un topo C57BL/6 (maschio o femmina, 8-10 settimane, 25 g) con ossigeno (2 L/min) e 5% isoflurane (vedi Tabella dei materiali) in una camera di induzione per 4 min.
- Aspirare l'agente sperimentale da consegnare (ad esempio, colorante blu Evans o FITC-dextran, come illustrato nella Figura 4) in due pipette, quindi posizionarli su ciascun lato della piattaforma durante la sedazione.
- Assicurarsi una frequenza respiratoria di circa 24-30 respiri/min prima di rimuovere il mouse dalla camera di induzione dell'anestesia.
NOTA: L'anestesia di Isoflurane dura in genere per 4 min, sufficiente per tutte le procedure IB. Se l'operatore non è esperto con la tecnica, la chetamina/xylazina (80 mg/kg e 10 mg/kg intraperitonealmente, vedere Tabella dei materiali) può essere utilizzato per un'anestesia più prolungata. - Sospendere il mouse con i suoi incisivi sulla linea di sutura drappeggiata in posizione supina. Fissare il mouse con due o tre pezzi di gancio e far scorrere il nastro liberamente, evitando la limitazione della ventilazione.
- Accendere l'illuminatore a fibra ottica LED (vedere Tabella dei materiali, Figura 2C).
- Posizionare l'operatore dietro la piattaforma (dorsale al mouse).
- Orientare il collo d'oca dell'illuminatore in modo che illumini l'area della lassa attraverso la pelle. La distanza tra il mouse e la sorgente luminosa è compresa tra 2 e 3 cm (Figura 2C).
- Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dita/zampa prima di eseguire tutte le procedure riportate di seguito.
- Tenere le pinze sterili con la mano dominante, quindi disegnare la lingua dalla cavità orale con le pinze.
- Tenere il depressore sterile con la mano non dominante, quindi appiattire la radice della lingua con il depressore per esporre ampiamente l'oropharynx. Le pinze possono quindi essere rilasciate, liberando la mano dominante.
- Utilizzare la mano dominante per intubare il catetere esteso nella trachea attraverso la cavità orale (Figura 2C).
- Confermare il posizionamento osservando se la bolla nella siringa si muove su e giù ad ogni respiro.
- Ulteriori dettagli sull'intubazione IT sono stati pubblicati in precedenza3. Il tempo totale di procedura, esclusa l'anestesia, dura 10-15 s per un operatore ben addestrato.
5. Approcci di intubazione e consegna IB non operativi
- Approccio IB alla cannulazione selettiva del polmone destro discrepare
- Dopo l'esecuzione della canonazione IT (passaggio 4.11), ruotare la scheda di plastica di 30 gradi (Figura4A).
- Tenere il mozzo del catetere e guidarlo in modo naturale in parallelo alla linea mediana del mouse, estendendolo alle profondità basate sul peso, come descritto nella Tabella 1.
NOTA: La resistenza a queste profondità deve essere notato. A questo punto, il mouse diventerà leggermente tachipigico, come spiegato nei risultati rappresentativi. Per un operatore esperto, circa il 90% dei tentativi cannula con successo il polmone destro (con tachipnea notato). - Consegnare 20 - L di 0,3% di colorante blu Evans (EBD, vedi Tabella dei materiali) con una punta di carico gel.
- Distribuisci 1–2 aliquote (0,1 mL ciascuna) di aria utilizzando il contagocce di vetro.
NOTA: Questo garantisce lo sgombero della soluzione Residua EBD (o agenti sperimentali) dall'interno del catetere. - Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s.
- Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista conoscenza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
- Approccio IB alla canonazione segmentale selettiva del polmone sinistro distale
- Dopo aver eseguito la canonulazione IT (passaggio 4.11), ruotare la scheda di plastica di -74 gradi (Figura4B).
- Tenere il mozzo del catetere e esercitare una leggera pressione per far avanzare il catetere nel bronco del tronco sinistro, posizionando una pressione modesta sia verso il basso (90o) che verso il bookend. Alle profondità indicate nella tabella1, l'operatore dovrebbe notare resistenza in quanto i segmenti inferiori del polmone sinistro sono impegnati. Se si verifica la tachipnea, ritirare il catetere nella posizione 20-25 mm e riprovare.
- Dopo aver cannulato i segmenti polmonari inferiori a sinistra, è necessario un cambiamento di posizione per consentire l'assistenza gravitazionale per la somministrazione dell'agente. Ruotare la scheda di plastica di -30 gradi (Figura4B).
- Consegnare 40 -L dello 0,3% EBD con una punta di carico gel.
NOTA: è possibile fornire un volume maggiore di agente perché il polmone sinistro ha un solo lobo. - Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando i contagocce di vetro.
NOTA: Questo garantisce l'autorizzazione di qualsiasi EBD residuo (o agenti sperimentali) dall'interno del catetere. - Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s.
- Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista conoscenza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
- Adattamento della somministrazione IB per consentire la consegna dell'agente alla totalità del polmone sinistro o destro
NOTA: Se l'operatore cerca di consegnare gli agenti non a uno specifico lobo polmonare destro o a un segmento polmonare sinistro, ma piuttosto all'intero polmone (polmone destro o sinistro), il catetere deve essere leggermente ritirato nei rispettivi bronchi del tronco principale, come indicato di seguito.-
Somministrazione polmonare a destra
- Dopo il passaggio 4.11, ruotare la scheda di plastica di plastica di 30 gradi (Figura5A).
- Tenere il mozzo del catetere e guidarlo naturalmente in parallelo alla linea mediana del topo, raggiungendola alle profondità necessarie per la canonazione della locanalena lato destro (Tabella1).
- Confermare l'aspetto del segno di tachipnea.
- Ruotare il mouse di -74 per consentire l'assistenza alla gravità per la consegna dell'agente (Figura5B).
- Ritirare il catetere in una posizione corrispondente al decollo del bronco tronco destro (Tabella 1). Assicurarsi che lo svelto del catetere sia rivolto verso il basso (Figura 5B).
- Consegnate al polmone destro 30 - L dello 0,3% con una punta di carico gel.
- Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando un contagocce di vetro.
- Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s. Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista coscienza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
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L'intera somministrazione polmonare sinistra
- Dopo il passaggio 4.11, ruotare la scheda di plastica di -74 gradi (Figura6A). In alternativa, la rotazione può avvenire dopo la fase 5.3.1.8 ritirando il catetere alla trachea, consentendo l'amministrazione bilaterale degli agenti IB.
- Tenere il mozzo del catetere e esercitare una leggera pressione per far avanzare il catetere nel catetere del tronco sinistro, posizionando una pressione modesta sia verso il basso (90o) che verso il bookend. La profondità dell'intubazione è guidata dalla Tabella 1.
- Confermare il segno nessuna tachipnea.
- Ruotare il topo di 86 gradi per consentire l'assistenza alla gravità con l'amministrazione dell'agente.
- Ritirare il catetere al bronco principale sinistro (le stesse distanze del polmone destro sono sufficienti, Tabella 1) e ruotare la svelatura delle facce del catetere verso il basso (Figura6B).
- Consegnate al polmone sinistro 30 - L dello 0,3% con una punta di carico gel.
- Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando un contagocce di vetro.
- Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s. Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista coscienza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
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Somministrazione polmonare a destra
6. Uso di approcci sequenziali di cannolazione IB per fornire volumi di agente regolati dalla dose ad ogni polmone
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Gruppo di amministrazione IT
- Eseguire la canonazione IT come descritto nei passaggi da 4.1 a 4.11.
- Consegnare 60 - L di 0,05% FITC-dextran (vedi Tabella dei materiali) con una punta di carico gel ( Figura1B).
- Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando i contagocce di vetro.
- Mantenere la posizione per 60 s e consentire il recupero del mouse come descritto sopra.
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Amministrazione IB bilaterale simmetrica
- Eseguire i passaggi 5.3.1.1–5.3.1.8 (polmone destro) e i passi 5.3.2.1–5.3.2.8 (polmone sinistro).
- Amministrare gli stessi volumi (30 gradi centigradi) di 0,05% FITC-dextran (o un agente sperimentale) su ciascun lato del polmone.
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Somministrazione IB bilaterale regolata in base alla dose
- Eseguire il passaggio 5.3.1.1–5.3.1.8 (polmone destro) e i passi 5.3.2.1–5.3.2.8 (polmone sinistro).
- Amministrare al polmone destro un volume maggiore (40 %) di 0,05% FITC-dextran al polmone destro maggiore e un volume minore (20) dello 0,05% FITC-dextran al polmone sinistro più piccolo. Al posto di FITC-dextran, un agente sperimentale può essere somministrato.
7. Uso della somministrazione IB regolata da dose per migliorare la simmetria delle lesioni polmonari indotte da bleomycina a dose singola (BLM)
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Gruppi amministrativi BLM
- Il gruppo amministrativo IB-BLM (1,2 mg/kg, tabella deimateriali) regolato in base alla dose: 60 (20 -L per il polmone sinistro e 40 -L per il polmone destro, rispettivamente) della soluzione BLM della soluzione BLM (n . 5). I controlli (n - 5) hanno ricevuto volumi simili di salina.
NOTA: fare riferimento ai passaggi 5.3.1 e 5.3.2. - Gruppo di amministrazione IT: 60 unità BLM sono state consegnate ai topi con tecniche di amministrazione IT.
NOTA: fare riferimento ai passaggi 6.1.1– 6.1.4.
- Il gruppo amministrativo IB-BLM (1,2 mg/kg, tabella deimateriali) regolato in base alla dose: 60 (20 -L per il polmone sinistro e 40 -L per il polmone destro, rispettivamente) della soluzione BLM della soluzione BLM (n . 5). I controlli (n - 5) hanno ricevuto volumi simili di salina.
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Misurazione della funzione polmonare
- Il giorno 21 dopo BLM o salina, anestesizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale (IP) di ketamina (160 mg/kg) e xylazina (32 mg/kg).
- Dopo aver confermato la profondità di anestesia da zampa / toe pizzico, eseguire una tracheostomia con un 18 G cannula (vedi Tabella dei Materiali).
- Collegare i topi al ventilatore e misurare la meccanica respiratoria come descritto in precedenza4.
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Raccolta e lavorazione dei tessuti polmonari
- Dopo la misurazione della meccanica polmonare, eutanasia i topi anestesiti mediante puntura cardiaca.
- Aprire la parete toracica e indurre pneumothoraces bilaterali.
- Gonfiare i polmoni con agarose a bassa fusione dell'1% (40 gradi centigradi)5 in PBS ad una pressione costante (42 cm H2O).
- Tagliare quattro o cinque pezzi del polmone lungo l'asse lungo trasversalmente, fissare in formalina al 10% e incorporare in paraffina.
- Tagliare 5 sezioni di m e macchiare con il tricromo di Masson per visualizzare la deposizione di collagene.
8 Cura post-procedurale
- Alla fine delle procedure di sopravvivenza, posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista conoscenza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
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Representative Results
L'intubazione IB selettiva è destinata a lobi specifici (polmone destro) o segmenti basilari (polmone sinistro).
La somministrazione IB di EBD al polmone destro è stata eseguita come descritto nella sezione 5.1. Dopo il completamento dell'esperimento, ai topi è stata somministrata una dose letale di ketamina/xylazina intraperitoneale, e i polmoni sono stati raccolti per la dimostrazione della distribuzione EBD (Figura4A, a destra). L'aspetto grossolano del polmone dimostra che il 90% dei tentativi cannulava il piccolo lobo posteriore del polmone destro, mentre il 10% dei tentativi mirava al lobo inferiore. Si ipotizza che i piccoli volumi di questi lobi spieghino la tachipnea compensativa del topo durante la cannulazione distale (per mantenere una media ventilazione attraverso il catetere).
La somministrazione IB di EBD al polmone sinistro è stata eseguita come descritto nella sezione 5.2. 100% dei tentativi mirai i segmenti inferiori del polmone sinistro (Figura 4B). A differenza dell'intubazione lato destro, non si verifica alcun tachipnea con questo impegno, che riflette l'intubazione (e la ventilazione) dei segmenti polmonari sinistro più grandi.
L'adattamento della tecnica di cannopolazione IB selettiva può colpire l'intero polmone sinistro o destro.
Una volta eseguita la cannulation IB, il ritiro del catetere IB (e i cambiamenti nel posizionamento del mouse, come descritto nella sezione 5.3) possono essere utilizzati per migliorare la consegna degli agenti a tutti i lobi del polmone destro (e a tutti i segmenti del polmone sinistro). Instillazione della soluzione EBD al polmone destro (sezione 5.3.1) ha preso di mira con successo tutti i lobi giusti, come dimostrato nella Figura 5C. Instillazione della soluzione EBD al polmone sinistro (sezione 5.3.2) ha preso di mira con successo tutti i segmenti a sinistra (Figura 6C).
Amministrazione IT o amministrazione IB simmetrica produce polmone asimmetrico concentrazioni di agenti parenchymal, che possono essere corretti da IB dose-regolazione.
I topi sono stati sottoposti a somministrazione bilaterale di 30 gradi l di 0,05% FITC-dextran al polmone sinistro e di 30 gradi di 0,05% FITC-dextran al polmone destro, come descritto nella sezione 6.2. In alternativa, i topi hanno ricevuto 60 gradi L di 0,05% FITC-dextran intratrachealmente secondo la sezione 6.1. Alla fine dell'esperimento, i topi sono stati eutanasiati tramite sovradosaggio di anestesia terminale (ketamina/xylazina). I polmoni sono stati immediatamente raccolti e omogeneizzati. La fluorescenza FITC (quantificata per densità ottica) è stata misurata con il lettore di lastre da 96 pozzi. La data è stata analizzata con il test t dello studente per i confronti a due gruppi.
Come descritto nella figura 7, sia l'IT (Figura 7A) che l'amministrazione IB simmetrica (Figura 7B) della FITC-dextran hanno portato alla fluorescenza psiarenmal FITC polmonare asimmetrica, con maggiori concentrazioni relative (normalizzate a peso) polmone sinistro. Ciò suggerisce che la fornitura polmonare asimmetrica di agenti sperimentali dopo l'amministrazione IT non è una conseguenza della presentazione asimmetrica di questi agenti a ogni bronco principale. Si è ipotizzato piuttosto che la parità di somministrazione principale (come assicurata dalla somministrazione simmetrica di IB) sia stata diluita dalle differenze di massa/peso del polmone, come osservato nella tabella 2.
Per superare queste differenze nella somministrazione simmetrica, il 40% di L di 0,05% FITC-dextran è stato somministrato al polmone destro più grande e 20 l al polmone sinistro più piccolo, secondo la sezione 6.3. Questa "somministrazione IB regolata con dose" ha migliorato la simmetria della consegna dell'agente parenchymal polmonare (Figura 8A). Nonostante questa correzione, tuttavia, abbiamo osservato un'eterogeneità persistente all'interno di diversi lobi del polmone destro (Figura 8B).
Lesione polmonare indotta da BLM in diversi sistemi di somministrazione:
Per dimostrare che la somministrazione di IB regolata dalla dose di agenti sperimentali può migliorare la modellazione della malattia polmonare diffusa, abbiamo somministrato BLM (un modello murino di lesioni polmonari fibrosi) sia intrachealmente che tramite somministrazione IB regolata dalla dose, come per sezione 7. Come previsto con questo modello di lesione, sia le iniezioni IT che IB di BLM hanno portato a lesioni polmonari e malattie sistemiche (con perdita di peso). Questa malattia sistemica si risolse in 7 giorni. La mortalità di 21 giorni era del 20% (1/5) nel gruppo IT e dello 0% (0/5) nel gruppo IB corretto per la dose.
21 giorni dopo l'amministrazione dell'IT o IB-BLM, i topi sono stati raccolti per l'istologia polmonare. Come dimostrato nelle immagini istologiche rappresentative (Figura 9A),
Per determinare se questa migliore omogeneità sinistra-destra della lesione polmonare fibrotica è fisiologicamente rilevante, è stato osservato che la somministrazione IB regolata dalla dose di BLM ha impartito una perdita più consistente della capacità inspiratoria (IC) e della conformità del sistema respiratorio (Crs), così come un aumento concordante in elastance (Ers) del sistema respiratorio (Ers) (Figura9B).
Figura 1: Anatomia della cannulation delle vie aeree del mouse. (A) Un fuso delle vie aeree del topo è stato fatto gonfiando un polmone di topo (raccolto da un topo da 25 g) con elastomero di silicio. (B) Posizionamento del catetere per l'amministrazione IT standard. (C) Collocamento catetere per l'amministrazione IB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione per la piattaforma di lavoro. (A) Un bookend metallico (angolo di 90 gradi) è piegato a 70. Un foro a vite viene posizionato nella linea mediana superiore per ancorare un mobile (80 mm x 150 mm). Hook and loop tape e una sutura sospensione sono posizionati per consentire il posizionamento di un mouse anesteto sulla scheda. (B) La scheda di plastica è ancorata con una vite sul regginolino metallico. La vite è sufficientemente allentata da consentire la rotazione della tavola in senso orario o in senso antiorario (-). (C) Un mouse anetizzato è posizionato utilizzando con nastro adesivo e loop (0,75" W) per l'amministrazione dell'agente IT/IB. Una sutura viene passata sotto gli incisivi del mouse per consentire la stabilizzazione della testa. L'operatore è posizionato sull'aspetto dorsale del mouse e il collo è illuminato tramite una lampada a collo d'oca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Creazione di cateteri personalizzati per l'amministrazione IB. (Passaggio 1) Per consentire una lunghezza sufficiente del catetere per attivare i bronchi principale, vengono combinati due cateteri. (Passaggio 2) I cateteri sono collegati con una leggera angolazione, facilitando l'intubazione selettiva ai bronchi principale. (Passaggio 3) Inoltre, la punta del catetere distale viene svelata, consentendo un migliore controllo direzionale dell'instillazione delle vie aeree. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Approccio per la cannulazione e la somministrazione selettiva del lonpo polmonare destro/sinistro. (A) Per colpire il polmone destro, la scheda di plastica viene ruotata di 30 gradi, migliorando la facilità di coinvolgimento selettivo del giusto bronco principale. Il catetere è avanzato (per le distanze proposto nella tabella 1) per coinvolgere in modo selettivo i lobi laterali destro. 20 -L dello 0,3% è stato somministrato EBD. Nel 90% dei tentativi, il lobo posteriore è cannulato. Il restante 10% dei tentativi impegna il lobo inferiore. (B) Per colpire il polmone sinistro, la scheda di plastica viene prima ruotata di -74 gradi per l'impegno del tronco sinistro. Dopo un'intubazione del catetere di successo, la rotazione viene quindi ridotta a -30 gradi per consentire alla gravità di aiutare con la consegna dell'agente. Per dimostrare l'impegno selettivo del lato sinistro, sono stati consegnati 40 - L di 0,3% EBD. Questo approccio ha preso di mira costantemente (100% dei tentativi) segmenti basilari del polmone sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Approccio di somministrazione simmetrica per fornire unilateralmente agenti all'intero polmone destro. (A) L'intubazione IB a destra è stata eseguita a 30 , identica alla canonazione selettiva del loubrio polmonare destro (Figura 4A). (B) La scheda di plastica è stata poi ruotata a -74 per consentire l'assistenza alla gravità durante l'amministrazione dell'agente. La punta del catetere viene quindi ritirata a profondità dettagliate nella Tabella 1, corrispondente al bronco principale destro. Lo spalancato della punta viene posizionato verso il basso ruotando il mozzo del catetere. (C) 30 -L di EBD è stato consegnato a -74 gradi, dimostrando una distribuzione diffusa del polmone destro dell'EBD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Approccio di amministrazione simmetrica di somministrare unilateralmente gli agenti all'intero polmone sinistro . (A) L'intubazione IB sul lato sinistro è stata eseguita a -74 , identica alla canonamicolazione selettiva del polmone sinistro (Figura 4B). (B) Dopo un'intubazione di successo, la scheda di plastica è stata poi ruotata di 86 gradi per consentire l'assistenza alla gravità durante l'amministrazione dell'agente. La punta del catetere viene quindi ritirata in profondità nella Tabella 1. Lo spalancato della punta viene spostato verso il basso ruotando il mozzo del catetere. (C) 30 L di EBD è stato consegnato con punta di carico gel, dimostrando diffusa somministrazione polmonare sinistra di EBD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: La somministrazione IT di agenti sperimentali è ugualmente consegnata ai bronchi principale, ma porta a diverse concentrazioni di parenchimale polmonare. (A) La somministrazione di un'IT pari allo 0,05% di FITC-dextran (60 gradi) ha impartito una maggiore fluorescenza nel polmone sinistro, suggerendo concentrazioni polmonari irregolari dell'agente erogato. (B) Questa fluorescenza parenchimale polmonare diseguale persiste anche quando a ogni bronco del tronco principale vengono somministrati volumi uguali pari allo 0,05%. Questo squilibrio parenchymal persistente, nonostante la consegna del tronco destro/sinistro uguale, suggerisce che le differenze nelle concentrazioni di agenti polmonari riflettono la diluizione nel polmone destro più grande (n - 10 per gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Miglioramento dell'omogeneità della deposizione dell'agente mediante IB regolato mediante dose l'amministrazione. (A) L'asimmetria della somministrazione del parencmale polmonare è migliorata quando una percentuale maggiore di agenti (40 gradi centigradi di 0,05% FITC-dextran) viene somministrata al polmone destro più grande e una proporzione minore di agente (20,05% FITC-dextran) al polmone sinistro più piccolo. (B) Nonostante questa migliore simmetria sinistra-destra, rimane l'eterogeneità della deposizione dell'agente (nero: lobo superiore; giallo: lobo medio; blu: lobo inferiore; verde: lobo posteriore; rosso: polmone sinistro). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Miglioramento del modello di fibrosi polmonare indotta da topo BLM utilizzando la somministrazione di IB regolata dalla dose. (A) La somministrazione IT del BLM (1,2 mg/kg in soluzione a 60 gradi) induce lesioni polmonari/fibrosi polmonari predominanti del lato sinistro 21 giorni dopo, coerentecon concentrazioni polmonari più elevate di agente in questo polmone più piccolo. La simmetria sinistra-destra migliora regolando il volume di BLM su ciascun lato del polmone: 40 gradi della soluzione viene somministrato al polmone destro più grande e 20 l della soluzione viene somministrato al polmone sinistro più piccolo. I: lobo inferiore, M: lobo medio, S: lobo superiore, P: lobo posteriore. Le immagini rappresentano i lobi di un singolo mouse rappresentativo. (B) Coerentemente con una migliore simmetria di distribuzione, la somministrazione IB regolata dalla dose di BLM migliora la modellazione fisiologica della fibrosi polmonare, con aumenti più rappresentativi dell'enastance del sistema respiratorio (Ers) e capacità inspiratoria (IC) e la conformità dinamica del sistema respiratorio (Crs). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Peso corporeo (g) | Numero di topi testati | Profondità catetere (mm) per la canonazione selettiva |
Profondità del catetere (mm) per la canulazione del polmone intero | |
| Polmone destro | Polmone sinistro | |||
| 15 - 19 | 17 mi lato | 37 Mi lasa' di | 38 Mi lasa | 26 del sistema di |
| 20 - 25 | 22 Milia | 38 Mi lasa | 39 mila: l'altro | 27 mi lapiùdel |
| 25 - 30 | 29 del 22 221 | 39 mila: l'altro | 40 anni ( | 28 mi la più del 24 |
| > 30 | 11 Del sistema di | 40 anni ( | 41 del sistema | 31 Milia |
Tabella 1: Inserimento della profondità di catetere consigliato. Le profondità del catetere previste necessarie per cannulare selettivamente i polmoni distali e procrossicisono sono stati determinati empiricamente utilizzando topi C57BL/6 di vari pesi (totale 79 topi).
| Peso corporeo (g) | Numero di topi testati | Rapporto dei pesi polmonari |
| 14 - 10 | 25 mi lato | 2.01 - 0,16 |
| 20 - 25 | 35 Mi lasa | 1,88 x 0,27 |
| 25 - 30 | 15 Mi lasa del sistema | 1,88 x 0,27 |
| > 30 | 6 È possibile: | 2.03 - 0,09 |
Tabella 2: Rapporti di peso polmonare destro:sinistro. Le differenze nei pesi polmonari osservate in 81 topi C57BL/6 dimostrano una logica per la corretta somministrazione di farmaci IB. I polmoni sono stati sezionati e pesati dopo una dose letale di ketamina e xilola.
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Discussion
La lesione polmonare è stata modellata in modo classico nei roditori utilizzando la somministrazione IT di agenti dannosi come BLM6. Tale amministrazione IT, tuttavia, porta solo a lesioni irregolari, riflettendo la natura non mirata della consegna polmonare con questo approccio7. Queste limitazioni della modellazione delle lesioni polmonari sono sfide istruttive affrontate quando si tenta la consegna IT di agenti sperimentali non dannosi, come farmaci, siRNA o terapie cellulari.
In questa relazione, descriviamo l'amministrazione diretta IB degli agenti sperimentali. Questo approccio offre due vantaggi distinti rispetto agli approcci classici all'amministrazione IT. In primo luogo, l'approccio consente una somministrazione unilaterale selettiva a un polmone, consentendo la risparmia del polmone contralaterale. Questo approccio è utile per la somministrazione selettiva di farmaci in un polmone unilaterale ferito (ad esempio, lesioni da reperfusione di ischemia8), evitando effetti non specifici nel polmone non ferito. Inoltre, la somministrazione diretta delle cellule tumorali può essere utilizzata per distinguere la crescita tumorale primaria da diffusione contralaterale e metastatica9,10.
In secondo luogo, la relazione illustra in dettaglio un beneficio precedentemente non riconosciuto dell'amministrazione IB. Come descritto nella Figura 7A, La somministrazione IT concentra relativamente gli agenti sperimentali all'interno del polmone sinistro più piccolo. Questa asimmetria può essere corretta somministrando un volume relativamente maggiore di agente al polmone destro maggiore (Tabella 2), fornendo un volume minore al polmone sinistro più piccolo (Figura 8A). La rilevanza di questa somministrazione di IB regolata dalla dose per la lesione polmonare fibrotica indotta da BLM è stata dimostrata qui. L'aggiustamento della dose mitiga la lesione al polmone sinistro (che ha ricevuto meno BLM), aumentando al contempo la lesione al polmone destro (Figura 9A). Questa maggiore simmetria coincide con una minore variabilità della lesione polmonare, quantificata dalle misurazioni della funzione polmonare (Figura 9B).
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, tra cui la necessità di avere un supporto in grado di alterare facilmente e ripetutamente il posizionamento degli animali (cioè la rotazione). Più critica è la capacità di determinare quando è stata raggiunta la cannolazione polmonare selettiva. Come descritto nella sezione 4.12, l'uso di uno spirometro (in cui una colonna d'acqua dimostra la ventilazione delle maree) garantisce il successo della cannulazione tracheale3. L'osservazione della tachipnea del topo è coerente con la cannolazione del segmento polmonare destro distale, mentre l'assenza di dispnea (nonostante la sensazione di resistenza con l'inserimento del catetere) ha suggerito la cannulazione del polmone sinistro. Utilizzando queste tecniche di localizzazione non operative, l'operatore dovrebbe essere in grado di guidare con precisione la canonaia IB e la deposizione di agenti sperimentali.
Questo approccio presenta diverse limitazioni. Il modello IT di consegna degli agenti è attraente per la sua semplicità. Richiede un grado moderato di pratica e abilità tecnica, anche se un operatore esperto può ancora eseguire rapidamente questa tecnica all'interno della finestra di anestesia isoflurana. L'ulteriore competenza/pratica tecnica richiesta, tuttavia, può essere facilmente compensata dal vantaggio di questo approccio negli esperimenti che danno priorità alla consegna selettiva di agente/siRNA/cellula o a una maggiore omogeneità della deposizione dell'agente. Un'ulteriore limitazione a questo metodo è l'incertezza sulla lunghezza dell'inserimento del catetere. Come descritto nella Tabella 1, sono stati misurati 79 topi maschi e femmine per stimare la profondità di inserimento del catetere necessaria per la cannolazione IB selettiva. Questi dati fungono da risorsa per guidare l'operatore a eseguire il nostro protocollo. Tuttavia, non possiamo estrapolare con sicurezza la nostra risorsa ad altri ceppi di topo (compresi i topi da urlo) o a topi morbosamente obesi. Inoltre, non abbiamo misurato se ci sono differenze nel volume dello spazio aereo (lobar, segmentale) che variano in base al peso. Come tale, è possibile che topi di grandi dimensioni siano in grado di ospitare volumi di instillazione più grandi con la somministrazione IB. Pertanto, l'operatore deve eseguire una fase iniziale di ottimizzazione/risoluzione dei problemi (utilizzando l'instillazione EBD) per garantire che la nostra tecnica sia ben adattata al modello di mouse desiderato.
In sintesi, questa relazione descrive una nuova tecnica IB che può essere utilizzata per somministrare selettivamente agenti sperimentali a un singolo polmone o adattati per garantire la distribuzione simmetrica in entrambi i polmoni. Questi vantaggi giustificano l'aumento marginale della complessità rispetto alle tecniche IT standard.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NHLBI HL125371 a E.P.S. e dalla concessione W81XWH-17-1-0051 a Y.Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G shielded IV Catheter | BD | 381423 | |
| Bleomycin | Enzo life sciences | BML-AP302-0010 | |
| Compact Mini rodent anesthesia machine | DRE Veterinary | 9280 | |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC | |
| LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-30W | |
| Low temperature cautery with fine tip | Bovie | AA02 | |
| Precisionglide needle, 18G x 1" | BD | 305195 | Beveled tip, 12 mm in length |
| Xylazine | AKORN | NDC 59399-110-20 | |
| Zatamine | VetOne | NDC 13985-702-10 | Ketamine |
References
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