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Immunology and Infection

प्रकार 2 मधुमेह के साथ सहयोग में Nonalcoholic Steatohepatitis के लिए एक उन्नत Murine मॉडल

Published: April 26, 2019 doi: 10.3791/59470
Automatic Translation
1,2,3,4, 3,6, 3,5, 3,5, *1,2,4, *2,3,5
1Department of Endocrinology & Metabolism Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 2Berlin Institute of Health (BIH), 3Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 4DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 5Institute of Medical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 6Julius Wolff Institute (JWI) and Center for Musculoskeletal Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin
* These authors contributed equally

Summary

Nonalcoholic steatohepatitis (नैश) के लिए एक सरल और विश्वसनीय आहार प्रेरित कृंतक पशु मॉडल, जानवरों और एक विशिष्ट उच्च वसा वाले आहार के प्रशासन के गैर एसपीएफ़ आवास के माध्यम से प्राप्त की है, वर्णित है । हम यकृत और वसा प्रतिरक्षा सेल सबसेट की पहचान का वर्णन करने के लिए पर्यावरण कीटाणुओं को उजागर द्वारा मानव प्रतिरक्षाविज्ञानी शर्तों संक्षेप ।

Abstract

मोटापा जीर्ण कम ग्रेड सूजन और इंसुलिन प्रतिरोध के साथ जुड़ा हुआ है, जीर्ण चयापचय रोगों के एक बढ़ती व्यापकता के लिए योगदान, ऐसे प्रकार के रूप में 2 मधुमेह और nonalcoholic steatohepatitis (नैश). हाल के शोध की स्थापना की है कि समर्थक भड़काऊ प्रतिरक्षा कोशिकाओं मोटापे से ग्रस्त hypertrophic वसा ऊतक और जिगर घुसपैठ । चयापचय homeostasis के संदर्भ में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उभरते महत्व को देखते हुए, वहां एक महत्वपूर्ण करने के लिए मात्रा और प्रकार के विकास के दौरान उनके संशोधन विशेषताएं 2 मधुमेह और नैश की जरूरत है । हालांकि, जानवरों के मॉडल है कि रोगविज्ञानी मानव नैश की विशिष्ट सुविधाओं को प्रेरित विरल हैं ।

इस अनुच्छेद में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक के बिना एक विश्वसनीय माउस मॉडल में जिगर और वसा ऊतक से अलग प्रतिरक्षा सेल सबसेट की पहचान NASH, आवास उच्च वसा वाले आहार द्वारा स्थापित (HFD) चूहों गैर विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) शर्तों के तहत एक न्यूनतम सात सप्ताह के लिए बैरियर । हम गैर-एसपीएफ स्थितियों में चूहों के हैंडलिंग, ऊतकों के पाचन और मैक्रोफेज की पहचान, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, द्रुमाकृतिक कोशिकाओं, बी और टी सेल सबसेट प्रवाह कोशिका मिति द्वारा प्रदर्शन । प्रतिनिधिक फ्लो साइटोमेट्री भूखंड एसपीएफ एचएफडी चूहों और गैर-एसपीएफ चूहों से प्रदान की जाती है । विश्वसनीय और व्याख्यात्मक डाटा प्राप्त करने के लिए, ऊतक पाचन के लिए एंटीबॉडी, सटीक और सटीक तरीकों का उपयोग और प्रवाह कोशिका मिति प्रयोगों में उचित गेटिंग महत्वपूर्ण तत्व हैं ।

चूहों में उन्हें गैर-एसपीएफ शर्तों में आवास और माइक्रोबियल एंटीजन के लिए अविशिष्ट जोखिम को बहाल करने के लिए हस्तक्षेप प्रतिरक्षाविज्ञानी परिवर्तन के बीच कड़ी की जांच के लिए एक प्रासंगिक उपकरण प्रदान कर सकता है, आहार प्रेरित मोटापा और संबंधित दीर्घकालिक जटिलताओं ।

Introduction

मोटापा एक multifactorial विकार और हृदय रोग, स्ट्रोक, nonalcoholic steatohepatitis (नैश), प्रकार 2 मधुमेह (T2D) और कैंसर के कुछ प्रकार के विकास के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है. दुनियाभर में मोटापे का प्रचलन तेजी से बढ़ रहा है । आज, २,१००,०००,००० लोग-दुनिया की आबादी का लगभग 30%-या तो मोटापे से ग्रस्त है या अधिक वजन1। मोटापे से जुड़े इंसुलिन प्रतिरोध T2D करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जब थक अग्नाशय आइलेट बीटा कोशिकाओं को इंसुलिन के लिए वृद्धि की जरूरत के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए विफल ग्लूकोज homeostasis बनाए रखने के लिए2.

वसा ऊतक विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है जिसमें एडिपोसाइट्स, एंडोथीलियल कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं । मोटापे की प्रगति के दौरान, संख्या और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि में परिवर्तन hypertrophic वसा ऊतक के कम ग्रेड सूजन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं3,4. विशेष रूप से, यह पाया गया है कि अत्यधिक ऊर्जा का सेवन, रक्त ग्लूकोज, ट्राइग्लिसराइड्स और मुक्त फैटी एसिड के लंबे समय से ऊंचा स्तर के साथ, एडिपोसाइट हाइपोक्सिया की ओर जाता है, एंडोप्लाज्मिक जालिका तनाव, बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल समारोह और बढ़ाया cytokine स्राव, समर्थक भड़काऊ वसा प्रतिरक्षा कोशिकाओं5,6के सक्रियण में जिसके परिणामस्वरूप. पिछले अनुसंधान मुख्य रूप से जंमजात प्रतिरक्षा पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन हाल ही में और अधिक अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं (टी और बी कोशिकाओं) ग्लूकोज homeostasis के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में उभरा है । वे भड़काऊ (सहित सीडी 8+ t कोशिकाओं, Th1, और बी कोशिकाओं) या मुख्य रूप से विनियामक कार्य (सहित नियामक टी (treg) कोशिकाओं, Th2 कोशिकाओं) और दोनों को बढ़ा या इंसुलिन प्रतिरोध के खिलाफ की रक्षा कर सकते हैं7,8 , ९।

इसके अलावा, कई तंत्र को समझाने की कैसे मोटापा steatohepatitis बढ़ जाती है, वसा ऊतक द्वारा साइटोकिन्स के उत्पादन में वृद्धि सहित10का प्रस्ताव किया गया । नैश, nonalcoholic फैटी लीवर रोग के प्रगतिशील रूप और विकसित देशों में एक प्रमुख स्वास्थ्य बोझ, histologically हेपाटोसाइट्स, लिपिड संचय, फाइब्रोसिस और pericellular सूजन की विशेषता है और करने के लिए प्रगति कर सकते है सिरोसिस, अंत चरण जिगर की बीमारी या hepatocellular कार्सिनोमा । कई आहार (उदाहरण के लिए methionine और choline कमी आहार11) nash-गैर में जिगर विकृति की तरह मानव पशु मॉडल को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, लेकिन इन तरीकों की सबसे nash और उसके चयापचय के मानव शर्तों संक्षेप नहीं है परिणाम के रूप में वे या तो विशिष्ट जीन पीटा, गैर शारीरिक आहार जोड़तोड़ या मानव नैश के विशिष्ट कमी इंसुलिन प्रतिरोध की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, चयापचय रोगों के अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ वर्तमान में मानक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) की स्थिति के तहत रखे प्रयोगशाला चूहों के साथ किए गए प्रयोगों पर आधारित है । उन बाधा सुविधाओं को असामांय रूप से स्वच्छ है और विचार नहीं माइक्रोबियल विविधता मनुष्य मुठभेड़ है, जो पशु अध्ययन के अनुवाद की प्रक्रिया में कठिनाइयों के लिए नैदानिक दृष्टिकोण के लिए खाते मई12,13 , १४।

एक उन्नत माउस मॉडल reproducing मानव इम्यूनोलॉजिकल परिस्थितियों में इंसुलिन प्रतिरोध और नैश के विकास के दौरान वसा ऊतक और जिगर में विभिन्न प्रतिरक्षा सेल सबसेट की जांच करने के लिए, चूहों अर्द्ध बाँझ में व्यक्तिगत पिंजरों में रखे गए थे एक बाधा के बिना शर्तें । चूहों के तहत स्थित antigen उजागर शर्तों उच्च वसा वाले आहार (HFD)13खिला के 15 सप्ताह के बाद पहले से ही नैश की तरह जिगर विकृति विकसित की है । उम्र से मेल खाती एसपीएफ चूहों की तुलना में वे मैक्रोवेकुलर steatosis, यकृत घुसपैठ और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियण विकसित की है ।

इस पांडुलिपि एक मजबूत प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण को परिभाषित करने और माउस से प्रतिरक्षा सेल सबसेट गिनती का वर्णन ऊतक और जिगर नैश के एक मॉडल में वसा । प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण एक साथ आरटी पीसीआर या immunohistoरासायन दृष्टिकोण करने के लिए इसके विपरीत में एक ही समय में एक से अधिक मापदंडों का पता लगाने की अनुमति देता है ।

संक्षेप में, हमारे अध्ययन में इंसुलिन प्रतिरोध और नैश के विकास की जांच करने के लिए अल्पकालिक HFD के एक माउस मॉडल प्रदान करता है और अंतर्निहित तंत्र भी मानव स्थिति के प्रति निष्ठा दर्शाती है ।

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Protocol

यह अध्ययन हमारे संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के पर्यवेक्षण के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और पशु कल्याण अधिनियम की प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था । पशु प्रोटोकॉल चारिने बर्लिन, जर्मनी के संस्थागत नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था, और landesamt फर gesundheit und soziales द्वारा अनुमोदित और आने के दिशा निर्देशों का पालन किया गया ।

1. Steatohepatitis के आहार प्रेरित पशु मॉडल

  1. 4 सप्ताह की आयु में गैर-एसपीएफ आवास के लिए चूहों (C57Bl/6J, माले) को स्थानांतरित करें और उन्हें लगातार पर्यावरण रोगजनकों/एंटीजन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बेनकाब । एंटीजन इस तरह से हवाई यात्रा द्वारा वितरित कर रहे हैं के रूप में प्रयोगशाला जानवरों की दैनिक हैंडलिंग द्वारा जोखिम की गारंटी.
  2. चूहों (C57Bl j, पुरुष, 12 सप्ताह पुराने) एक 12 h:12 h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर पारंपरिक फिल्टर के साथ खुले caging सिस्टम में 22 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखें । विकिरणन या आटोक्लेव प्रयोगात्मक आहार और बिस्तर नहीं है. बिना मास्क या हेयरनेट के पशु आवास सुविधा का उपयोग । पशु कमरे के बीच खुले दरवाजे । एयरशॉवर का इस्तेमाल न करें ।
  3. प्रयोगशाला जानवरों की दैनिक हैंडलिंग की गारंटी और एक नियमित आधार पर कमरे स्विच ताकि एंटीजन हवाई यात्रा द्वारा वितरित कर रहे हैं । प्रयोगशाला चूहों के बगल में कमरे में रखे स्तनधारी प्रयोगशाला जानवरों के बिस्तर से एंटीजन के लिए दैनिक गैर विशिष्ट माइक्रोबियल जोखिम के साथ गंदे आवास के पूरक हैं ।
  4. CD44 के अनुपात को मापने-CD62L- effector स्मृति सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं में रक्त और तिल्ली प्रवाह कोशिका मिति का उपयोग कर (के रूप में13refefence में वर्णित).
    नोट: इस संबंध में हम effector स्मृति के 20% की वृद्धि को परिभाषित सीडी 8+ t कोशिकाओं से सीडी 8+ टी कोशिकाओं पर्याप्त माइक्रोबियल जोखिम के सबूत के रूप में.
  5. शुरू hfd (वसा से ६० kj%, प्रोटीन से 19 kj% और कार्बोहाइड्रेट और विज्ञापन libitum के साथ पानी की खपत 6% सुक्रोज सामग्री के साथ पांच सप्ताह के पुराने C57Bl/6j पुरुष चूहों के साथ 7-15 सप्ताह के लिए । HFD वसा से ६०% kJ शामिल करना चाहिए (जैसा कि ऊपर वर्णित है) क्रम में प्रयोग के दौरान इंसुलिन प्रतिरोध के विकास के लिए प्रेरित करने के लिए ।
    नोट: Hematoxylin धुंधला प्रदर्शन किया जाना चाहिए और hepatocyte गुब्बारों के रूप में ऊतकीय विशेषताओं, मैलोरी denk निकायों, प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और macrovesicular steatosis नैश का प्रदर्शन करने के लिए पाया जाना चाहिए जिगर विकृति की तरह (के रूप में संदर्भ में दिखाया गया है 13) ।

2. अभिकर्मकों और समाधानों की तैयारी

  1. ०.५% BSA और ACK (अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम) lysis बफर के साथ पूरक ७०% इथेनॉल, फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) तैयार ।
  2. अभिरंजन बफर
    1. 2% FCS PBS प्राप्त करने के लिए PBS के ५०० मिलीलीटर में भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के 10 मिलीलीटर भंग । उपयोग करने से पहले बर्फ पर धुंधला बफर प्लेस ।
    2. एक प्लास्टिक की बोतल में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर ।
  3. वसा ऊतक पाचन के लिए collagenase समाधान
    1. २.५ ग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (बीएसए) ५०० एमएल में ०.५ प्रतिशत बीएसए/पीबीएस प्राप्त करने के लिए ।
    2. भंग ७४.५ ग्राम CaCl2 के 10 मिलीलीटर में ०.५% BSA/pbs एक 10 मिमी cacl2 समाधान प्राप्त करने के लिए.
    3. Collagenase प्रकार द्वितीय के 1 मिलीग्राम जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) के प्रत्येक मिलीलीटर के लिए ०.५% BSA के साथ 10 मिमी cacl2 pbs.
    4. प्रति ग्राम वसा ऊतक नमूना के 3 मिलीलीटर कोलेजिनेज़ डाइजेस्ट समाधान तैयार करें । प्रत्येक अलगाव के लिए नए सिरे से collagenase समाधान तैयार करते हैं ।
  4. जिगर ऊतक पाचन के लिए collagenase समाधान
    1. २.५ ग्राम बीएसए का ५०० एमएल में हंक का संतुलित लवण विलयन (एचबीएसएस) ०.५ प्रतिशत बीएसए एचबीएसएस प्राप्त करना ।
    2. 2% एफसीएस ०.५% बीएसए/एचबीएसएस प्राप्त करने के लिए ०.५% बीएसए/एचबीएसएस की ५०० एमएल में 10 मिलीलीटर एफसीएस जोड़ें ।
    3. जोड़ें ०.५ मिलीग्राम collagenase प्रकार चतुर्थ ( सामग्री तालिकादेखें) के प्रत्येक मिलीलीटर के लिए 2% FCS ०.५% बीएसए/
    4. 2% FCS के ०.०२ मिलीग्राम डीनेज प्रति एमएल जोड़ें ०.५% बीएसए/एचबीएसएसएस कोलेगनेज सॉल्यूशन ।
    5. लिवर के टिश्यू सैंपल के हिसाब से 13 एमएल कोलेगनेस डाइजेस्ट सॉल्यूशन तैयार करें ।
    6. प्रत्येक अलगाव के लिए नए सिरे से collagenase समाधान तैयार करते हैं ।

3. एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी

  1. वसा ऊतक पाचन
    1. Isoflurane संज्ञाहरण के माध्यम से चूहों euthanize ग्रीवा अव्यवस्था के बाद. ७०% इथेनॉल के साथ छाती स्प्रे । ध्यान से आवरण और रिब पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ पेट की दीवार के माध्यम से एक 5-6 सेमी केंद्रीय चीरा कर फुफ्फुस गुहा और दिल का पर्दाफाश करने के लिए ।
      नोट: अंतर्निहित अंगों को नुकसान नहीं है और कैंची सुझाव रखने के लिए ।
    2. एक 26 ग्राम सुई का उपयोग कर बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में ०.९% खारा समाधान के कम से 10 मिलीलीटर सुई ।
      नोट: सफल छिड़काव जिगर के धवलन द्वारा विख्यात है ।
    3. कैंची के साथ पेरिटोनियल गुहा खोलें और ठीक घुमावदार कैंची के साथ प्रत्येक पक्ष पर perigonadal वसा पैड बाहर काट. ठीक घुमावदार कैंची के साथ जननांगों ऊतक काटना और वसा ऊतक वजन.
    4. कैंची का उपयोग कर यांत्रिक पृथक्करण प्रदर्शन और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पेट्री डिश में ठीक टुकड़ों में वसा ऊतक काट । ५० मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों और कुल्ला पेट्री डिश के लिए ०.५% BSA/PBS के 1 मिलीलीटर
    5. वसा ऊतकों के प्रति ग्राम (चरण २.३ में तैयार) के रूप में 3 मिलीलीटर एडिपोस ऊतक डाइजेस्ट समाधान जोड़ें । कोमल मिलाते हुए (२०० rpm) के तहत 20 मिनट के लिए ३७ ° c पर वसा ऊतक समाधान सेते ।
    6. ०.५% BSA/PBS की 5 मिलीलीटर की प्रति ग्राम वसा ऊतक और बर्फ पर जगह जोड़ें । एक 10 मिलीलीटर सीरम विज्ञानी पिपेट के साथ कई बार समाधान triturate और यह एक छलनी के माध्यम से पारित (१०० μm) एक प्लंजर की सहायता से ।
    7. 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ५०० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    8. Pipetting द्वारा फ्लोटिंग एडिपोसाइट अंश निकालें । सेल गोली (stromal संवहनी अंश) ACK lysis बफ़र के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित ( सामग्री तालिकादेखें) । 2% FCS PBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ५०० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    10. Decant supernatant और फिर से निलंबित सेल गोली के २५० μL में 2% FCS PBS ।
    11. Trypan ब्लू अपवर्जन का उपयोग कर एक hemocytometer पर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
  2. जिगर ऊतक पाचन
    1. PBS और परिवहन बर्फ पर से भरा एक शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में जिगर स्टोर ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पेट्री डिश में सिरिंज टिकटों का उपयोग यांत्रिक वियोजन प्रदर्शन. एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में विच्छेदित जिगर ऊतक डाल गर्म जिगर डाइजेस्ट समाधान के 10 मिलीलीटर युक्त । 3 एमएल लिवर डाइजेस्ट घोल के साथ पेट्री डिश को कुल्ला कर लें ।
    3. कोमल मिलाते हुए (२०० rpm) के तहत 20 मिनट के लिए ३७ ° c पर जिगर ऊतक समाधान सेने ।
    4. इसमें 20 एमएल का एचबीएसएस डालें । एक 10 मिलीलीटर सीरम विज्ञानी पिपेट के साथ कई बार समाधान triturate और यह एक छलनी के माध्यम से पारित (१०० μm) एक प्लंजर की सहायता से ।
    5. 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ५०० x g पर अपकेंद्रित्र । Supernatant decant और HBSS के 20 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
    6. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 30 x g पर अपकेंद्रित्र hepatocyte मैट्रिक्स को दूर करने के लिए । सेल गोली फेंक ।
    7. 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ५०० x g पर supernatant केंद्राउत्र । ३३% कम चिपचिपापन घनत्व ढाल मध्यम समाधान के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) HBSS में (८०० एक्स जी; 30 मिनट; कमरे के तापमान, ब्रेक नहीं) के बाद ।
    8. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए ACK lysis बफर और सेबेट के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend । फिर इसमें 10 एमएल का एचबीएसएस डालें ।
      नोट: एक स्थानांतरण पिपेट (प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एरिथ्रोसाइट्स के साथ गोली लेने के बिना जितना संभव हो) के साथ बहुत सावधानी से अंतरावस्था (hepatocytes) के साथ supernatant महाप्राण त्यागने के लिए ।
    9. एक 30 μm छलनी के माध्यम से कोशिकाओं पास एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में ५०० x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस । Decant supernatant और फिर से निलंबित सेल गोली के २५० μL में 2% FCS PBS ।
    10. Trypan ब्लू अपवर्जन का उपयोग कर एक hemocytometer पर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना ।

4. सतह धुंधला

  1. टी-सेल-सबसेट (पैनल 1) और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं (पैनल 2) के लिए एंटीबॉडी मिक्स तैयार करें जैसा कि तालिका 1 और तालिका 2में वर्णित है । वॉल्यूम एंटीबॉडी सांद्रता के बारे में एक नमूना (१०० μL) के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है ।
    नोट: लिम्फोसाइटों और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं autofluorescence में मतभेद मौजूद है और अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए.
  2. सतह धुंधला के लिए एक polystyrene FACS ट्यूब में १०० μL में 3 x 106 कोशिकाओं का उपयोग करें । ब्लॉक करने के लिए एफसी रिसेप्टर्स विरोधी के 10 μL जोड़ें CD16/CD32 एंटीबॉडी (पतला 1:100) और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट । साइड स्कैटर (एसएससी) और आगे स्कैटर (FSC) समायोजित करने के लिए नकारात्मक सेल जनसंख्या का स्थान निर्धारित करने के लिए एक बिना दाग वाले नकारात्मक नियंत्रण नमूने का उपयोग करें ।
  3. भंवर और पैनल 1 और 2 पैनल के लिए एंटीबॉडी मिश्रण के उपयुक्त मात्रा में जोड़ें । जीने और मृत कोशिका भेदभाव के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए व्यवहार्यता डाई के 1 μL जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेक्यूबेट और प्रकाश से संरक्षित ।
  4. 4 ° c पर 5 मिनट के लिए दो बार 2% FCS PBS और अपकेंद्रित्र के 2 मिलीलीटर के साथ ३०० x g पर धोएं ।
  5. 2% FCS PBS के ३०० μL में सेल गोली को निलंबित और FACS विश्लेषण तक 4 ° c पर स्टोर ।
    नोट: माप शुरू करने से पहले 30 μm कोशिका छलनी के माध्यम से polystyrene FACS ट्यूब और भंवर में कोशिकाओं के पास । प्रवाह कोशिका मिति का निष्पादन लेबल किए गए कक्षों के साथ किया गया, जो 2% एफसीएस पीबीएस में 1-3 एच के लिए 4 ° ब् पर भंडारित होते हैं ।

5. प्रवाह कोशिका मिति मुआवजा, अधिग्रहण, और Gating

  1. Fsc और एसएससी सेट और श् वेताणु आबादी का पता लगाने और मलबे और व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए प्रवाह cytometer के voltages को समायोजित करने के लिए बिना दाग नकारात्मक नियंत्रण नमूना चलाएँ. मलबे और मृत कोशिकाओं को बाहर निकालें ।
    नोट: जिगर से सेल निलंबन की व्यवहार्यता एक अतिरिक्त घनत्व जुदाई कदम के कारण perigonadal वसा ऊतक से सेल निलंबन से व्यवहार्यता से कम हो सकता है ।
  2. बहु रंग मुआवजा के लिए एकल दाग नियंत्रण नमूने चलाएँ ।
    नोट: एंटीबॉडी कैप्चर मोतियों का उपयोग वर्णक्रमीय अतिव्यापन के लिए समायोजित करने के लिए भी किया जा सकता है यदि कोशिकाओं के उपयोग की भरपाई करने के लिए ब्याज की एक सेल जनसंख्या के कक्षों की संख्या बहुत कम है । कोशिकाओं के संभावित autofluorescence संकेतों का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति एक (FMO) शूंय से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए नियंत्रण की सिफारिश की है लेकिन इस प्रोटोकॉल में लागू नहीं किया गया ।
  3. माप शुरू, घटनाओं की उचित संख्या इकट्ठा (कम से ५०,००० घटनाओं) और रिकॉर्ड प्रयोगात्मक डेटा.
  4. विश्लेषण के लिए FCS डेटा फ़ाइलों को निर्यात और रणनीति gating सेट । CD45+ श्वेत रक्त कोशिकाओं पर गेट बाद सेल आबादी की पहचान करने के लिए ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल वर्णित जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सतह मार्कर के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है murine perigonadal वसा ऊतक और जिगर से आहार प्रेरित नैश के एक मॉडल में । इस मॉडल में, नैश hfd प्लस सुक्रोज के प्रशासन द्वारा प्रेरित किया गया (6%) C57Bl/6J चूहों में 7 से 15 हफ्तों के लिए पीने के पानी में, के रूप में पहले13रिपोर्ट । महत्वपूर्ण बात, चूहों अर्द्ध बाँझ शर्तों में रखे थे और, इस प्रकार, प्रयोग भर में पर्यावरण एंटीजन के संपर्क में । HFD एसपीएफ शर्तों और चाउ आहार के तहत रखे चूहों में रखे चूहे एसपीएफ और गैर-एसपीएफ शर्तों नियंत्रण के रूप में कार्य किया । HFD खिला महत्वपूर्ण शरीर के वजन के परिणामस्वरूप पहले से ही दोनों समूहों में 7 सप्ताह के बाद । शरीर के वजन में एक महत्वपूर्ण अंतर पहले 4 सप्ताह (पी < ०.००१) में स्पष्ट है और निंनलिखित प्रायोगिक सप्ताह भर में महत्वपूर्ण रहा था । हालांकि, 7 सप्ताह13के बाद एसपीएफ और गैर-एसपीएफ चूहों के बीच वजन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया । पीनियल संवहनी भिन्न और प्रतिरक्षा कोशिकाओं perigonadal वसा ऊतक और पुरुष चूहों के यकृत से 7 सप्ताह के लिए एक hfd खिलाया collagenase पाचन द्वारा अलग थे. प्रतिरक्षा कोशिकाओं fluorophore के साथ लेबल थे-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी और टी कोशिकाओं के अनुपात, बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, एनके कोशिकाओं, द्रुमाकृतिक कोशिकाओं और granulocytes प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण के माध्यम से मात्रा निर्धारित किया गया । टी सेल subpopulations के लिए Gating, द्विक भेदभाव सहित, और व्यवहार्यता धुंधला, murine perigonadal वसा में चित्र 1में सचित्र है । CD45+ ल्यूकोसाइट्स सबसे पहले सीडी 4 और सीडी 8 के लिए gated हैं और बाद में CD44 और CD62L के लिए भोली, केंद्रीय स्मृति, effector स्मृति और Effector T कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए gated. CD44+ कोशिकाओं तो आगे CD127, KLRG1 और पीडी-1 के साथ विशेषता थे । चित्रा 2 बी कोशिकाओं, granulocytes, एनके कोशिकाओं, मैक्रोफेज और द्रुमाकृतिक कोशिकाओं का विश्लेषण के लिए gating रणनीति प्रदान करता है ।

HFD के murine जिगर के भीतर टी कोशिकाओं के extracellular धुंधला के प्रतिनिधि परिणाम उजागर चूहों HFD एसपीएफ चूहों की तुलना में चित्रा 3एमें प्रदर्शन कर रहे हैं. वास्तव में, effector मेमोरी सीडी 4+ और सीडी 8+ t कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत hfd में पता लगाया जा सकता है चूहों उजागर, जबकि intrahepatic सरल सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं में काफी कम करने के लिए एसपीएफ चूहों की तुलना में उजागर पाया गया सप्ताह 7 (चित्र 3क) ।

इन परिणामों को मान्य करने के लिए, यकृत भड़काऊ प्रतिक्रिया antigen प्रदर्शन के साथ जुड़े hematoxylin द्वारा जांच की गई थी/ गंभीर steatosis, बड़े लिपिड बूंदों की वृद्धि सहित मैक्रोवेकुलर steatosis में जिसके परिणामस्वरूप, lobular सूजन, hepatocellular गुब्बारों और नष्ट lobular संरचना, HFD में पाया गया चूहों उजागर जबकि केवल कुछ एसपीएफ चूहों एक हल्के वसा प्रदर्शित जिगर में संचय (चित्रा 3बी). जैसा कि चित्रा 3सीमें बताया गया है, एनके सेल्स का प्रतिशत एचएफडी के पेरिग्नोनियल एडिपोस टिश्यू में अधिक था जो चूहों से उजागर हुआ, जबकि एचएफडी एसपीएफ चूहों में डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत दिखाया गया । मैक्रोफेजेस और मोनोसाइट्स के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया । कुल मिलाकर, इन परिणामों HFD में अधिक गंभीर यकृत steatosis उजागर चूहों और HFD उजागर और एसपीएफ चूहों के बीच वसा ऊतक में मामूली अंतर की पुष्टि करें ।

सारणी 1 में पैनल 1 में प्रयुक्त एंटीबॉडी को दर्शाया गया है । बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, एनके कोशिकाओं, डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं और granulocytes के extracecullar धुंधला के लिए प्रवाह कोशिका मापन विश्लेषण में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी तालिका 2में चित्रित कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : (1 पैनल) वसा प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण में इस्तेमाल की रणनीति gating के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. सबसे पहले, कोशिकाओं singlets पर gated हैं । फिर, आगे स्कैटर क्षेत्र (FSC-A) और साइड स्कैटर क्षेत्र (एसएससी-A) का उपयोग करके और सही आकार का चयन करके मलबे को छोड़ दिया जाता है । कोशिकाओं को आगे CD45 की अभिव्यक्ति की विशेषता है । व्यवहार्य कोशिकाओं को जीवित का उपयोग कर चयनित कर रहे हैं/एक amine प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई कि गैर perउद्देशित कोशिकाओं रहते हैं, लेकिन समझौता झिल्ली के साथ कोशिकाओं के लिए perउद्देशित है । टी कोशिकाओं साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं में विभाजित थे (सीडी 8+) और टी हेल्पर कोशिकाओं (सीडी 4+) और भोली में subdivided (CD44+CD62L-), केंद्रीय स्मृति (CD44+CD62L+), effector स्मृति (CD44+CD62L- ) और effector (CD44-CD62L+) T कोशिकाओं. अंत में, CD44+ कोशिकाओं KLRG1, CD127 और पीडी-1 पर gated हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : योजना gating के प्रवाह कोशिकामापी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण में प्रयुक्त रणनीति की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (2 पैनल) । द्रुमाकृतिक कोशिकाओं के Gating CD11b और CD11c अभिव्यक्ति पर आधारित था । निंनलिखित अंय आबादी परिभाषित किया गया: बी कोशिकाओं, NK कोशिकाओं, macrophages, monocytes और granulocytes । उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहण के बाद डेटा का विश्लेषण किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रतिनिधि प्रवाह कोशिकामापी का विश्लेषण टी कोशिकाओं का म्यूरिन पेरिकोनोनियल वसा ऊतक और जिगर से अलग । (क) सीडी 4+ और सीडी 8+ T के लिए एसपीएफ़ के तहत रखे गए 7 सप्ताह hfd चूहों से murine यकृत की कोशिकाओं और उजागर शर्तों प्रवाह कोशिका मिति के माध्यम से विश्लेषण किया गया । (ख) 15 सप्ताह hfd एसपीएफ़ के प्रतिनिधि धुंधला और उजागर चूहों । प्रतिरक्षा कोशिकाओं और गुब्बारा हेपैटोसाइट्स की घुसपैठ (अरोहेड) वर्णन नैश । (ग) एसपीएफ के अंतर्गत रखे गए एचएफडी चूहों में ल्यूकोसाइट्स के प्रतिशत के रूप में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रतिशतता और 7 सप्ताह के लिए उजागर स्थितियां n = 6-10 प्रति समूह चूहों । महत्व दो तरह ANOVA एकाधिक माप का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । * * P < 0.01, * * * P < ०.००१ । यह आंकड़ा13से बदला गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: कोशिकाबाह्य अभिरंजक (पैनल 1) के लिए प्रवाह कोशिका मिति में प्रयुक्त एंटीबॉडी. एंटीबॉडी की मात्रा का वर्णन एक नमूने के विश्लेषण के लिए है ।

Table 2
तालिका 2: कोशिकाबाह्य अभिरंजक (पैनल 2) के लिए प्रवाह कोशिका मिति में प्रयुक्त एंटीबॉडी. एंटीबॉडी की मात्रा का वर्णन एक नमूने के विश्लेषण के लिए है ।

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Discussion

Steatohepatitis मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध और डिस्लिपिडेमिया15जैसे चयापचय असामान्यताओं के साथ एक मजबूत संबंध है. कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि वसा ऊतक सूजन प्रकार के रोगजनन ड्राइव कर सकते हैं 2 मधुमेह, दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं के बदल स्तर सहित4,5,16,17 . इसके अलावा, यह पाया गया है कि मोटापा प्रतिरक्षा मार्ग के सक्रियण modulates, जो जिगर जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं18. प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका उपजनसंख्या इंसुलिन प्रतिरोध और steatohepatitis के विकास के लिए एक अलग तरीके में योगदान देता है क्योंकि वसा और जिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में प्रतिरक्षा कोशिका फीनोटाइप के लक्षण वर्णन में एक बढ़ती रुचि है ।

इस विधि कैसे अलग करने के लिए और perigonadal वसा ऊतक और जिगर से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सापेक्ष मात्रा बताना के बारे में विस्तृत जानकारी देता है । इसके अलावा, तरीकों steatohepatitis को प्रेरित करने के क्रम में गैर-एसपीएफ की स्थिति में एचएफडी खिलाया चूहों को बनाए रखने के लिए कैसे दिखा. प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा सेल कार्यों का अध्ययन करने के लिए और एक सूक्ष्म जीववैज्ञानिकी सामान्यीकृत वातावरण में विभिन्न ऊतकों के बीच विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संघों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हमारे वर्तमान अध्ययन में, गैर-एसपीएफ चूहों के HFD खिला इंसुलिन प्रतिरोध और steatohepatitis के विकास के परिणामस्वरूप, जबकि HFD एसपीएफ चूहों इंसुलिन प्रतिरोध विकसित, हल्के यकृत steatohepatitis, लेकिन नहीं steatohepatitis immunohistochemistry रसायन द्वारा निर्धारित के रूप में. इसके अलावा, वसा और जिगर प्रतिरक्षा सेल सबसेट HFD उजागर और एसपीएफ चूहों, जो विभिंन आवास की स्थिति के महत्व के बारे में हमारी समझ की पुष्टि के बीच काफी मतभेद । सारांश में, हम कि सहभोजी वनस्पति के लिए माइक्रोबियल जोखिम C57Bl के प्रतिरक्षाविज्ञानी गुणों को प्रभावित कर सकता दिखा सकता/ पिछले काम से पता चला है कि विविधता और आंत माइक्रोबायोम के समारोह आहार प्रेरित मोटापा19,20 से प्रभावित है और वह आंत बाधा समारोह और आंतों पारगम्यता आवास की स्थिति पर निर्भर21. हम एक आगामी प्रकाशन में आंत उपनिवेशन और वसा और जिगर की सूजन के बीच की कड़ी को संबोधित करने का लक्ष्य ।

प्रस्तावित पद्धतियों के नियोजन स्तर के दौरान कई बिन्दुओं पर विचार किया जाना है । सबसे पहले, एकल कोशिका निलंबन सभी प्रवाह कोशिका मिति के लिए आवश्यक है assays हैं और सेल व्यवहार्यता यांत्रिक ऊतक वियोजन के स्तर और एंजाइमेटिक ऊतक पाचन की अवधि से प्रभावित हो सकता है । आदेश एंटीबॉडी एपिकोप के विनाश से बचने के लिए और कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य की उपज को अधिकतम करने के लिए, असंबद्ध कोशिकाओं, ऊतक के प्रकार, पशु की उम्र, आनुवंशिक संशोधनों, एंजाइमों की सांद्रता, तापमान और ऊष्मायन समय लिया जाना चाहिए ध्यान में रखते हुए ।

दूसरा, हमारे प्रोटोकॉल को मात्रात्मक ऊतक सूजन और steatohepatitis के साथ मोटापे से ग्रस्त hfd फेड चूहों से अलग प्रतिरक्षा सेल फीनोटाइप का निर्धारण करने के लिए अनुकूलित किया गया है । ऊतक अखंडता के रूप में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या और, इस प्रकार, ऊतक पाचन की गुणवत्ता, भड़काऊ प्रक्रियाओं से प्रभावित हो सकता है, प्रोटोकॉल और collagenase इस्तेमाल किया विशिष्ट प्रयोगों में जिगर या वसा ऊतक की तुलना में अन्य ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ऊतक को पचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले विच्छेदन के तरीकों, इनक्यूबेशन्स टाइम्स या कोलेजिनेज़ से संबंधित. तीसरा, यह प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है कि विभिंन प्रयोगात्मक समूहों प्रत्येक दिन के प्रवाह कोशिका मिति परख (तापमान, ऊष्मायन टाइंस, आदि) के दिन के दिन भिन्नता के कारण प्रभाव को समाप्त करने के लिए शामिल किए गए हैं ।

हालांकि, वर्णित विधि की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । क्रम में सकारात्मक बनाम नकारात्मक संकेतों के लिए उचित रूप से परीक्षण के नमूनों में विशिष्ट सतह मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए फाटकों को समायोजित करने के लिए, प्रतिदीप्ति शूंय से एक (FMO) नियंत्रण (एक FMO नियंत्रण में सभी fluorochromes शामिल एक पैनल है कि मापा जा रहा है के लिए छोड़कर) का इस्तेमाल किया गया है चाहिए । इस प्रयोग में डेटा ठीक से मुआवजा और gating हो सकता है स्पष्ट है, लेकिन हम प्रयोगात्मक सेटअप करने के लिए FMO नियंत्रण जोड़ने के लिए, जब भी संभव सलाह देते हैं. इसके अलावा, FoxP3, जो की जरूरत है intracellularly कोशिका झिल्ली के permeabilization की आवश्यकता होती है, के लिए नियामक टी कोशिकाओं मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए था क्योंकि यह CD25 और CD127 (तालिका 2) के उपयोग से अधिक सटीक परिभाषा की अनुमति देता है । यद्यपि प्रवाह कोशिका मिति कई पृष्ठीय मार्करों का एक साथ परिमाणीकरण करने की अनुमति देती है, फिर भी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में अतिव्याप्ति के कारण उनकी संख्या 12 प्रति नमूना तक सीमित है । वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए सही करने के लिए, समय गहन प्रतिदीप्ति क्षतिपूर्ति की आवश्यकता है. इस के लिए खाते के लिए, सामरिक पैनल विकास या मास cytometry तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता है । इसके अलावा, विशिष्ट पशु आवास दिशा-निर्देशों के संबंध में गैर-एसपीएफ स्थितियों में चूहों के आवास में कठिनाइयां पैदा हो सकती हैं, लेकिन गैर-एसपीएफ कृंतकों पर अध्ययन की वर्तमान छोटी संख्या से पता चलता है कि ऐसे अध्ययन संभव हैं12,21 . उदाहरण के लिए, एसपीएफ और गैर-एसपीएफ चूहों के लिए अलग पशु सुविधाओं का मूल्यांकन किया जा सकता है । एक मानव वयस्क की तरह प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास एसपीएफ चूहों12,21में समझौता किया है, जिसके परिणामस्वरूप सीमाओं में नैदानिक अध्ययन करने के लिए पशु प्रयोगों से उपचार रणनीतियों का अनुवाद करने के लिए ।

अंत में, हम मुरीन वसा और यकृत प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लक्षणप्ररूपी लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक आहार में प्रवाह कोशिका मिति का उपयोग-प्रेरित नैश और इंसुलिन प्रतिरोध के पशु मॉडल । जटिल समारोह और मोटापा और चयापचय dysregulation के संदर्भ में दोनों सहज और अनुकूली कोशिकाओं के नियमन पर विचार, हमारे प्रस्तावित तरीकों को चयापचय homeostasis संतुलन के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी तंत्र की हमारी समझ को गहरा करने में मदद करनी चाहिए और, इस प्रकार, विरोधी भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बहाल कर सकते हैं कि मानव चिकित्सा विज्ञान को विकसित करने में मदद. कुल मिलाकर, पशु मॉडल प्रदान की चयापचय जटिलताओं का आकलन करने के लिए एक तेजी से और मजबूत मॉडल के रूप में कार्य करता है मोटापे से जुड़े और अंय रोग मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Anke जुरिश, डायना Woellner, डॉ काथ्रिन विट और Cornelia हेक्मन धंयवाद के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और Biolegend से बेंजामिन Tiburzy गेटिंग रणनीति पर उपयोगी टिप्पणी के लिए सहायता के लिए । जेएसजेएस हेल्महोल्ट्ज ग्रांट (आईसीएमएड) द्वारा समर्थित था । इस अध्ययन के स्वास्थ्य के बर्लिन संस्थान के नैदानिक अनुसंधान इकाई से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (BIH), "BCRT-अनुदान" जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान के मंत्रालय और आइंस्टीन फाउंडेशन द्वारा. के. एस.-बी । और एच-डीवी FOR2165 द्वारा वित्त पोषित हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainers  Falcon 352340
1 mL syringe  BD   309659
26 G x 5/8 needles  BD  305115
35 mm Petri Dishes  Falcon 353001
40 µm cell strainers  Falcon 352340
ACK lysis buffer  GIBCO A1049201
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Biolegend  103127 AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)
Analysis software  FlowJo 10.0.8 software
APC anti-mouse CD11c Antibody Biolegend  117309 AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody Biolegend  138411 AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)
BV421 anti-mouse CD127 Antibody Biolegend  135023 AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)
BV421 anti-mouse F4/80 Antibody Biolegend  123131 AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody Biolegend  135219 AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)
BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody Biolegend  108739 AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)
BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend  101239 AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)
BV711 anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend  103255 AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)
BV785 anti-mouse CD8a Antibody Biolegend  100749 AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old  Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2  Charité - Universitätsmedizin Berlin A119.1 
Collagenase NB 4G Proved Grade  SERVA  11427513
Collagenase Typ I  Worthington  LS004197
Conical centrifuge tube 15mL  Falcon 352096
Conical centrifuge tube 50 mL  Falcon 352070
DNAse   Sigma-Aldrich  4716728001
Fetal bovine serum  Biochrom S0115
Filter 30µm  Celltrics  400422316
FITC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend  100203 AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)
Flow cytometry  BD-LSR Fortessa 
Forceps  Sigma-Aldrich  F4142-1EA
HBSS  Bioanalytic GmBH  085021-0500 
High-fat diet  SSNIF E15741–34  60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates
micro dissecting scissors  Sigma-Aldrich  S3146 used for dissection purposes 
PE anti-mouse CD25 Antibody Biolegend  101903 AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)
PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody Biolegend  104417 AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody Biolegend  107629 AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody Biolegend  100565 AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll solution  Biochrom L6115
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody Biolegend  103031 AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody Biolegend  108427 AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)
Phosphate buffered saline  Gibco 12559069
Round-Bottom Tubes with cell strainer cap STEMCELL Technologies  38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32 Biolegend  101301 AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Trypan Blue  Sigma-Aldrich  T6146
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend  423105 viablity stain 

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References

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Sbierski-Kind, J., Schmidt-Bleek, K., Streitz, M., Kath, J., Spranger, J., Volk, H. D. An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes. J. Vis. Exp. (146), e59470, doi:10.3791/59470 (2019).

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