Summary
דיאטה פשוטה ואמינה המושרה בעלי חיים מכרסם מודל עבור steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש) מתואר, מושגת באמצעות דיור ללא SPF של בעלי חיים וניהול של תזונה מסוימת גבוהה שומן. אנו מתארים זיהוי של תת הכבד והאדיפוז מערכות המשנה של תאים חיסוניים כדי ללכוד את התנאים האימונולוגיים אנושיים על ידי חשיפת עכברים חיידקים סביבתיים.
Abstract
השמנת יתר קשורה לדלקת כרונית בדרגה נמוכה ועמידות לאינסולין, לתרום לשכיחות הולכת וגוברת של מחלות מטבולית כרונית, כגון סוכרת סוג 2 ו steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש). מחקרים שאירעו לאחרונה הקימה כי תאי החיסון הפרו דלקתיים לחדור יפרטרופית שמנים רקמות והכבד. בהינתן החשיבות המתעוררים של תאים חיסוניים בהקשר של הומאוסטזיס מטבולית, יש צורך קריטי לכמת ולאפיין את השינוי שלהם במהלך התפתחות של סוכרת מסוג 2 ו נאש. עם זאת, מודלים בעלי חיים היגרמו לתכונות הפתותולוגיות האופייניות של האדם נאש הם דלילים.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את ערכות המשנה של תאים חיסוניים מבודדים מן הכבד ואת רקמת השומן במודל העכבר האמין של נאש, שהוקמה על ידי הדיור דיאטה גבוהה שומן (HFD) עכברים תחת לא ספציפי הפתוגן ללא מצבים (SPF) תנאים ללא מכשול למשך שבעה שבועות לפחות. אנו להדגים את הטיפול של עכברים בתנאים שאינם SPF, העיכול של רקמות וזיהוי של מקרופאגים, הרוצח הטבעי (NK) תאים, תאים דנדריטים, B ו-T קבוצות ממשנה של תאים על ידי הזרמת cy, לנסות. זרם מייצג cy, לנסות מגרשים מעכברי SPF HFD ועכברים שאינם SPF מסופקים. כדי להשיג נתונים אמינים ומתרגם, שימוש בנוגדנים, שיטות מדויקות ומדויקות לעיכול רקמות והמשך הניסויים הנכונים בזרימה cy, לנסות הם אלמנטים קריטיים.
ההתערבות כדי לשחזר את החשיפה אנטיגן פיזיולוגי בעכברים על ידי דיור אותם בתנאים שאינם SPF וחשיפה לא ספציפית אנטיגנים חיידקים יכול לספק כלי רלוונטי לחקירת הקשר בין שינויים אימונולוגיים, המושרה דיאטה השמנת יתר וסיבוכים הקשורים לטווח ארוך.
Introduction
השמנת יתר היא הפרעה רב עצרת וגורם סיכון מרכזי לפיתוח מחלות לב, שבץ, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש), סוכרת סוג 2 (T2D) וכמה סוגים של סרטן. השכיחות של השמנת יתר הוא גדל במהירות ברחבי העולם. כיום, 2,100,000,000 אנשים – כמעט 30% מאוכלוסיית העולם-הם שמנים או שמנים1. השמנת יתר הקשורות לאינסולין יכול להוביל T2D, כאשר מותש תאי ביתא איון הלבלב לא לפצות על הצורך מוגבר לאינסולין כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז2.
רקמת אדיפוז מורכבת מסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, תאי אנדותל, פיברותקיעות ותאי החיסון. במהלך התקדמות של השמנת יתר, שינויים במספר והפעילות של תאים חיסוניים יכול להוביל דלקת בדרגה נמוכה של יפרטרופית אדיפוז3,4. באופן ספציפי, זה נמצא כי צריכת אנרגיה מוגזמת, מלווה ברמות גבוהות באופן כרוני של גלוקוז בדם, טריגליצרידים וחומצות שומן חינם, מוביל היפוקסיה adipocyte, המתח רשתית העין, לקויי תפקוד מיטוכונדריאלי ו הפרשת ציטוקין משופרת, וכתוצאה מכך הפעלת התאים החיסוניים הפרו-דלקתיים5,6. מחקר בעבר התמקד בעיקר בחסינות מולדת, אבל לאחרונה תאים חיסוניים גמישים (T ו-B תאים) התפתחה כרגולטורים חשובים של הומאוסטזיס גלוקוז. הם בעלי דלקתיות (כולל CD8+ T תאים, Th1, ו B תאים) או בעיקר פונקציות רגולטוריות (כולל הרגולציה T (treg) תאים, Th2 תאים) והוא יכול גם להחמיר או להגן מפני תנגודת לאינסולין7,8 , . בסדר, תשע
יתר על כן, מנגנונים מספר הוצעו כדי להסביר כיצד השמנת יתר מגדילה, כולל ייצור מוגבר של ציטוקינים על ידי האדיפוז רקמה10. נאש, הצורה המתקדמת של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי ונטל בריאות מרכזי במדינות מפותחות, הוא מאופיין באופן היסטולוגית על ידי הבלון בלונים, הצטברות ליפיד, פיברוזיס ודלקת לוצלתית ועשוי להתקדם ל שחמת, בסוף מחלת כבד שלב או סרטן hepatocellular. משטר מספר (למשל מתיונין ותזונה לקויה כולין11) ידועים לגרום נאש כמו מחלות כבד במודלים בעלי חיים לא אנושיים, אבל רוב הגישות הללו לא לכידה של התנאים האנושיים של נאש ואת מטבולית תוצאות כפי שהם דורשים הסתרה גנטית ספציפית, שאינם פיזיולוגיים מניפולציות תזונתיים או חוסר עמידות לאינסולין אופייני של האדם נאש. יתר על כן, ההבנה שלנו של המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבולית מבוססת כיום על ניסויים שבוצעו עם עכברי מעבדה שוכנו תחת תקן הפתוגן הספציפי ללא המחלה (SPF). מתקני מכשול אלה הם היגיינה באופן חריג לא לשקול את החיידקים מגוון בני אדם צריך להיתקל, אשר עשוי להסביר את הקשיים בתהליך התרגום של מחקרי בעלי חיים לגישות קליניות12,13 , . ארבע עשרה
כדי לחקור את ערכות המשנה של התא החיסונית השונים ברקמת השומן והכבד במהלך התפתחות עמידות לאינסולין ונאש במודל עכבר מתקדם לשחזר את התנאים האימונולוגיים אנושיים, עכברים שוכנו בכלובים בודדים בחצי סטרילי תנאים ללא מחסום. עכברים שוכנו תחת התנאים נחשף אנטיגן פיתחה נאש כמו הכבד פתולוגיה כבר אחרי 15 שבועות של דיאטה גבוהה שומן (HFD) האכלה13. בהשוואה לגיל המתאים עכברי SPF הם פיתחו stevesiרומטוזיס, חדירת הכבד הפעלה של תאים חיסוניים.
כתב יד זה מתאר זרימה חזקה cy, לנסות ניתוח להגדיר ולספור את תת הקבוצות של תאים החיסונית של רקמת שומן העכבר והכבד במודל של נאש. הניתוח הסייטונסה לזרום מאפשר זיהוי של פרמטרים מרובים של תאים בודדים בו בניגוד ל-RT-PCR או גישות אימונוהיסטוכימיה.
לסיכום, המחקר שלנו מציע מודל העכבר של HFD לטווח קצר עבור חקירת התפתחות עמידות לאינסולין ו נאש ואת המנגנונים הבסיסיים המוצגים גם נאמנות למצב האנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה נעשה בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים של המוסדות הלאומיים לבריאות וחוק רווחה בעלי חיים תחת פיקוחו של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש. פרוטוקולי בעלי חיים נערכו על פי הנחיות אתיות מוסדיים של הCharité ברלין, גרמניה, ואושרו על-ידי מדינת לנדיסמט והגעה להנחיות הבאות.
1. דיאטה המושרה דגם בעלי חיים של Steatohepatitis
- העברת עכברים (C57Bl/6J, זכר) לדיור שאינו SPF בגיל 4 שבועות ולחשוף אותם ברציפות למגוון רחב של פתוגנים סביבתיים/אנטיגנים. להבטיח את החשיפה על ידי טיפול יומיומי של חיות מעבדה כמו אנטיגנים מופצים על ידי מעבר אוויר בדרך זו.
- לשמור על עכברים (C57Bl/6J, זכר, 12 שבועות) במערכות מערכות פתוחות עם מסננים קונבנציונליים על 12 h:12 h מחזור אור/כהה בטמפרטורה של 22 ° c. אין להקרין או לעשות כנגד דיאטה ומצעים ניסיוניים. גישה למתקן לדיור בעל חיים ללא מסכה או רשת שיער. דלתות פתוחות בין חדרי בעלי חיים. . אל תשתמש במקלחת אוויר
- להבטיח טיפול יומיומי של חיות מעבדה ולהחליף חדרים על בסיס קבוע כך אנטיגנים מופצים על ידי מעבר אוויר. המשלים את הדיור המלוכלך עם חשיפה יומית לא ספציפית של חיידקים לאנטיגנים מתוך מצעים של בעלי חיים מעבדתיים מהחי שוכנו בחדרים ליד עכברי המעבדה.
- למדוד את הפרופורציות של CD44-CD62L- אפקטור זיכרון CD4+ ו CD8+ T תאים בתוך דם וטחול באמצעות זרימה cy try (כפי שמתואר ב refefence13).
הערה: בהקשר זה הגדירו גידול של 20% מהזיכרון CD8+ t תאים מCD8+ t כהוכחה לחשיפה מספקת של חיידקים. - הפעל את HFD (60 kJ% מ-fat, 19 kJ% מחלבונים ו -21 kJ% מפחמימות וצריכת מודעות לlibitum של מים עם 6% סוכרוז תוכן עם העכברים בן חמישה שבועות C57Bl/6J גברים עבור 7-15 שבועות. HFD צריך להכיל 60% kJ משומן (כפי שמתואר לעיל) על מנת לגרום להתפתחות של עמידות לאינסולין במהלך הניסוי.
הערה: יש לבצע את הצביעת המטאוקסילין ומאפיינים היסטלוגיים כמו בלונים, הגופים של מלורי דנק, הסתננות של תאים חיסוניים ומקרוסורומטוזיס להפגין כנגד מחלות הכבד נאש (כפי שמוצג בהתייחסות 13).
2. הכנת ריאגנטים ופתרונות
- הכינו 70% אתנול, מלוחים באגירה פוספט (PBS, ללא סידן ומגנזיום) שיושלם עם 0.5% BSA ו-ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) מאגר לפירוק.
-
צביעת מאגר
- התמוססות 10 מ ל של סרום עגל עוברי (FCS) ב 500 mL של PBS להשיג 2% FCS הPBS. מניחים מאגר הצביעת על קרח לפני השימוש.
- חנות פתרון בבקבוק פלסטיק ב -4 ° c.
-
הפתרון לעיכול הרקמה האדיפוז
- התמוססות 2.5 g של סרום של שור (BSA) ב 500 mL של PBS כדי לקבל 0.5% BSA/PBS.
- התמוססות 74.5 גרם של CaCl2 ב-10 מ"ל של 0.5% bsa/PBS כדי לקבל פתרון 10 MM cacl2 .
- להוסיף 1 מ"ג של הקולגן הסוג השני (ראה טבלת חומרים) לכל mL של 0.5% bsa עם 10 מ"מ cacl2 PBS.
- הכינו 3 מ ל של התמיסה הקולגיראז של הפתרון לכל g של דגימת הרקמה האדיפוז. הכינו את התמיסה הטרייה. בשביל כל בידוד
-
הפתרון לעיכול רקמות הכבד
- לפזר 2.5 g של BSA ב 500 mL של האנק ́s מאוזן תמיסת מלח (HBSS) כדי לקבל 0.5% BSA HBSS.
- הוסף 10 מ ל של FCS ב 500 mL של 0.5% BSA/HBSS כדי לקבל 2% FCS 0.5% BSA/HBSS.
- להוסיף 0.5 mg של הקולגן הסוג הרביעי (ראה טבלת חומרים) על כל mL של 2% fcs 0.5% bsa/HBSS.
- הוסף 0.02 מ"ג של DNase לכל mL של 2% FCS 0.5% BSA/HBSS קולגן הפתרון.
- הכינו 13 מ ל של התמיסה לעכל את הפתרון לכל דגימת רקמת הכבד.
- הכינו את התמיסה הטרייה. בשביל כל בידוד
3. הדור של תא בודד השבולים
-
עיכול רקמת אדיפוז
- . ואחריו פריקה צווארי רסס את החזה עם 70% אתנול. בזהירות לעשות חתך מרכזי 5-6 ס מ דרך קיר הבטן העור לאורך כל החלק של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הלב והלב.
הערה: אין לפגוע באיברים הבסיסיים ולשמור על מספריים מטיפים. - הכנס לפחות 10 מ ל של 0.9% תמיסת מלח בקודקוד החדר השמאלי באמצעות מחט G 26.
הערה: הפרזיה מוצלחת מצוין על ידי שטיפת הכבד. - פתחו את חלל הצפק עם מספריים וחתכו את משטחי השומן הפריגונאל בכל צד עם מספריים מעוגלים עדינים. מנתחים רקמות גונאדאל עם מספריים. מעוגלים ושוקלים רקמת שומן
- בצעו את הדיסוציאציה המכנית באמצעות מספריים וחותכים את רקמת השומן לחתיכות משובחות בצלחת פטרי ב -4 ° c. העבר רקמת האדיפוז ל 50 mL לצינורות צנטריפוגה ולשטוף צלחת פטרי עם 1 מ ל של 0.5% BSA/PBS.
- הוסיפו 3 מ ל של תמיסת אדיפוז (כמוכן בשלב 2.3) לכל גרם של רקמת השומן. מודטת התמיסה ברקמת השומן ב 37 ° c עבור 20 דקות תחת טלטול עדין (200 rpm).
- הוסף 5 מ ל של 0.5% BSA/PBS לגרם של הרקמה האדיפוז והמקום על הקרח. Triturate את הפתרון פעמים רבות עם הצינורות 10 mL סרולוגית ולהעביר אותו דרך מסננת (100 μm) בעזרת בוכנה.
- צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- הסירו את שבר האדיפוציט הצף באמצעות פילטף. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית (סטרומה שבר כלי דם) ב 1 מ ל של מאגר הליזה ACK (ראה טבלת חומרים). הוסף 10 מ ל 2% FCS הערוץ.
- צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- Decant סופר ומשהה מחדש את הגלולה בתא 250 μL של 2% FCS PBS.
- לספור את מספר התאים הפעילים על הטציטומטר באמצעות טריקון כחול הדרה.
- . ואחריו פריקה צווארי רסס את החזה עם 70% אתנול. בזהירות לעשות חתך מרכזי 5-6 ס מ דרך קיר הבטן העור לאורך כל החלק של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הלב והלב.
-
עיכול רקמת הכבד
- לאגור כבד בצינורית צנטריפוגה. מלאה בPBS ובהובלה בקרח
- בצע את הדיסוציאציה המכנית באמצעות חותמות מזרק בצלחת פטרי ב -4 ° c. לשים רקמת הכבד בגזור 50 mL צנטריפוגה שפופרת המכיל 10 מ ל של פתרון לעכל הכבד החום. לשטוף את צלחת פטרי עם 3 מ ל של פתרון לעכל הכבד.
- הפתרון רקמות הכבד של העור ב 37 ° c עבור 20 דקות תחת טלטול עדין (200 rpm).
- הוסף 20 מ ל של HBSS. Triturate את הפתרון פעמים רבות עם הצינורות 10 mL סרולוגית ולהעביר אותו דרך מסננת (100 μm) בעזרת בוכנה.
- צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. והשהה מחדש את הגלולה בתוך 20 מ ל של HBSS.
- צנטריפוגה ב 30 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את המטריצה hepatocyte. . מחק את הגלולה הסלולרית
- צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-500 x g במשך 10 דקות ב -4 ° c. השהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של 33% בצפיפות צמיגות נמוכה של מעבר הצבע (ראה טבלת חומרים) ב-HBSS ואחריו צנטריפוגה (800 x g; 30 דקות; טמפרטורת החדר; ללא בלימה).
- השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר הליזה ACK ו דגירה עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 10 מ ל של HBSS.
הערה: כדי לבטל את הסופרנטנט מזהם את הסופרנטנט עם האינטרפציטים (hepatocytes) בזהירות רבה עם העברת הצנרת (ככל האפשר מבלי לקחת את הגלולה עם תאים חיסוניים אריתרופוציטים). - להעביר תאים באמצעות מסננת 30 יקרומטר ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה החרוו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. Decant סופר ומשהה מחדש את הגלולה בתא 250 μL של 2% FCS PBS.
- לספור את מספר התאים הפעילים על הטציטומטר באמצעות טריקון כחול הדרה.
4. צביעת פני השטח
- הכן לערבב נוגדנים עבור T-cell-קבוצות משנה (פאנל 1) ותאים חיסוניים מולדים (פאנל 2) כפי שמתואר בטבלה 1 ובטבלה 2. אמצעי אחסון ממוטבים עבור מדגם אחד (100 μL) לגבי ריכוזי נוגדנים.
הערה: לימפוציטים תאים חיסוניים מולדים להציג הבדלים באופן אוטומטי, יש לנתח בנפרד. - השתמש עד 3 x 106 תאים ב 100 μl בצינור facs פוליסטירן לצביעת פני השטח. כדי לחסום קולטני Fc להוסיף 10 μL של anti-CD16/CD32 נוגדן (מדולל 1:100) ו דגירה עבור 10 דקות על הקרח. השתמש בדגימת בקרה שלילית שאינה מוכתמת כדי לכוונן את הפיזור הצדדי (הפיקוח העצמי) ופיזור העברה (FSC) כדי לקבוע את המיקום של אוכלוסיית התא השלילית.
- ומערבולת ולהוסיף את הנפח המתאים של תערובת נוגדן פאנל 1 ו-פאנל 2. הוסף 1 μL של צבע הכדאיות לכל מדגם כדי לאפשר אפליה של תאים חיים ומתים. דגירה של 20 דקות ב 4 ° צ' ומוגן מפני אור.
- שטוף פעמיים עם 2 מ ל של 2% FCS PBS ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- השהה מחדש את הגלולה בתא ב-300 μL של 2% FCS PBS ואחסן ב -4 ° c עד ניתוח של FACS.
הערה: לפני התחלת המדידה לעבור תאים דרך 30 יקרומטר תא מסננת לתוך צינור facs ומערבולת. Cy, הזרמת שקעים בוצעה עם התאים המסומנים ב 2% FCS PBS ב 4 ° צ' עבור 1-3 h. יש לנתח תאים בהקדם האפשרי עבור תוצאות ממוטבות.
5. הזרמת הפיצויים, הרכישה והאיסוף
- הפעל מדגם שלילי ללא ויטראז ' כדי להגדיר את FSC ו-אס אס ולהתאים את המתח של cytometer הזרימה כדי לזהות אוכלוסיות leucocyte כדי להבדיל בין פסולת תאים קיימא. לא לכלול פסולת ותאים מתים.
הערה: הכדאיות של השחטות התאים מהכבד עשויה להיות נמוכה יותר מהכדאיות של השעיות התאים מרקמת השומן הפריגונאל עקב צעד נוסף של הפרדת הצפיפות. - הפעל דגימות בקרה ויטראז ' בודדות עבור פיצוי רב-צבעי.
הערה: מחרוזות לכידת נוגדנים יכול לשמש גם כדי להתאים חפיפה ספקטרלי אם מספר התאים של אוכלוסיה באוכלוסייה של עניין הוא נמוך מדי כדי לפצות באמצעות תאים. כדי לזהות אותות בעלי קרינה אוטומטית אפשרית של התאים הפלואורסצנטית פחות אחד (FMO) בקרות עבור כל נוגדן מומלץ אך לא הוחלו בפרוטוקול זה. - הפעל את המדידה, לאסוף את המספר המתאים של אירועים (לפחות 50,000 אירועים) ולהקליט נתונים ניסיוניים.
- יצא קבצי נתוני FCS לניתוח והגדר את אסטרטגיית הפעולה. שער על CD45+ leucocytes לזהות אוכלוסיות התאים הבאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול תיאר מאפשר את האפיון של סמנים פני השטח של תאים חיסוניים מולדים מסתגלת מבודדים מורטין perigonadal הרקמה והכבד במודל של המושרה דיאטה נאש. במודל זה, נאש המושרה על ידי מינהל של HFD פלוס סוכרוז (6%) במים לשתייה במשך 7 עד 15 שבועות בעכברים C57Bl/6J, כפי שדווח בעבר13. חשוב מכך, עכברים היו שוכנו בתנאים סטרילי למחצה, ולכן, חשופים אנטיגנים סביבתיים במהלך הניסוי. עכברים HFD האכיל שוכנו בתנאי SPF ועכברים דיאטה צ'או שוכנו תחת תנאי SPF ושאינם SPF שימשו פקדים. HFD האכלה הביא משקל הגוף משמעותי לצבור כבר לאחר 7 שבועות בשתי הקבוצות. הבדל משמעותי במשקל הגוף היה ברור לראשונה בשבוע 4 (P < 0.001) ונשאר משמעותי במהלך השבועות הבאים ניסיוני. עם זאת, אין הבדלים משמעותיים בעלייה במשקל הוצגו בין עכברים SPF ו-SPF לאחר 7 שבועות13. השבר כלי הדם סטרומה ותאים חיסוניים מרקמת השומן הפריגונאל וכבדים של עכברים זכרים האכילו HFD במשך 7 שבועות היו מבודדים על ידי העיכול קולגן. התאים החיסוניים סומנו עם fluorophore-נוגדנים ראשוניים ופרופורציות העיקרי של תאי T, B תאים, מקרופאגים, תאים NK, תאים דנדריטים ו גרנולוציטים היו בכמת דרך הניתוח cy, לנסות הזרימה. מומחש עבור אוכלוסיות של תאי T, כולל הפליה, וכתמים הכדאיות, ב שומן מורטין perigonadal מאוירים באיור 1. CD45+ leucocytes הם הראשונים מגודרת עבור CD4 ו CD8 ולאחר מכן מגודרת עבור CD44 ו CD62L להפלות בין נאיבי, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטור ותאים T. CD44+ תאים היו אז יותר מאופיין עם CD127, KLRG1 ו PD-1. איור 2 מספק את אסטרטגיית ה, לניתוח תאים B, גרנולוציטים, התאים NK, מקרופאגים ותאים דנדריטים.
התוצאות הייצוגיות של כתמים החילוץ של תאים T בתוך הכבד murine של עכברים חשופים HFD לעומת עכברים HFD SPF מפגינים באיור 3א. אכן, אחוז גבוה יותר של אפקטור זיכרון CD4+ ו CD8+ T תאים ניתן לזהות בעכברים חשופים hfd, ואילו הCD4 הפנימי נאיבי+ ו CD8+ T תאים נמצאו להיות נמוך במידה ניכרת חשוף לעומת עכברים SPF ב שבוע 7 (איור 3א).
כדי לאמת את התוצאות הללו, תגובה דלקתית הכבד הקשורה לחשיפה אנטיגן נחקר על ידי המטאוקסילין/אאוזין כתמים של חלקי הכבד של 15 שבועות עכברים שניזון13. סטרומטוזיס חמורה, כולל גידול של טיפות שומנים גדולות וכתוצאה מכך, דלקת מאקרוסוסיקולזיס, דלקות לובתית, מבנה הבלון הופאותאי והרסו את המבנה הלושתי, נמצאה בעכברים חשופים HFD בעוד כמה עכברי SPF הציגו שומן קל הצטברות בכבד (איור 3ב). כפי שדווח באיור 3C, אחוז התאים החושבים היה גבוה יותר ברקמת השומן הפריגונאל של העכברים החשופים של hfd, ואילו עכברי הגנה מפני SPF הראו אחוזים גבוהים יותר של תאים דנדריטים. לא נמצאו הבדלים משמעותיים עבור מקרופאגים ומונוציטים. בסך הכל, תוצאות אלה מאשרות חמור יותר הכבד שפרומטוזיס בתוך HFD חשופים עכברים והבדלים משניים ברקמת האדיפוז בין HFD חשופים ועכברים SPF.
טבלה 1 מציגה את הנוגדנים הנמצאים בשימוש בלוח 1. נוגדנים המשמשים בניתוח cy, לנסות כתמים מסחטות של תאים B, מקרופאגים, תאים NK, תאים דנדריטים ו גרנולוציטים מתוארים בטבלה 2.
איור 1 : ייצוג סכמטי של האסטרטגיה בשימוש בניתוח צילנטרי של התאים החיסוניים של האדיפוז (פאנל 1). ראשית, התאים מגודרת על הסינגטים. לאחר מכן, הפסולת אינה נכללת באמצעות אזור פיזור קדמי (FSC-A) ואזור פיזור צדדי (המטה-מע-א) ובחירת הגודל הנכון. תאים מאופיינים עוד יותר על-ידי הביטוי של CD45. תאים בר קיימא נבחרו באמצעות סמן בחיים/תא מתים, כי הוא צבע פלורסנט מאמין ומכוון כי הוא לא מיועד להתאים תאים, אבל התכוון לתאים עם ממברנות פרוצים. תאים t חולקו לתאי T ציטוטוקסיים (CD8+) ותאים t-עוזר (CD4+) ומחולקים לתוך נאיבי (CD44+CD62L-), זיכרון מרכזי (CD44+CD62L+), זיכרון אפקטור (CD44+CD62L- ) ואפקטור (CD44-CD62L+) T תאים. לבסוף, CD44+ תאים מגודרת על KLRG1, CD127 ו-PD-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ייצוג סכמטי של האסטרטגיה בשימוש בזרימה cy, ניתוח של שימוש בתאי החיסון (פאנל 2). הCD11b של תאים דנדריטים התבססה על ביטוי CD11c. האוכלוסיות הנוספות הבאות הוגדרו: תאי B, תאי NK, מקרופאגים, מונוציטים וגרנולוציטים. הנתונים נותחו לאחר הרכישה עם התוכנה המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : זרימת הנציג cy, לנסות ניתוח של תאים T מבודדים מורטין שומן רקמת השומן והכבד. (A) CD4+ ו CD8+ T תאים של כבדים murine מ 7 שבוע עכברים hfd המתוחזקות תחת התנאים החשופים ונחשפו באמצעות הזרמת cy, לנסות. (ב) כתמים מייצגים של 15 שבוע SPF ו עכברים חשופים. הסתננות של תאים חיסוניים וכדוריות הברך המרופציטים (ראש חץ) להמחיש נאש. (ג) אחוזי האדיפוז של תאים חיסוניים מולדים כאחוז של לוקיציטים בעכברי hfd הנשמרים תחת SPF או בתנאים חשופים במשך 7 שבועות. n = 6-10 עכברים לכל קבוצה. המשמעות נקבעה באמצעות מדידה מרובה של ANOVA דו-כיוון. נתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. * * P < 0.01, * * * P < 0.001. . הדמות הזאת השתנתה מחדש מהגדר13 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: נוגדנים המשמשים בזרם cy, לצביעת לחילוץ (פאנל 1). כמות הנוגדן שתוארה היא לניתוח של דגימה אחת.
שולחן 2: נוגדנים המשמשים בזרם cy, לצביעת לחילוץ (פאנל 2). כמות הנוגדן שתוארה היא לניתוח של דגימה אחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steatohepatitis יש קשר חזק עם חריגות מטבולית כגון השמנה, עמידות לאינסולין ו דיסליפידמיה15. מחקרים מרובים מצביעים על כך דלקת ברקמת אדיפוז יכול לנהוג בפתוגנזה של סוכרת סוג 2, כולל רמות שונות של תאים הן של המערכת החיסונית מולדת מסתגלת4,5,16,17 . בנוסף, זה כבר נמצא כי השמנת יתר מודולים את ההפעלה של מסלולים החיסונית, אשר יכול להוביל לסיבוכים בכבד18. יש עניין גובר על האפיון של פנוטיפים התא החיסונית של אדיפוז ואת הכבד תגובה דלקתית בגלל כל תא המערכת החיסונית תורמת בדרך שונה להתפתחות של עמידות לאינסולין ו steatohepatitis.
שיטה זו מעניקה מידע מפורט על כיצד לבודד ולכמת כמויות יחסיות של תאים חיסוניים מרקמת השומן הפריגונאדאל והכבד. יתר על כן, השיטות מציגות כיצד לשמור על העכברים הניזונים HFD בתנאים שאינם SPF כדי לגרום steatohepatitis. הפרוטוקול יכול לשמש כדי ללמוד פונקציות תא החיסון ולחקור אסוציאציות של תאים חיסוניים ספציפיים בין רקמות שונות בסביבה המנורמלת מיקרויולוגית.
במחקר הנוכחי שלנו, האכלה HFD של עכברים שאינם SPF הביא לפיתוח של עמידות לאינסולין ו steatohepatitis, ואילו העכברים HFD SPF מתפתח עמידות לאינסולין, מתון הפטיטיס הכבד, אבל לא steatohepatitis שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה. יתר על כן, אדיפוז והכבד מערכות המשנה של התא החיסונית שונה באופן משמעותי בין העכבר החשוף לבין העכברים SPF, אשר מאשרת את הבנתנו את המשמעות של תנאי דיור שונים. לסיכום, אנו יכולים להראות כי החשיפה של חיידקים כדי להיות מסוגל להשפיע על המאפיינים האימונולוגיים של C57Bl/6 עכברים באופן דרמטי. העבודה הקודמת הראו כי גיוון ותפקוד של מיקרובידום המעיים מושפע דיאטה הנגרמת השמנה19,20 וכי תפקוד מכשול המעיים וחדירות המעיים תלויים בתנאי הדיור21. אנו שואפים להתייחס לקשר בין מושבת המעיים לבין האדיפוז ודלקת הכבד בפרסום הקרוב.
יש לשקול מספר נקודות בשלב התכנון של השיטות המוצעות. ראשית, השטיות בתאים בודדים נדרשות עבור כל הזרימה cy, מנסה ויכולת הכדאיות של התא עלולה להיות מושפעת מהרמה של הדיסוציאציה של הרקמה המכנית ומשך העיכול ברקמות אנזימטית. על מנת למנוע את ההרס של אפירופה נוגדן וכלה למקסם את התשואה של התאים הפונקציונלית קיימא, בתאי הנתק, סוג של רקמה, גיל החיה, שינויים גנטיים, ריכוזי אנזימים, הטמפרטורה וזמני דגירה צריך להילקח להתחשב.
שנית, הפרוטוקול שלנו כבר ממוטב כדי כימות לקבוע שונים פנוטיפים תא החיסון מפני עכברים שמנים HFD הניזון עם דלקת ברקמת השומן ו steatohepatitis. כמו שלמות רקמות, מספר התאים החיסוניים, ולכן, האיכות של עיכול רקמות, יכול להיות מושפע תהליכים דלקתיים, הפרוטוקול ואת הקולגן בשימוש צריך להיות אופטימיזציה עבור רקמות אחרות מאשר הכבד או השומן בניסויים ספציפיים הנוגעים לשיטות ניתוח, incubations פעמים או הקולגן השתמשו כדי לעכל את הרקמה. שלישית, חשוב לפרוטוקול שקבוצות נסיוניות שונות נכללות בכל יום כדי למנוע השפעות עקב וריאציה של היום ליום של מכלול הזרימה cy, לנסות (טמפרטורה, הדגירה, וכו ').
עם זאת, קיימות מספר מגבלות חשובות של השיטה המתוארת. על מנת להפלות את האותות חיובי לעומת שלילי כראוי להתאים את השערים כדי לזהות את התאים חיובי עבור סמנים משטח ספציפי בדגימות ניסיוני, זריחה מינוס אחד (FMO) פקדים (בקרת FMO מכיל את כל fluorochromes פאנל, למעט האחד שנמדד) היה צריך להיות בשימוש. בניסוי זה הנתונים יכולים להיות מפוצה כראוי, הזמן היה ברור, אבל אנחנו ממליצים להוסיף בקרת FMO לכיוונון ניסיוני, כאשר אפשרי. יתר על כן, FoxP3, אשר צריך להיות מוכתם intracellularly המחייב חדירות של קרום התא, היה צריך לשמש כדי לכמת תאים T הרגולציה כי זה מאפשר הגדרה מדויקת יותר מאשר השימוש של CD25 ו CD127 (טבלה 2). למרות הזרימה cy, לנסות לאפשר את הקוונפיקציה של כמה סמנים פני השטח בו, המספר שלהם מוגבל 12 לכל מדגם עקב חפיפה ספקטרום פליטה. כדי לתקן חפיפה ספקטרלית, יש צורך בפיצוי על-ידי כמות פלואורסצנטית אינטנסיבית. כדי להסביר את זה, פיתוח הפאנל האסטרטגי או שימוש בטכניקות cy, לנסות המונית נדרש. יתרה מזאת, קשיים עלולים להיווצר בדיור העכברים בתנאים שאינם spf לגבי הנחיות לדיור בעלי חיים ספציפיים, אבל המספר הקטן הנוכחי של מחקרים על מכרסמים שאינם spf מראה כי מחקרים כאלה אפשריים12,21 . לדוגמה, ניתן להעריך מתקני בעלי חיים נפרדים עבור מערכות SPF ועכברים שאינם SPF. התפתחות של מערכת החיסון כמו אדם מבוגר הוא נפרץ בעכברי SPF12,21, וכתוצאה מכך מגבלות לתרגם אסטרטגיות טיפול מניסויים בעלי חיים למחקרים קליניים.
לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאפיון פנוטילי של אדיפוז מורטין ותאי החיסון הכבד באמצעות הזרימה cy, בדגם בעלי החיים המושרה בתזונה של נאש ותנגודת לאינסולין. בהתחשב בתפקוד המורכב והרגולציה של תאים מולדים ומסתגלת בהקשר של השמנת יתר וחוסר מטבולית, שיטות המוצעים שלנו צריך לעזור להעמיק את ההבנה שלנו של מנגנונים אימונולוגיים לאזן הומאוסטזיס מטבולית ולכן, לעזור לפתח therapeutics אנושי שיכול לשחזר תגובות החיסונית אנטי דלקתית. בסך הכל, מודל בעלי חיים שסופקו משמש מודל מהיר ויציב להערכת סיבוכים מטבוליים הקשורים השמנת יתר ניתן להחיל על דגמי מחלות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים Anke Jurisch, דיאנה וולנר, ד ר קתרין וייט ו קורנליה השמאן לקבלת סיוע בהליכים ניסיוניים ובנימין Tiburzy מ Biolegend על הערות מועילות על אסטרטגיית העליה. י. ס. ס. הייתה נתמכת על ידי מענק הלמהולץ (ICEMED). מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהיחידה למחקר קליני של מכון ברלין לבריאות (BIH), "BCRT-גרנט" על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי של המחקר וקרן איינשטיין. K.S.-בי. ו-H.-D.V. ממומנים על ידי FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
