Summary
Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.
Abstract
Fettleibigkeit wird mit chronischen, minderwertigen Entzündungen und Insulinresistenz in Verbindung gebracht, was zu einer zunehmenden Prävalenz chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) beiträgt. Neuere Forschungen haben ergeben, dass entzündungshemmende Immunzellen fettleibiges hypertrophisches Fettgewebe und Leber infiltrieren. Angesichts der sich abzeichnenden Bedeutung von Immunzellen im Zusammenhang mit der metabolischen Homöostase ist es dringend erforderlich, ihre Veränderung bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes und NASH zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tiermodelle, die für die menschliche NASH typische pathophysiologische Merkmale hervorrufen, sind jedoch spärlich.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Immunzellen-Teilmengen zu identifizieren, die von der Leber und dem Fettgewebe isoliert sind, in einem zuverlässigen Mausmodell von NASH, das durch die Unterbringung von fettreichen Diät-Mäusen (HFD) unter unspezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen ohne Sperre für mindestens sieben Wochen. Wir zeigen den Umgang mit Mäusen unter nicht-seften Bedingungen, die Verdauung des Gewebes und die Identifizierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), dendritischen Zellen, B und T-Zell-Untergruppen durch Fließzytometrie. Repräsentative Flow-Zytometrie-Parzellen von SPF-HFD-Mäuse und Nicht-SPF-Mäusen werden zur Verfügung gestellt. Um verlässliche und interpretierbare Daten zu erhalten, sind der Einsatz von Antikörpern, präzisen und präzisen Methoden zur Gewebeverdauung und der richtigen Gattung in Strömungszytometrie-Experimenten entscheidende Elemente.
Der Eingriff zur Wiederherstellung der physiologischen Antigen-Exposition bei Mäusen, indem er sie unter nicht-slawischen Bedingungen unterbringt, und die unspezifische Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen könnten ein relevantes Instrument zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen immunologischen Veränderungen sein, die durch die Ernährung verursacht werden. Fettleibigkeit und damit verbundene Langzeitkomplikationen.
Introduction
Fettleibigkeit ist eine multifaktorielle Erkrankung und ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Herzerkrankungen, Schlaganfall, alkoholfreier Steatohepatitis (NASH), Typ-2-Diabetes (T2D) und einigen Krebsarten. Die Verbreitung von Fettleibigkeit nimmt weltweit rapide zu. Heute sind 2,1 Milliarden Menschen — fast 30% der Weltbevölkerung — entweder fettleibig oder übergewichtig1. Fettleibig-assoziierte Insulinresistenz kann zu T2D führen, wenn erschöpfte Bauchspeicheldrüsen-Beta-Zellen den erhöhten Bedarf an Insulin zur Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase2nicht kompensieren.
Das Fettgewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Adipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und Immunzellen. Während des Fortschritts der Fettleibigkeit können Veränderungen in der Anzahl und Aktivität von Immunzellen zu einer minderwertigen Entzündung des hypertrophischenFettgewebes 3,4führen. Konkret wurde festgestellt, dass eine übermäßige Energieaufnahme, begleitet von chronisch erhöhten Blutzuckerwerten, Triglyceriden und freien Fettsäuren, zu Adipozyten-Hypoxie, endoplasmatischer Retikelstress, beeinträchtigter Mitochondrien-Funktion und Verstärkten die Cytokin-Sekretion, was zur Aktivierung von entzündungshemmenden Fettzellen5,6führt. Die bisherigen Forschungen haben sich vor allem auf die angeborene Immunität konzentriert, aber in jüngerer Zeit haben sich adaptive Immunzellen (T und B-Zellen) als wichtige Regulatoren der Glukose-Homöostase herausgebildet. Sie verfügen über entzündliche Funktionen (einschließlich CD8+ T-Zellen, Th1 und B-Zellen) oder vor allem über regulatorische Funktionen (einschließlich regulatorischer T (Treg) Zellen, Th2-Zellen) und können sowohldie Insulinresistenz von7,8 verschärfen noch schützen. , 9. September
Darüber hinaus wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, um zu erklären, wie Fettleibigkeit die Steatohepatitis erhöht, einschließlich der erhöhten Produktion von Zytokinen durch Fettgewebe 10. NASH, die fortschreitende Form der alkoholfreien Fettlebererkrankung und eine große gesundheitliche Belastung in den Industrieländern, ist histologisch durch aufgeblasene Hepatozyten, Fettansammlungen, Fibrose und pericelluläre Entzündungen gekennzeichnet und kann sich fortentwickeln, um Zirrhose, Lebererkrankung im Endstadium oder hepatokelluläres Karzinom. Mehrere Regimen (zum Beispiel die Methion-und Cholin-Mangelnahrung 11) sind dafür bekannt, dass sie in nicht-menschlichen Tiermodellen eine NASH-ähnliche Leberpathologie hervorrufen, aber die meisten dieser Ansätze rekapitulieren die menschlichen Bedingungen der NASH und ihrer Stoffwechsels nicht. Konsequenzen, da sie entweder einen spezifischen Genknockout, nicht-physiologische Ernährungsmanipulationen oder keine Insulinresistenz erfordern, die typisch für die menschliche NASH ist. Darüber hinaus basiert unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von Stoffwechselerkrankungen derzeit auf Experimenten, die mit Labormäusen durchgeführt werden, die unter den üblichen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht sind. Diese Barriereanlagen sind ungewöhnlich hygienisch und berücksichtigen nicht die mikrobielle Vielfalt, auf die der Mensch stoßen muss, was für Schwierigkeiten im Übersetzungsprozess von Tierstudien zu klinischen Ansätzen 12, 13 verantwortlich sein kann. , 14.
Um die verschiedenen Immunzelluntergruppen in Fettgewebe und Leber bei der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH in einem fortgeschrittenen Mausmodell zu untersuchen, das menschliche Immunbedingungen reproduziert, wurden Mäuse in einzelnen Käfigen in halbsterilen Bedingungen ohne Barriere. Mäuse, die unter Antigen-exponierten Bedingungen untergebracht waren, entwickelten bereits nach 15 Wochen fettreicher Ernährung(HFD) eine NASH-ähnliche Leberpathologie. Im Vergleich zu altersgerechten SPF-Mäusen entwickelten sie makrovesikuläre Steatose, Leberinfiltration und Aktivierung von Immunzellen.
Dieses Manuskript beschreibt eine robuste Strömungszytometrie-Analyse, um Immunzellen-Teilmengen aus dem Fettgewebe und der Leber der Maus in einem Modell von NASH zu definieren und zu zählen. Die Strömungszytometrie-Analyse ermöglicht die Ermittlung mehrerer Parameter einzelner Zellen gleichzeitig im Gegensatz zu RT-PCR oder Immunhistochemie-Ansätzen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studie ein Mausmodell der kurzfristigen HFD zur Untersuchung der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH sowie den zugrundeliegenden Mechanismen bietet, die auch die Treue zum menschlichen Zustand aufweisen.
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Protocol
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der Nationalen Gesundheitsinstitute und des Tierschutzgesetzes unter der Aufsicht unseres institutionellen Tierschutzausschusses durchgeführt. Die Tierprotokolle wurden nach institutionalethischen Richtlinien der Charité Berlin durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales genehmigt und entsprechen den ARRIVE-Richtlinien.
1. Diät-induziertes Tiermodell der Steatohepatitis
- Im Alter von 4 Wochen Mäuse (C57Bl/6J) auf Nicht-SPF-Gehäuse übertragen und kontinuierlich einer breiten Palette von Umweltpathogens-und Antigenen aussetzen. Die Exposition durch den täglichen Umgang mit den Labortieren als Antigene garantieren, wird auf diese Weise durch die Luftpassage verteilt.
- Halten Sie Mäuse (C57Bl/6J, männlich, 12 Wochen alt) in offenen Käfiersystemen mit herkömmlichen Filtern auf einem 12 h hellen/dunklen Zyklus bei einer Temperatur von 22 ° C. Bestrahlen Sie nicht oder autoklavische experimentelle Diät und Bettwäsche. Zugang zu Tierheim ohne Maske oder Haarnetz. Offene Türen zwischen Tierräumen. Keine Luftdusche.
- Garantieren Sie den täglichen Umgang mit den Labortieren und Schalterräumen regelmäßig, so dass Antigene durch die Luftpassage verteilt werden. Ergänzen Sie schmutziges Gehäuse mit täglich unspezifischer mikrobieller Exposition gegenüber Antigenen aus der Bettzeuge von Säugetiertieren, die in den Räumen neben den Labormäusen untergebracht sind.
- Gemessen von den Proportionen von CD44-CD62L- Effektorspeicher CD4 + und CD8+ T-Zellen im Blut und Milz mit Fließzytometrie(wie in der Refefence 13 beschrieben).
NOTE: In diesem Zusammenhang haben wir einen Anstieg der Effektorspeicher CD8+ T-Zellen aus CD8 + T-Zellen um 20% als Beleg für eine ausreichende mikrobielle Exposition definiert. - Start HFD (60 kJ% von Fett, 19 kJ% von Proteinen und 21 kJ% aus Kohlenhydraten und Ad-Libitum-Verbrauch von Wasser mit 6% Saccharose-Gehalt mit fünf Wochen alten C57Bl/6J männlichen Mäusen für 7-15 Wochen. Die HRFD sollte 60% kJ aus Fett enthalten (wie oben beschrieben), um die Entwicklung der Insulinresistenz während des gesamten Experiments zu fördern.
NOTE: Die Hematoxyl-Färbung sollte durchgeführt werden und histologische Merkmale wie Hepatocyte-Ballononing, Mallory-Denk-Körper, Immunzellinfiltration und makroväsikuläre Steatose müssen gefunden werden, um NASH-ähnliche Leberpathologie zu demonstrieren (wie in Bezug auf die Referenz gezeigt 13).
2. Vorbereitung von Reagents und Lösungen
- Bereiten Sie 70% Ethanol, Phosphat-gepuffertes Salz (PBS, ohne Kalzium und Magnesium), ergänzt um 0,5% BSA und ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysepuffer.
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Stauender Puffer
- Lösen Sie 10 ml fetales Kalbsserum (FCS) in 500 ml PBS auf, um 2% FCS PBS zu erhalten. Stellen Sie den Färbepuffer vor dem Gebrauch auf Eis.
- Ladelösung in einer Plastikflasche bei 4 ° C.
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Kollagen-Lösung für Fettgewebe-Verdauung
- Lösen Sie 2,5 g Rinder-Serum Albumin (BSA) in 500 ml PBS auf, um eine 0,5% BSA/PBS zu erhalten.
- Lösen Sie 74.5 g CaCl2 in 10 mL von 0,5% BSA/PBS auf, um eine 10 mM CaCl2-Lösung zu erhalten.
- Fügen Sie 1 mg Kollagenase Typ II (siehe Materialtabelle) zu jedem ml von 0,5% BSA mit 10 mM CaCl2 PBS hinzu.
- Bereiten Sie 3 mL Collagenase Verdauungslösung pro g Fettgewebeprobe. Bereiten Sie für jede Isolierung eine neue Collagenase-Lösung vor.
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Kollagenaulösung für die Verdauung von Lebergewebe
- Lösen Sie 2,5 g BSA in 500 ml Hank ́s Balanced Salt Solution (HBSS), um 0,5% BSA HBSS zu erhalten.
- Fügen Sie 10 ml FCS in 500 mL von 0,5% BSA/HBSS hinzu, um 2% FCS 0,5% BSA/HBSS zu erhalten.
- Fügen Sie 0,5 mg Kollagenase Typ IV (siehe Materialtabelle) zu jedem ml von 2% FCS 0,5% BSA/HBSS hinzu.
- Fügen Sie 0,02 mg DNase pro ml von 2% FCS 0,5% BSA/HBSS Kollagenase-Lösung hinzu.
- Bereiten Sie 13 ml Collagenase Verdauungslösung pro Lebergewebeprobe.
- Bereiten Sie für jede Isolierung eine neue Collagenase-Lösung vor.
3. Generation von Einzelzellensuspensionen
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Fettgewebe-Verdauung
- Die Mäuse mit der Isofluranässeanästhesie mit anschließender Verwerfung mit Mäusen beweihen. Die Brust mit 70% Ethanol besprühen. Machen Sie vorsichtig einen 5-6 cm großen Zentralschnitt durch die integumente und Bauchwand entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs, um die Pleurahöhle und das Herz zu entlarven.
NOTE: Schädigen Sie die zugrunde liegenden Organe nicht und halten Sie die Spitzen der Schere hoch. - Mit einer 26 G-Nadel mindestens 10 ml von 0,9% Salzlösung in die Spitze der linken Herzkammer einspritzen.
NOTE: Eine erfolgreiche Perfusion wird durch Leberblanchieren festgestellt. - Öffnen Sie die Peritonealhöhle mit einer Schere und schneiden Sie die perigonadalen Fettpolster auf jeder Seite mit fein gebogenen Scheren aus. Gonadengewebe mit fein gebogener Schere abschneiden und Fettgewebe wiegen.
- Führen Sie die mechanische Dissoziation mit der Schere durch und schneiden Sie Fettgewebe in einer Petrischale bei 4 ° C in feine Stücke. Das Fettgewebe auf 50 ml konische Zentrifugenröhren übertragen und die Petrischale mit 1 ml von 0,5% BSA/PBS abspülen.
- Fügen Sie 3 ml Fettgewebe-Verdauungslösung (wie in Schritt 2.3 vorbereitet) pro Gramm Fettgewebe hinzu. Inkubate Fettgewebslösung bei 37 ° C für 20 min bei sanftem Schütteln (200 U/min).
- 5 ml von 0,5% BSA/PBS pro Gramm Fettgewebe hinzufügen und auf Eis legen. Die Lösung mehrmals mit einer 10 mL serologischen Pipette verungern und mit Hilfe eines Kolbens durch einen Sieb (100 μm) passieren.
- Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die schwimmende Adipozytenfraktion durch Pipettieren. Das Zellpellet (stromal vascular fraction) wird in 1 mL ACK-Lysepuffer wiederhergestellt (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 10 ml von 2% FCS PBS hinzu.
- Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C.
- Decant supernatant und wiederbelebt Zell-Pellets in 250 μL von 2% FCS PBS.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan blauen Ausschluss.
- Die Mäuse mit der Isofluranässeanästhesie mit anschließender Verwerfung mit Mäusen beweihen. Die Brust mit 70% Ethanol besprühen. Machen Sie vorsichtig einen 5-6 cm großen Zentralschnitt durch die integumente und Bauchwand entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs, um die Pleurahöhle und das Herz zu entlarven.
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Verdauung des Lebergewebes
- Leber in einem konischen Zentrifugenrohr aufbewahren, das mit PBS gefüllt ist und auf Eis transportiert wird.
- Führen Sie die mechanische Dissoziation mit Spritzenstempeln in einer Petrischale bei 4 ° C durch. Lebergewebe in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml warmer Leberverdauungslösung geben. Die Petrischale mit 3 ml Leberverdauungslösung abspülen.
- Inkubate Lebergewebelösung bei 37 ° C für 20 min bei sanftem Schütteln (200 U/min).
- 20 ml HBSS hinzufügen. Die Lösung mehrmals mit einer 10 mL serologischen Pipette verungern und mit Hilfe eines Kolbens durch einen Sieb (100 μm) passieren.
- Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C. Decant den Supernatant und rettet das Zellpellet in 20 ml HBSS wieder.
- Zentrifuge bei 30 x g für 1 min bei Raumtemperatur, um die Hepatocyte-Matrix zu entfernen. Das Zellpellet abwerfen.
- Zentrifuge den Supernatant bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C. Das Pellet in 10 mL mit 33% niedriger Viskositätsdichte gradierender Mittellösung (siehe Materialtabelle) in HBSS wiederbeleben, gefolgt von Zentrifugation ( 800 x g; 30 min; Raumtemperatur; keine Bremse).
- Das Pellet in 1 mL ACK-Lysetepuffer wiederzubeleben und bei Raumtemperatur für 4 min inkubieren. Dann 10 ml HBSS hinzufügen.
NOTE: Um das Supernatante mit Interphase (Hepatozyten) sehr vorsichtig mit einer Transferpipette zu verwerfen (so viel wie möglich, ohne das Pellet mit Immunzellen und Erythrozyten zu nehmen). - Lassen Sie die Zellen durch einen 30-μm-Trog in einem 15 mL konischen Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C. Decant supernatant und wiederbelebt Zell-Pellets in 250 μL von 2% FCS PBS.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan blauen Ausschluss.
4. Oberflächengeständung
- Bereiten Sie eine Antikörper-Mischung für T-Zell-Subsets (Panel 1) und angeborene Immunzellen (Panel 2), wie sie in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben sind. Die Volumes sind für eine Probe (100 μL) hinsichtlich Antikörperkonzentrationen optimiert.
NOTE: Lymphozyten und angeborene Immunzellen stellen Unterschiede in der Autofluoreszenz auf und sollten separat analysiert werden. - Verwenden Sie bis zu 3 x 106 Zellen in 100 μL in einem Polystyrol-FACS-Rohr zur Oberflächenfärbung. Um Fc-Rezeptoren zu blockieren, fügen Sie 10 μL Anti-CD16/CD32-Antikörper (verdünnt 1:100) und Inkubat für 10 Minuten auf Eis. Verwenden Sie eine unbefleckte negative Kontrollprobe, um die Seitenstreuung (SSC) und die Vorwärtsstreuung (FSC) anzupassen, um den Standort der negativen Zellpopulation zu bestimmen.
- Wirbel und das passende Antikörper-Gemisch für Panel 1 und Panel 2 hinzufügen. Fügen Sie jeder Probe 1 μL Viabilitätsfarbe hinzu, um eine Diskriminierung von lebenden und toten Zellen zu ermöglichen. 20 min bei 4 ° C und lichtgeschützt.
- Zwei Mal mit 2 mL von 2% FCS PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 ° C waschen.
- Das Zellpellet in 300 μL von 2% FCS PBS wiederverwenden und bis zur FACS-Analyse bei 4 ° C speichern.
NOTE: Vor dem Start der Messung werden die Zellen durch 30 μm Zell-Trost in das Polystyrol-FACS-Rohr und den Wirbel geleitet. Die Strömungszytometrie wurde mit beschrifteten Zellen durchgeführt, die in 2% FCS PBS bei 4 ° C für 1-3 h gespeichert waren. Zellen sollten so schnell wie möglich auf optimierte Ergebnisse analysiert werden.
5. Flow Cytometry Compensation, Acquisition und Gating
- Führen Sie eine nicht gefärbte negative Kontrollprobe aus, um den FSC und den SSC einzustellen und die Spannungen des Strömungszytometers anzupassen, um Leukozyten-Populationen zu erkennen und zwischen Schmutz und lebensfähigen Zellen zu unterscheiden. Schutt und abgestorbene Zellen ausschließen.
NOTE: Die Durchlässigkeit der Zellsuspensionen aus der Leber könnte geringer sein als die Lebensfähigkeit der Zellsuspensionen aus perigonadalem Fettgewebe aufgrund eines zusätzlichen Dichte-Trennschrittes. - Führen Sie einzelne gebeizte Kontrollmuster für die Mehrfarbenkompensation aus.
NOTE: Antikörper-Erfassungsperlen könnten auch verwendet werden, um sich auf spektrale Überschneidungen einzustellen, wenn die Anzahl der Zellen einer Zellpopulation zu niedrig ist, um die Verwendung von Zellen auszugleichen. Um mögliche Autofluoreszenzsignale der Zellen zu erkennen, werden Fluoreszenzsignale minus eine (FMO)-Steuerung für jeden Antikörper empfohlen, die aber in diesem Protokoll nicht angewendet wurden. - Starten Sie die Messung, sammeln Sie eine angemessene Anzahl von Ereignissen (mindestens 50.000 Ereignisse) und erfassen Sie experimentelle Daten.
- Exportieren Sie FCS-Dateien zur Analyse und setzen Sie die Gating-Strategie. Gate auf CD45+ Leukozyten, um nachfolgende Zellpopulationen zu identifizieren.
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Representative Results
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Oberflächenmarkern angeborener und adaptiver Immunzellen, die von murem perigonadalem Fettgewebe und Leber in einem Modell der Diät-induzierten NASH isoliert sind. Bei diesem Modell wurde NASH durch die Verabreichung von HFD plus Saccharose (6%) induziert. 7 bis 15 Wochen im Trinkwasser in C57Bl/6J Mäuse, wie zuvor berichtet 13. Wichtig ist, dass Mäuse in halbsterilen Bedingungen untergebracht waren und daher während des gesamten Experiments Umweltantigenen ausgesetzt waren. HRFD-gefütterte Mäuse, die unter SPF-Bedingungen untergebracht sind, und Cow-Diät-Mäuse, die unter SPF und Nicht-SPF-Bedingungen untergebracht waren, dienten als Kontrollen. Die HFD-Fütterung führte bereits nach 7 Wochen in beiden Gruppen zu einer signifikanten Körpergewichtszunahme. Ein signifikanter Unterschied im Körpergewicht zeigte sich erstmals in der 4. Woche (P < 0.001) und blieb in den folgenden Experimentalwochen signifikant. Allerdings wurden nach 7 Wochen 13 keine signifikanten Unterschiede in der Gewichtszunahme zwischen SPF und Nicht-SPF-Mäusen gezeigt. Die stromannen Gefäßfraktion und Immunzellen aus perigonadalem Fettgewebe und Leber von männlichen Mäusen, die 7 Wochen lang ein HFD gefüttert hatten, wurden durch die Kollagenase Verdauung isoliert. Immunzellen wurden mit fluorophorkonjugierten primären Antikörpern und Proportionen von T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Granulozyten gekennzeichnet, die mittels Fließzytometrie-Analyse quantifiziert wurden. Das Gating für T-Zell-Subpopulationen, einschließlich zweifelhafter Diskriminierung, und die Färbung von Lebensfähigkeit in murem Perigonadalfett wird in Abbildung1 dargestellt. CD45+ Leukozyten werden zunächst für CD4 und CD8 und anschließend für CD44 und CD62L gated, um zwischen naiven, zentralen Speicher, Effektorspeicher und Effektor-T-Zellen zu unterscheiden. Die CD44+ -Zellen wurden dann mit CD127, KLRG1 und PD-1 weiter charakterisiert. Abbildung 2 liefert die Gating-Strategie zur Analyse von B-Zellen, Granulozyten, NK-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen.
In Abbildung 3 A werden repräsentative Ergebnisse der extrazellulären Färbung von T-Zellen in der Murinleber von HFD-exponierten Mäusen im Vergleich zu HFD SPF-Mäusen nachgewiesen. Tatsächlich kann ein höherer Prozentsatzder Effektorspeicher CD4 + und CD8+ T-Zellen bei HFD-exponierten Mäusen nachgewiesen werden, während intrahepatische naive CD4 + und CD8+ T-Zellen bei der Exposition im Vergleich zu SPF-Mäusen deutlich niedriger waren. Woche 7 (Abbildung 3A).
Um diese Ergebnisse zu validieren, wurde die mit der Antigen-Exposition verbundene hepatische Entzündungsreaktion durch die Färbung von Leberabschnitten von 15 Wochen gefütterten Mäusen 13 untersucht. Schwere Steatose, einschließlich der Zunahme von großen Lipidtröpfchen, die zu makrovesischen Steatose, Lobelie Entzündung, hepatozellulären Ballonfahren und zerstörter Lobelung führen, wurde bei HFD-exponierten Mäusen gefunden, während nur einige SPF-Mäuse ein mildes Fett zeigten Ansammlung in der Leber (Abbildung 3B). Wie in Abbildung3C berichtet, war der Anteil der NK-Zellen im perigonadalen Fettgewebe von HFD-exponierten Mäusen höher, wohingegen HFD SPF-Mäuse einen höheren Anteil an dendritischen Zellen zeigten. Bei Makrophagen und Monozyten wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse eine schwerere Lebersteatose bei HFD-exponierten Mäusen und kleinere Unterschiede im Fettgewebe zwischen HFD-exponierten und SPF-Mäusen.
Tabelle 1 zeigt die Antikörper, die in der Tabelle 1 verwendet werden. Antikörper, die in der Fließzytometrie-Analyse zur extraekularischen Färbung von B-Zellen, Makrophagen, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Granulozyten verwendet werden, sind in Tabelle 2dargestellt.
Bild 1 : Schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Fließzytometrie-Analyse von Fettleibigkeit verwendet wird (Tafel 1). Zuerst werden die Zellen auf Singletten gated. Dann wird Schmutz durch den Einsatz von Vorwärtsstreuungsbereich (FSC-A) und Seitenstreuungsbereich (SSC-A) und die Wahl der richtigen Größe ausgeschlossen. Zellen zeichnen sich zudem durch den Ausdruck von CD45 aus. Die lebensfähigen Zellen werden mit alive/toter Zellmarker ausgewählt, einem Aminreaktionsfarbstoff, der nicht für lebende Zellen bestimmt ist, aber für die Zellen mit kompromittierten Membranen bestimmt ist. T-Zellen wurden in zytotoxische T-Zellen (CD8+) und T-Helfer-Zellen (CD4 +) unterteilt und unterteilt in naive (CD44+CD62L-), Zentralspeicher (CD44 + CD62L +), Effektorspeicher (CD44+CD62L- ) und Effektor (CD44-CD62L+) T-Zellen. Schließlich werden CD44+ -Zellen auf KLRG1, CD127 und PD-1 gated. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2 : Schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Fließzytometrie-Analyse von Fettzellen verwendet wird (Panel 2). Das Gating von dendritischen Zellen basierte auf CD11b und CD11c-Ausdruck. Folgende andere Populationen wurden definiert: B-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen, Monozyten und Granulozyten. Die Daten wurden nach der Erfassung mit der entsprechenden Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3 : Repräsentative Strömungszytometrie-Analyse von T-Zellen, die von murem perigonadalem Fettgewebe und Leber isoliert sind. (A) CD4+ und CD8+ T-Zellen von Murinleber von 7 Wochen HFD-Mäuse, die unter SPF gehalten wurden und exponierte Bedingungen wurden über die Strömungszytometrie analysiert. B) repräsentative Färbung von 15 Wochen HFD SPF und exponierten Mäusen. Die Infiltration von Immunzellen und Ballaststoffen Hepatozyten (Pfeilspitzen) illustriert NASH. C) Anteil von Fettleibigkeit angeborene Immunzellen als Prozentsatz von Leukozyten bei HFD-Mäusen, die unter SPF gehalten werden oder für 7 Wochen exponierte Bedingungen ausgesetzt sind. n = 6-10 Mäuse pro Gruppe. Mit Hilfe der Zwei-Wege-ANOVA-Mehrfachmessung wurde die Bedeutung ermittelt. Die Daten werden als Mittel ± SEM. * * P & lt;0.01, * * * P < 0.001 dargestellt. Diese Zahl wurde von der Refefence13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Antikörper, die in der Strömungszytometrie für die extrazelluläre Färbung verwendet werden (Panel 1). Die beschriebene Antikörper sind für die Analyse einer Probe.
Tabelle 2: Antikörper, die in der Strömungszytometrie für die extrazelluläre Färbung verwendet werden (Panel 2). Die beschriebene Antikörper sind für die Analyse einer Probe.
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Discussion
Die Steatohepatitis hat eine starke Verbindung mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie15. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass eine Fettgewebe-Entzündung die Pathogenese von Typ-2-Diabetes antreiben kann, einschließlich veränderter Zellwerte sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems 4,5,16, 17 . Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Fettleibigkeit die Aktivierung von Immunbahnen moduliert, was zu Leberkomplikationen 18 führenkann. Das Interesse an der Charakterisierung von Immunzellphänotypen bei Fettleibigkeit und Leberentzündungen wächst, da jede Subpopulation der Immunzellen auf andere Weise zur Entwicklung von Insulinresistenz und Steatohepatitis beiträgt.
Diese Methode gibt detaillierte Informationen darüber, wie man relative Mengen von Immunzellen aus perigonadalem Fettgewebe und Leber isolieren und quantifizieren kann. Darüber hinaus zeigen die Methoden, wie HFD gefütterte Mäuse unter nicht-seften Bedingungen zu halten, um Steatohepatitis zu induzieren. Das Protokoll kann verwendet werden, um Immunzellfunktionen zu untersuchen und Verbindungen bestimmter Immunzellen zwischen verschiedenen Geweben in einer mikrobiologisch normalisierten Umgebung zu untersuchen.
In unserer vorliegenden Studie führte die HRFD-Fütterung von nicht-sepF-Mäusen zur Entwicklung von Insulinresistenz und Steatohepatitis, während HFD SPF-Mäuse Insulinresistenz, milde Lebersteatose, aber keine Steatohepatitis entwickelten, wie sie durch die Immunhistochemie bestimmt wurde. Darüber hinaus unterschieden sich Fett-und Leberimmelksuntergruppen signifikant zwischen HFD-exponierten und SPF-Mäusen, was unser Verständnis der Bedeutung der verschiedenen Wohnbedingungen bestätigt. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass die mikrobielle Exposition gegenüber einer Gemeinschaft die immunologischen Eigenschaften von C57Bl/6 Mäuse dramatisch beeinflussen könnte. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Vielfalt und Funktion des Darm-Mikrobioms durch ernährungsbedingte Fettleibigkeit19,20 beeinflusst wird und dass die Darminsperrankfunktion und die Darmdurchlässigkeit vonden Wohnverhältnissen 21 abhängen. Wir wollen in einer kommenden Publikation den Zusammenhang zwischen Darmkolonisation und Fett-und Leberentzündung thematisieren.
Bei der Planung der vorgeschlagenen Methoden sind mehrere Punkte zu beachten. Erstens sind für alle Strömungszytometrie-Assays Einzeller-Suspensionen erforderlich, und die Zelllebensfähigkeit kann durch den Grad der mechanischen Gewebedissoziation und die Dauer der enzymatischen Gewebeverdauung beeinflusst werden. Um die Zerstörung des Antikörper-Ebegitops zu vermeiden und den Ertrag von funktionell lebensfähigen, dissoziierten Zellen, die Art des Gewebes, das Alter des Tieres, genetische Veränderungen, Konzentrationen von Enzymen, Temperatur und Inkubationszeiten zu maximieren, sollten Berücksichtigung.
Zweitens wurde unser Protokoll optimiert, um verschiedene Impakzellenphänotypen von fettleibigen HFD-gefütterten Mäusen mit Fettgewebe-Entzündung und Steatohepatitis quantitativ zu bestimmen. Da die Anzahl der Immunzellen, die Anzahl der Immunzellen und damit die Qualität der Gewebeverdauung, durch entzündliche Prozesse beeinflusst werden könnte, sollte das verwendete Protokoll und die Collagenase für andere Gewebe als Leber-oder Fettgewebe in bestimmten Experimenten optimiert werden. In Bezug auf Dissektionsmethoden, Inkubationszeiten oder die Kollagenase, die zum Verdauen des Gewebes verwendet wird. Drittens ist es für das Protokoll wichtig, dass täglich verschiedene experimentelle Gruppen einbezogen werden, um Effekte durch die tägliche Variation des Strömungszytometrie-Assays (Temperatur, Inkubationszeiten, etc.) zu eliminieren.
Es gibt jedoch einige wichtige Einschränkungen der beschriebenen Methode. Um positive oder negative Signale zu unterscheiden, um die Tore richtig anzupassen, um die Zellen positiv für bestimmte Oberflächenmarker in den experimentellen Proben zu identifizieren, Kontrollen von Fluoreszenz Minus One (FMO) (eine FMO-Steuerung enthält alle Fluorchrome in Es hätte ein Panel verwendet werden müssen, mit Ausnahme des, das gemessen wird. Bei diesem Experiment konnten die Daten richtig kompensiert werden und das Gating war klar, aber wir empfehlen, FMO-Kontrollen, wann immer möglich, in die Versuchsaufstellung einzubauen. Darüber hinaus hätte FoxP3, das intrazelllich befleckt werden muss, um die Durchlässigkeit der Zellmembran zu ermöglichen, zur Quantifizierung regulatorischer T-Zellen verwendet werden müssen, da es eine genauere Definition ermöglicht als die Verwendung von CD25 und CD127 (Tabelle2). Auch wenn die Strömungszytometrie die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Oberflächenmarkierungen ermöglicht, ist ihre Zahl aufgrund von Überschneidungen in Emissionsspektren auf 12 pro Probe begrenzt. Um die Spektralüberlappung zu korrigieren, ist eine zeitintensive Fluoreszenzkompensation erforderlich. Um dies zu berücksichtigen, ist eine strategische Panelentwicklung oder der Einsatz von Massenzytometrie-Techniken erforderlich. Darüber hinaus könnte es zu Schwierigkeiten bei der Unterbringung von Mäusen unter nicht-SPF-Erkrankungen im Hinblick auf bestimmte Tierheimrichtlinien kommen, aber die derzeit geringe Anzahl von Studien über nicht-spfische Nagetiere zeigt, dass solche Studien möglich sind 12, 21 . So könnten beispielsweise getrennte Tieranlagen für SPF und Nicht-SPF-Mäuse bewertet werden. Die Entwicklung eines erwachsenen Immunsystems des Menschen wird bei SPF-Mäusen 12,21beeinträchtigt,waszu Einschränkungen bei der Umsetzung von Behandlungsstrategien aus Tierversuchen in klinische Studien führt.
Abschließend stellen wir ein detailliertes Protokoll zur phänotypischen Charakterisierung von Murinadipose und Leberimm-Zellen mit Fließzytometrie in einem ernährungsinduzierten Tiermodell von NASH und Insulinresistenz zur Verfügung. In Anbetracht der komplexen Funktion und Regulation von angeborenen und adaptiven Zellen im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und metabolischer Dysregulation, sollten unsere vorgeschlagenen Methoden dazu beitragen, unser Verständnis von immunologischen Mechanismen zu vertiefen, um die Stoffwechselhomöostase auszugleichen. Und so helfen, menschliche Therapeutika zu entwickeln, die entzündungshemmende Immunreaktionen wiederherstellen können. Insgesamt dient das mitgelieferte Tiermodell als schnelles und robustes Modell zur Beurteilung von Stoffwechselkomplikationen im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und kann auf andere Krankheitsmodelle angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte und Cornelia Heckmann für die Unterstützung bei experimentellen Verfahren und Benjamin Tiburzy von Biolegend für hilfreiche Kommentare zur Gating-Strategie. J.S. wurde vom Helmholtz Grant (ICEMED) unterstützt. Die Studie wurde durch Stipendien der Klinischen Forschergruppe des Berliner Instituts für Gesundheit (BIH), des "BCRT-Stipendiums" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung und der Einstein-Stiftung unterstützt. K.S.-B. Und H.-D.V. wird von FOR2165 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B.
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
